本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种基质蛋白酶3测定试剂盒。
背景技术：
细胞外基质的降解与许多疾病的发生发展都有重要关系，在影响基质降解的诸多因素中，基质金属蛋白酶（MMPs）起重要作用，是近年来的研究重点。MMPs是一组Zn2+依赖的蛋白酶家族，目前已经发现的就有20多种，根据底物不同可以分为四大类：胶原酶、明胶酶、基质溶解素和模型基质金属蛋白酶。MMPs的主要功能是降解和再塑造细胞外基质，维持细胞外基质的动态平衡，参与人体多种病理和生理过程。诸多研究表明，MMPs参与组织发生、损伤修复、肿瘤浸润及转移、炎症反应、信号传导等过程。其中，基质金属蛋白酶3（MMP-3）可以激活其它MMPs，在MMPs激活过程中起关键作用，是重要的研究对象之一，血清MMP-3水平可以反映多种疾病的严重程度，有重要的临床意义。
MMPs是一组锌离子依赖的蛋白酶家族，包括胶原酶、明胶酶、间质溶解素和膜型基质金属蛋白酶4种类型。目前至少发现20多种MMPs，它们具有相似的结构和功能，共同参与组织发生、损伤修复、炎症反应、信号传导等一系列生理、病理过程。MMP-3又称间质溶解素1、前明胶酶，是MMP家族的重要成员。人类的MMP-3基因定位在染色体11q22.3区，长度约1.8kb。MMP-3在细胞内以前体形式proMMP-3合成，共含有477个氨基酸，分子量约57KDa。MMP-3蛋白的结构可分为氨基末端前肽区、氨基末端催化区以及羧基末端结构域3部分。氨基末端前肽区的前部存在着一个由17个氨基酸残基构成的信号序列，能够引导新和成的MMP-3向细胞膜运动。氨基末端催化区由一个铰链区与氨基末端的前肽区相连，其结构内含有一个锌离子基序，为整个蛋白酶的活性部位。羧基末端结构域氨基酸序列与血红素结合蛋白很相似，是MMP-3与底物相结合的部位。
研究显示，多种细胞在被适当的刺激后，都可以表达MMP-3，如成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞、造骨细胞、角质化细胞等等。机体在3个层面对MMP-3活性进行严格调控。正常情况下MMP-3表达处于很低水平，外界刺激、内环境改变等均可引起MMP-3表达的改变，这些调节发生在转录水平，是机体调节MMP-3的第一个层面。诱导MMP-3分泌的细胞因子和生长因子谱非常广泛如INF-β、INF-γ、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-18、转化生长因子-α、TNF-α等，其中TNF-α是一个非常重要的MMP-3诱导炎性因子，它不仅直接诱导成纤维细胞分泌MMP-3，而且还通过刺激IL-6产生更多的IL-1，IL-1又刺激产生更多的MMP-3。抑制MMP-3表达的因子包括转化生长因子、糖皮质激素等。第二个层面是翻译后修饰，新和成的MMP-3并不具有活性，其催化区内Zn2+与氨基末端一个未配对的半胱氨酸以配位键结合，无法暴露其催化活性，只有这个配位键被纤溶酶原或其他化学物质破坏时，MMP-3才能真正转化为活性形式。组织内存在的金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）是机体调节MMP-3活性的最后一个层面，目前已经发现4中TIMPs，其中TIMP-1能与MMP-3的催化区域结合形成复合物，从而抑制MMP-3的活性。MMP3在体内至少有3种形式，包括MMP-3前体、活性MMP-3和MMP-3/TIMPs复合物。
MMP-3最主要的功能是调节细胞外基质的重建，能降解III、IV、V、IX、X型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖等几乎全部的细胞外基质，并通过水解各种细胞外基质成分激活其他MMPs等多种方式调节细胞的增殖和迁移。目前研究最多的是MMP-3在肿瘤、动脉粥样硬化和关节炎中发挥重要作用。肿瘤，尤其是恶性肿瘤一直是危害人类的健康的重大疾病，恶性肿瘤通过MMP-3降解细胞外基质，降低细胞间的粘附状态，从而使肿瘤细胞易于侵袭迁移，引起肿瘤的转移。