一种马铃薯病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用与流程

本发明涉及利用免疫层析技术检测植物病毒技术领域，具体涉及一种马铃薯病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用。

背景技术：

马铃薯是我国应用价值较高的经济作物，己被列为我国7大作物之一，也是中国西部最重要的作物品种和主要的支柱型产业，发展势头良好，但目前我国马铃薯单产却远远低于发达国家，马铃薯病毒是造成马铃薯产量低、质量差的主要原因。在中国的医学检验如早孕、乙肝、寄生虫、性病的检验和动物疫病的检验如禽病诊断、家畜疫病、小鼠肝炎病毒、猪旋毛虫病、犬病病毒的诊断中有免疫层析试纸条的应用；在烟草、南瓜、莴苣、黄瓜花叶病毒、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒、烟草脉带病毒、柑橘溃疡病菌、葫芦科病毒、莴苣丛枝植原体的检测中已有免疫层析试纸条的应用，但在马铃薯作物中还没有田间快速检测试纸条的应用。

常规的检测马铃薯病毒的技术是双抗体夹心酶联免疫吸附试验法，该方法需要专门的技术人员在专门的实验室利用专门的设备进行实验，操作过程繁琐，实验时间长：1.5-2天。不能现场取样，现场出结果。目前生产上普遍采用马铃薯脱毒种薯来防治病毒病的危害，为确保马铃薯原原种、原种的脱毒质量，建立快速、准确、灵敏、高效的马铃薯病毒类病毒检测技术是马铃薯种薯生产的关键技术环节。

通过检索发现如下与本专利相关的专利公开文献：

1、公开号为CN 103757138B的专利公开了一种云南马铃薯主栽品种丽薯6号、云薯401、宣薯2号病株中马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒4种病毒的检测方法。本发明通过对云南马铃薯主栽品种丽薯6号、云薯401、宣薯2号病株中马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒4种特异性混合抗体诱捕病样中病毒，不必提取样品总RNA进行随机引物逆转录和特异性病毒引物复合PCR反应。本方法将快速、特异的免疫沉淀与灵敏的复合RT-PCR结合，同时设置健康马铃薯随机引物cDNA产物相应病毒PCR特异片段阳性质粒作为阴、阳性对照，从而快速、准确、灵敏的应用于检测田间马铃薯植株样品、抗病毒材料及田间环境疑似侵染源等方面。

2、公开号为CN 103757138B的专利涉及两步法双重RT一PCR同步检测马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒，三重RT一PCR同步检测马铃薯X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒的方法及检测试剂盒，是专门针对马铃薯产业影响较大的5种马铃薯病毒而建立的一种同步检测2或3种病毒的快速方法，检测时间仅用4h，且灵敏度高、特异性强、稳定可靠。该方法克服了现有对马铃薯病毒病依据症状学的常规诊断方法误判率较高、血清学方法难以检测休眠马铃薯中的病毒及病毒含量较少的韧皮部病毒—马铃薯卷叶病毒等缺点;该方法适用于马铃薯种苗、种薯多种病毒病的早期诊断，对马铃薯种薯质量监测和病毒病预防有着重要的作用。

通过对比，本专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有方法的不足，将马铃薯病毒快速检测试纸条应用到马铃薯病毒检测中，可实现对样品中马铃薯病毒高特异性、高灵敏度、高准确性、高稳定性的检测，快速检测出马铃薯病毒病的发生情况，为马铃薯脱毒薯种薯级别的定级和马铃薯病毒的防控提供理论依据。

本发明的目的之一在于提供一种马铃薯病毒快速检测试纸条，是通过以下技术方案实现的：

一种马铃薯病毒快速检测试纸条，包括样品垫1、金标垫 2、NC膜3、检测线T线4、质控线C线5、吸水垫6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部贴合有NC膜3，所述NC膜3上部两端分别搭接有金标垫2和吸水垫6，所述金标垫2上部搭接有样品垫1，所述检测线T线4设置在靠近样品垫1的NC膜3表面上，所述质控线C线5设置在靠近吸水垫6的NC膜3上，所述检测线T线4上包被有马铃薯病毒兔多克隆抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体溶液划膜浓度为0.5-1.5µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒兔多克隆抗体溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL；所述质控线C线5上包被有马铃薯病毒羊抗兔抗体，所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液划膜浓度为0.5-1.5µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL；所述的金标垫2上结合有马铃薯病毒胶体金标记物，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物溶液喷涂浓度为4-6µL/cm。

而且，马铃薯病毒快速检测试纸条外部还设有卡壳8，所述卡壳8上部表面与样品垫1对应的位置上设有加样孔9，所述卡壳8上部表面与所述NC膜3对应的位置上设有观察槽10。

而且，所述金标垫 2与样品垫1搭接的长度为2-3mm。

而且，所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体、包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体和结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物，可以是以下组合中的任意一种：

组合1：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVX羊抗兔抗体，包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVX兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVX胶体金标记物；

组合2：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVY^NTN羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVY^NTN兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVY^NTN胶体金标记物；

组合3：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVY^o羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVY^o兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVY^o胶体金标记物；

组合4：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PLRV羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PLRV兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PLRV胶体金标记物；

组合5：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVS羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVS兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVS胶体金标记物；

组合6：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVM羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVM兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVM胶体金标记物；

组合7：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVA羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVA兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVA胶体金标记物；

组合8：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是番茄黑环病毒羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是番茄黑环病毒兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是番茄黑环病毒胶体金标记物。

