基质蛋白酶3测定试剂盒的制作方法

文档序号:12119431阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基质蛋白酶3测定试剂盒,其特征在于,包括:酶标包被板、样本稀释液、洗涤缓冲液、终止液、酶结合物、底物、校准品、质控品;

该试剂盒采用双抗体夹心法,酶标包被板的微孔内包被了MMP-3单克隆抗体,在初次孵育期间,利用样本稀释液稀释血浆中的MMP-3作为抗原物质与固相上包被的MMP-3单克隆抗体结合,形成固相抗体抗原复合物;

利用洗涤缓冲液充分洗涤以除去未结合的成分,加入酶结合物孵育,酶结合物与固相抗体抗原复合物结合;

进一步洗涤,除去未结合的成分,再加入底物孵育,底物被酶催化成为有色产物,再加入终止液以终止反应,通过酶标仪检测各孔光密度值;光密度值的大小与血浆中MMP-3浓度成正相关。

2.根据权利要求1所述的基质蛋白酶3测定试剂盒,其特征在于:所述酶结合物为酶标记的MMP-3单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的基质蛋白酶3测定试剂盒,其特征在于:所述样本稀释液由0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液、0.01mol/L的磷酸氢二钠溶液、0.01mol/L的氯化钠溶液和0.01mol/L的氯化钾溶液组成,pH7.2。

4.根据权利要求1所述的基质蛋白酶3测定试剂盒,其特征在于:所述洗涤缓冲液为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液。

5.根据权利要求1所述的基质蛋白酶3测定试剂盒,其特征在于:所述终止液:2mol/L的H2SO4溶液。

6.根据权利要求1所述的基质蛋白酶3测定试剂盒,其特征在于:所述底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

7.利用权利要求1所述试剂盒测定基质蛋白酶3的方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)准备工作:将酶标包被板及试剂盒中其他组分在18-25℃平衡约30min,各试剂使用前充分摇匀。将试剂盒中的洗涤缓冲液25mL使用纯化225mL10倍稀释待用。稀释质控品及样本:用样本稀释液390μL按1:40 稀释低值质控品、中值质控品、高值质控品及样本10μL,充分混匀;

(2)加样:加100μL校准品1-6、预稀释低值质控品、中值质控品、高值质控品及样本至相应的孔中,各做两个重复;

(3)孵育:18-25℃条件下,孵育60 min;

(4)洗涤:快速翻转酶标包被板,轻轻倒出反应孔中的溶液,将酶标包被板在吸水纸上倒扣拍干,每孔至少加入300 μL洗涤缓冲液冲洗反应孔,轻轻倒出反应孔中的溶液,倒置于吸水纸上拍干,使反应孔内无肉眼可见的液体和气泡。按上述操作,重复洗涤3次;

(5)加酶结合物:每孔加100μL的酶结合物,18-25℃条件下,孵育60 min;

(6)洗涤:同步骤(5);

(7)显色:每孔加100μL底物,18-25℃条件下,孵育10 min;

(8)终止反应:每孔加100μL终止液,轻摇酶标板混匀,确保无肉眼可见的气泡,终止反应;

(9)读取吸光度值:酶标仪下450nm下读取光密度值;

(10)计算结果:以校准品1-6 的平均光密度值为纵坐标,以校准品的浓度值为横坐标,使用酶标仪系统软件绘图,使用线性回归拟合绘制校准曲线通过样本光密度值,即可在校准曲线上找到其所对应的样本浓度值。

8.根据权利要求7所述的基质蛋白酶3测定试剂盒,其特征在于:所述样本稀释液由0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液、0.01mol/L的磷酸氢二钠溶液、0.01mol/L的氯化钠溶液和0.01mol/L的氯化钾溶液组成,pH7.2。

9.根据权利要求7所述的基质蛋白酶3测定试剂盒,其特征在于:所述洗涤缓冲液为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液。

10.根据权利要求1所述的基质蛋白酶3测定试剂盒,其特征在于:所述终止液为2mol/L的H2SO4溶液;所述底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

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