研究证实，抑制肿瘤细胞分泌MMP-3后，细胞侵袭和转移能力明显减弱，说明MMP-3与肿瘤浸润转移有关；Zucker和Vacirca在结肠癌组织中发现MMP-3的表达上调促使肿瘤细胞的转移并提示预后不良；张军勇等发现MMP-3在胃癌组织中的表达显著高于正常胃黏膜；黄钢丁等研究表明局部淋巴结转移者MMP-3表达水平明显高于淋巴结未转移者；检测MMP-3血清学水平有助于判断肿瘤的恶性程度及预后，并提示抑制MMP-3表达进行抗肿瘤治疗。MMP-3通过其蛋白水解能力破坏软骨细胞，参与风湿性关节炎以及骨性关节炎的发生，目前临床上常用的指标有血沉（ESR）、类风湿因子（RF）、C反应蛋白（CRP）、抗环瓜氨酸肽（CCP），而MMP-3反映关节软骨的破坏程度，血清MMP-3水平与ESR、RF、CRP均呈正相关，可以作为反映病情活动的有效指标，血清中若出现高水平的MMP-3，提示已经有关节软骨的破坏，应及时治疗。动脉粥样硬化（AS）是心脑血管疾病的病理基础，大量研究发现MMPs参与血管壁重构、斑块破裂、血栓形成等一系列病理生理过程。AS广泛累及大中动脉、造成血管壁硬化与血管腔不同程度的狭窄，相应器官可出现缺血性病变。AS的病理过程主要分为4个阶段：脂纹期、纤维斑块期、粥样斑块期和复合病变期。AS的发生发展是一种涉及多因素、多环节的复杂过程，是由血小管、白细胞、平滑肌细胞等多种细胞和多种因子共同参与的炎症反应过程。MMP-3是MMPs家族在AS斑块中表达的重要成员，广泛存在于AS斑块病变处，能特异性降解细胞外基质大多数成分，如胶原蛋白、蛋白聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、明胶等多种成分，AS斑块中含有大量的巨噬细胞和MMP-3，而巨噬细胞又可以分泌MMP-3，研究证实AS斑块不稳定性的发生与MMP-3的分泌密切相关。在AS起始阶段，MMP-3参与了纤维帽的形成，促进了AS的进展。而MMP-3的过度表达能促进AS斑块的破裂，继而导致血栓形成而堵塞血管，引发严重后果，如急性冠脉综合征（ACS），研究显示，血清MMP-3水平较超敏C反应蛋白（hs-CRP）、MMP-9能更有效地预测稳定型冠心病的远期不良心血管事件发生率是稳定型冠心病独立的预后影响因子，血清MMP-3水平能有效提示ACS患者AS斑块破裂的发生，是ACS的重要血清标志物，对ACS的及时诊断和治疗有重要作用。
另外，最新研究显示MMP-3还能降解阿尔茨海默病患者脑内特征性斑块的主要成分—β淀粉样蛋白（AD）、帕金森病患者（PD）体内异常集聚的α核突触蛋白。在参与中枢神经系统疾病的发生发展时，MMP-3还是一种重要的信号传导分子，神经元在凋亡早期即合成MMP-3释放到细胞外的MMP-3能够激活小胶质细胞，促进小胶质细胞对凋亡神经元的吞噬作用，这种作用有利于清除AD斑块，却加剧了PD患者多巴胺神经元的死亡。研究已经证实MMP-3可以出现在细胞核内，并通过其催化活性诱导细胞凋亡。还有研究显示，MMP-3参与子宫内膜异位症的发生和发展，子宫内膜异位症患者MMP-3水平显著高于健康对照组，MMP-3和TIMP-1的定量检测对子宫内膜异位症的早期诊断有重要意义。国内外研究还表明MMP-3与糖尿病密切相关。
综上所述，MMP-3的功能极其多样化，参与许多疾病的发生发展，定量检测MMP-3水平在临床上有重要意义，有广泛的应用前景。可以预见，基质金属蛋白酶3测定试剂盒（酶联免疫法）将是未来的研究热点。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基质蛋白酶3测定试剂盒，以解决上述技术问题。是以体外定量测定人血浆中的基质蛋白酶3为目的，研发出基质蛋白酶3测定试剂盒（酶联免疫法）的配方。
本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种基质蛋白酶3测定试剂盒，其特征在于，包括：酶标包被板、样本稀释液、洗涤缓冲液、终止液、酶结合物、底物、校准品、质控品；
该试剂盒采用双抗体夹心法，酶标包被板的微孔内包被了MMP-3单克隆抗体，在初次孵育期间，利用样本稀释液稀释血浆中的MMP-3作为抗原物质与固相上包被的MMP-3单克隆抗体结合，形成固相抗体抗原复合物；
利用洗涤缓冲液充分洗涤以除去未结合的成分，加入酶结合物孵育，酶结合物与固相抗体抗原复合物结合；
进一步洗涤，除去未结合的成分，再加入底物孵育，底物被酶催化成为有色产物，再加入终止液以终止反应，通过酶标仪检测各孔光密度值；光密度值的大小与血浆中MMP-3浓度成正相关。
作为优选，所述酶结合物为酶标记的MMP-3单克隆抗体。
作为优选，所述样本稀释液由0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液、0.01mol/L的磷酸氢二钠溶液、0.01mol/L的氯化钠溶液和0.01mol/L的氯化钾溶液组成，pH7.2。
作为优选，所述洗涤缓冲液为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液。
作为优选，所述终止液：2mol/L的H2SO4溶液。
作为优选，所述底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
利用上述试剂盒测定基质蛋白酶3的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）准备工作：将酶标包被板及试剂盒中其他组分在18-25℃平衡约30min，各试剂使用前充分摇匀。将试剂盒中的洗涤缓冲液25mL使用纯化225mL10倍稀释待用。稀释质控品及样本：用样本稀释液390μL按1:40 稀释低值质控品、中值质控品、高值质控品及样本10μL，充分混匀；
（2）加样：加100μL校准品1-6、预稀释低值质控品、中值质控品、高值质控品及样本至相应的孔中，各做两个重复；
（3）孵育：18-25℃条件下，孵育60 min；
（4）洗涤：快速翻转酶标包被板，轻轻倒出反应孔中的溶液，将酶标包被板在吸水纸上倒扣拍干，每孔至少加入300 μL洗涤缓冲液冲洗反应孔，轻轻倒出反应孔中的溶液，倒置于吸水纸上拍干，使反应孔内无肉眼可见的液体和气泡。按上述操作，重复洗涤3次；
（5）加酶结合物：每孔加100μL的酶结合物，18-25℃条件下，孵育60 min；
（6）洗涤：同步骤（5）；
（7）显色：每孔加100μL底物，18-25℃条件下，孵育10 min；
（8）终止反应：每孔加100μL终止液，轻摇酶标板混匀，确保无肉眼可见的气泡，终止反应；
（9）读取吸光度值：酶标仪下450nm下读取光密度值；
（10）计算结果：以校准品1-6 的平均光密度值为纵坐标，以校准品的浓度值为横坐标，使用酶标仪系统软件绘图，使用线性回归拟合绘制校准曲线通过样本光密度值，即可在校准曲线上找到其所对应的样本浓度值。
作为优选，所述样本稀释液由0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液、0.01mol/L的磷酸氢二钠溶液、0.01mol/L的氯化钠溶液和0.01mol/L的氯化钾溶液组成，pH7.2。
作为优选，所述洗涤缓冲液为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液。
作为优选，所述终止液为2mol/L的H2SO4溶液；所述底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
基本原理：
使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：
固相的抗原或抗体
酶标记的抗原或抗体
酶作用的底物。
本发明的有益效果是：
本发明能够体外定量测定人血浆中MMP-3的含量，辅助临床诊断、治疗，是一种新型的免疫测定试剂盒。为医学检验和人类健康贡献出一份力量。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
基质金属蛋白酶3测定盒（酶联免疫法），包括酶标包被板、样本稀释液、洗涤缓冲液、终止液、酶结合物、底物、校准品、质控品。该试剂盒采用双抗体夹心法，酶标板的微孔内包被了MMP-3单克隆抗体，在初次孵育期间，稀释血浆中的MMP-3作为抗原物质与固相上包被的MMP-3单克隆抗体结合，形成固相抗体抗原复合物。充分洗涤以除去未结合的其他成分，加入酶结合物孵育，酶标记的MMP-3单克隆抗体与与固相的抗体抗原复合物结合。进一步洗涤，除去未结合的成分，再加入底物孵育，底物被酶催化成为有色产物，再加入终止液以终止反应，通过酶标仪检测各孔光密度值。光密度值的大小与血浆中MMP-3浓度成正相关。
其中：
样本稀释液：由0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液、0.01mol/L的磷酸氢二钠溶液、0.01mol/L的氯化钠溶液和0.01mol/L的氯化钾溶液组成， pH7.2；
洗涤缓冲液：0.01mol/L Tris-HCl缓冲液；
终止液：2mol/L的H2SO4；
酶结合物：酶标抗人MMP-3抗体；
底物：3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
准备材料
Infinite 50分光光度计、KDC-2046低速冷冻离心机、0.5-50μl、50-200μl、200-1000μl移液器、加样枪头、枸橼酸钠抗凝真空管、EP 管、一次性塑胶手套、试管架。
样本采集
收集并记录完临床资料后，采集外周静脉血4mL，置于枸橼酸钠抗凝真空管内，3000r/min离心5min后分离出血浆备用。
技术路线
（1）准备工作：将酶标包被板及试剂盒中其他组分在18-25℃平衡约30min，各试剂使用前充分摇匀。将试剂盒中的洗涤缓冲液（25mL）使用纯化（225mL）10倍稀释待用。稀释质控品及样本：用样本稀释液（390μL）按1:40 稀释低值质控品、中值质控品、高值质控品及样本（10 μL），充分混匀。
（2）加样：加100 μL校准品1-6、预稀释低值质控品、中值质控品、高值质控品及样本至相应的孔中，各做两个重复。
（3）孵育：18-25℃条件下，孵育60 min。
（4）洗涤：快速翻转酶标包被板，轻轻倒出反应孔中的溶液，将酶标包被板在吸水纸上倒扣拍干，每孔至少加入300 μL洗涤缓冲液冲洗反应孔，轻轻倒出反应孔中的溶液，倒置于吸水纸上拍干，使反应孔内无肉眼可见的液体和气泡。按上述操作，重复洗涤3次。
（5）加酶结合物：每孔加100μL的酶结合物，18-25℃条件下，孵育60 min。
（6）洗涤：同步骤（5）。
（7）显色：每孔加100μL底物，18-25℃条件下，孵育10 min。
（8）终止反应：每孔加100μL终止液，轻摇酶标板混匀，确保无肉眼可见的气泡，终止反应。
（9）读取吸光度值：酶标仪下450nm下读取光密度值。
（10）计算结果：以校准品1-6 的平均光密度值为纵坐标，以校准品的浓度值为横坐标，使用酶标仪系统软件绘图，使用线性回归拟合绘制校准曲线通过样本光密度值，即可在校准曲线上找到其所对应的样本浓度值。
MMP-3可降解胶原蛋白、蛋白聚糖、糖性蛋白、纤连蛋白、明胶等多种成分，还可以激活其它MMPs，在人体多种病理和生理过程中起重要作用。利用研发的MMP-3测定试剂盒检测人血浆中MMP-3的含量，对于临床诊断有重要意义。
(1)MMP-3与肿瘤
肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物，是目前临床上的常见病、多发病。根据新生物的细胞特性及对机体的危害程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，而癌症即为恶性肿瘤的总称，是目前危害人类健康最严重的一类疾病，谈癌色变也正是源于其高致死率。但是癌症并不等于死亡，世界卫生组织已把肿瘤定为慢性病，目前由于医学的发展，肿瘤的治愈率越来越高，并且越早发现，越早治疗，治愈率越高。
恶性肿瘤与良性肿瘤最根本的区别是恶性肿瘤能局部浸润和远处转移，这也是恶性肿瘤致人死亡的主要原因。肿瘤的侵袭与转移是肿瘤与宿主细胞之间相互作用的多步骤、多环节过程，包括肿瘤细胞自原发灶脱落，侵犯周围组织，进入循环系统，在远隔部突破毛细血管形成转移灶，其中新生血管的形成、基膜的破坏及细胞外基质的降解是肿瘤侵袭转移的重要环节。MMPs是一组锌离子依赖性蛋白水解酶，能通过降解细胞外基质、破坏基底膜的完整性，降低细胞间的黏附状态，从而促进肿瘤细胞的浸润与转移。MMP-3又成为基质分解素-1，可以降解构成细胞外基质和基底膜的纤维连接蛋白、黏蛋白、层粘连蛋白等。 目前已有很多相关研究，如Mercapide等发现抑制肿瘤细胞分泌MMP-3后，细胞侵袭和转移能力明显减弱，说明MMP-3与肿瘤浸润转移有关；Zucker和Vacirca在结肠癌组织中发现MMP-3的表达上调促使肿瘤细胞的转移并提示预后不良；张军勇等发现MMP-3在胃癌组织中的表达显著高于正常胃黏膜；黄钢丁等研究表明局部淋巴结转移者MMP-3表达水平明显高于淋巴结未转移者；孙栋等对MMP-3进行了血清学检测，发现胃癌患者术后血清MMP-3水平显著低于术前，并与正常组水平无明显差异，提示检测血清MMP-3水平有助于判断术后肿瘤是否复发，同时发现血清MMP水平与组织MMP-3表达呈一致性，由于测定血清MMP-3水平具有无创伤、操作简便等优点，可以利用测定血清MMP-3水平取代癌组织MMP-3免疫组织化学来判断肿瘤恶性程度及预后。
（2）MMP-3与关节炎
关节炎泛指发生在人体关节及其周围组织的炎性疾病，可分为数十种，我国的关节炎患者有1亿以上，且人数在不断增加。临床表现为关节的红、肿、热、痛、功能障碍及关节畸形，严重者导致关节残疾、影响患者生活质量。研究表明，MMP-3参与机体的炎症反应过程，与关节炎有密切关系。
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，长期以来严重危害人类健康，临床工作中，提示其早期关节破坏和判断病情活动的指标十分有限，不能直接反映类风湿关节炎软骨及骨的破坏程度。MMPs作为一种重要的致病因素，通过直接降解软骨和骨质对关节产生破坏。其中，MMP-3是导致软骨降解的最重要的蛋白酶。RA早期，增生的滑膜组织向关节软骨面生长并侵蚀关节软骨，形成血管翳。血管翳含有大量成纤维细胞，可释放胶原蛋白酶、MMP-3等而引起骨组织的破坏，MMP-3还可由滑膜细胞和软骨细胞分泌。研究发现RA病理组血清MMP-3水平显著高于对照组，早期RA的滑膜处于炎症阶段，主要表现为炎性细胞浸润，患者虽有晨僵、关节疼痛、肿胀、积液或活动受限等表现，但无关节畸形、X线片上受累关节任何结构可无异常，但是此期已有MMP-3的大量分泌。另外，研究证实MMP-3水平与X线分期有关，随MMP-3水平的增高，X线破坏亦越严重，直至骨质融合，MMP-3水平可以反映软骨的破坏程度，可以作为反映RA病情活动的指标。
骨性关节炎（OA）是一种常见的慢性、渐进性、退行性关节病变，可表现为不同程度的关节肿痛、活动受限等症状，以关节软骨和软骨下骨进行性破坏、关节滑模炎症反应为主要病理特征，早期诊断困难，临床上常用的诊断手段往往针对中晚期患者，早期患者作为一个特殊人群，其早期诊断水平对其健康结局的影响更为直接和明显。MMP-3可由软骨细胞、滑膜细胞分泌，尤以滑膜组织为主，研究发现，OA患者血液和关节液中MMP-3显著升高，并且与OA的病变程度成正相关，即MMP-3在OA病程进展中呈稳步增长趋势，这说明MMP-3在OA发生发展过程中具有重要作用。有研究表明，MMP-3参与O软骨严重破坏发生过程，滑膜组织发生炎症反应时MMP-3表达量显著增高且与病变程度呈正相关，过度表达的MMP-3可激活MMP-1、9、13，产生瀑布放大效应，共同降解软骨基质的I型胶原、II型胶原、明胶以及纤维连接蛋白等成分，进而促使关节软骨基质的降解，导致OA的发生。研究证实在诊断早期OA方面，MMP-3是敏感的生物标记物，可以作为OA早期诊断的重要指标。
（3）MMP-3与动脉粥样硬化
动脉粥样硬化（AS）是心脑血管疾病的病理基础，AS斑块的稳定性主要由纤维帽及脂核组成，其中脂核的大小、纤维帽的厚度决定了AS斑块的稳定性，脂核越大、纤维帽越薄斑块就越不稳定，脂核越小、纤维帽越厚斑块就越稳定。大量研究发现，MMPs参与了AS时的血管壁重构、斑块破裂、血栓形成等一系列病理生理过程，根据MMPs水平对AS斑块的稳定性进行综合评估具有肯定意义。MMP-3是MMPs家族在AS斑块中表达的重要成员，广泛存在AS病变处，能特异性降解细胞外基质的大多数成分，同时激活其他MMPs共同降解细胞外基质。AS斑块不稳定性的发生与MMP-3的分泌密切相关，在斑块的关键部位，MMP-3的过度表达能促进AS斑块的破裂，继而导致血栓形成而堵塞血管。研究还发现，血清MMP-3水平的升高预示AS斑块的破裂，是重要的心脑血管疾病的血清标志物，在临床上对心脑血管疾病的及时诊断和治疗有重要意义。
项目风险分析
1、安全特征问题清单
该清单依据YY/T 0316标准的附录C的问题清单，补充了有关基质金属蛋白酶3测定试剂盒（酶联免疫法）的特有的安全性问题。
2、危害分析，包括可预见的事件序列、危害处境和可发生的损害
3、风险评价、风险控制措施记录表
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。