本发明的目的之二是提供一种马铃薯病毒快速检测试纸条的制备方法，是通过以下技术方案实现的：

一种马铃薯病毒快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：金标垫2的制备：

1) 马铃薯病毒胶体金标记物的制备：

用胶体金溶液标记马铃薯病毒兔多克隆抗体，马铃薯病毒兔多克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/mL；

复溶液配方：PH8.0-8.8，8-12%蔗糖，3-6%海藻糖，0.5-2%牛血清白蛋白，溶剂为0.1-0.2moL/L的 Tris-HcL溶液；

胶体金溶液的制备：取297-300 mL超纯水于圆底烧瓶中，加入2-4 mL浓度为1-2%氯金酸溶液，混匀；将圆底烧瓶置于恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾；一次性加入2-4mL、1-2%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；时刻观察溶液颜色变化，由浅黄色→黑色→紫色→紫红色，当变为酒红色时，继续煮沸4-6min后，停止加热，冷却至室温；超纯水做空白对照，扫描胶体金溶液在500-550nm 之间的吸收值，如果吸收峰值在515-525nm出现，则制备的胶体金溶液合格；制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，液面出现油状物和大量黑色颗粒状沉淀物杂质时弃用；最佳胶体金的颜色是红色，形状是圆形；

马铃薯病毒胶体金标记物的制备工艺：取2支离心管，加入1-2mL 胶体金溶液，加入3-5µL 0.1mol/L 的K₂CO₃，再加入4-6uL马铃薯病毒兔多克隆抗体，静置25-35min，再加入80-120µL 封闭剂，静置25-35min,在8000-10000rpm、4℃条件下离心25-35min ，弃上清，加入80-120µL复溶液悬浮沉淀，在400-600rpm、4℃条件下离心10-20min ，吸取上清液，保存备用；

2) 金标垫2与马铃薯病毒胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫的支撑材料，将步骤1)制备的马铃薯病毒胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂马铃薯病毒胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4-6µL /cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥时间2-4h，取出，放入铝箔袋中，180-230℃ 热合封口，保存备用；

步骤2：NC膜3的制备：

检测线T线和质控线C线的制备：用缓冲液稀释待包被马铃薯病毒兔多隆抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将马铃薯病毒兔多隆抗体划膜到距离金标垫1-2cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的浓度划膜于NC膜上，构成检测线T线；用缓冲液稀释待包被马铃薯病毒羊抗兔抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将马铃薯病毒羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫2-3cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜上，构成质控线C线；检测线T线和质控线C线距离4-6mm；将划有检测线T线和质控线C线的NC膜3 置于35-40℃条件下烘干，封装备用；

缓冲液：缓冲液的作用是提供一定pH和离子强度使马铃薯病毒兔多克隆抗体和马铃薯病毒羊抗兔抗体牢固包被于NC膜3上，缓冲液的pH值为7.0~7.4；

步骤3：样品垫1的制备：

选用玻璃纤维膜做为制备样品垫1的材料，玻璃纤维膜经处理后方可使用；

玻璃纤维膜的处理步骤：戴手套，将玻璃纤维膜放入处理液中，完全浸泡，浸泡5-15min,后取出脱水3-5min，平置在筛网上，放入35-40℃干燥箱，烘干至湿度恒定在20-30%，将烘干后的玻璃纤维膜装入铝箔袋热封保存；

处理液的配方：PH7.8-8.0磷酸缓冲液，0.5-1.5%S9表面活性剂溶液，0.4-0.5%吐温20，0.5-1.5%牛血清白蛋白，0.1-0.3%聚乙烯吡咯烷酮溶液，溶剂为水；

步骤4：试纸条的组装：

把步骤1 ~ 3所制作完成材料，根据PVC底板7的规格切割成一定的长度和宽度，粘贴PVC底板7上并安装在卡壳8里；

试纸条的组装步骤：

1）将NC膜3粘贴在PVC底板7上；

2）将金标垫2搭接在NC膜3一端的上方，搭接长度为1-2mm；

3）将吸水垫6搭接在NC膜3另一端的上方，搭接长度为2-3mm；

4）将样品垫1搭接在金标垫2的上方，搭接长度为2-3mm；

5）在斩切机中将粘贴好的PVC底板7剪切成条；

6）剪切成条后装壳并和干燥剂一并装入铝箔袋，密封后贴上标签。

而且，在马铃薯病毒胶体金标记物制备方法步骤中，加入的马铃薯病毒兔多克隆抗体可以是PVX兔多克隆抗体、PVY^NTN兔多克隆抗体、PVY^o兔多克隆抗体、PLRV兔多克隆抗体、PVS兔多克隆抗体、PVM兔多克隆抗体、PVA兔多克隆抗体或番茄黑环病毒兔多克隆抗体中的一种；

如果在马铃薯病毒胶体金标记物制备方法步骤中，加入的是PVX兔多克隆抗体，可制备成PVX胶体金标记物；如果加入的是PVY^NTN兔多克隆抗体，可制备成PVY^NTN胶体金标记物；如果加入的是PVY^o兔多克隆抗体，可制备成PVY^o胶体金标记物；如果加入的是PLRV兔多克隆抗体，可制备成PLRV胶体金标记物;如果加入的是PVS兔多克隆抗体，可制备成PVS胶体金标记物；如果加入的是PVM兔多克隆抗体，可制备成PVM胶体金标记物；如果加入的是PVA兔多克隆抗体，可制备成PVA胶体金标记物；如果加入的是番茄黑环病毒兔多克隆抗体，可制备成番茄黑环病毒胶体金标记物；除了加入马铃薯病毒兔多克隆抗体种类不同外，其他制备工艺参数都一致。

而且，所述马铃薯病毒兔多克隆抗体和马铃薯铃薯病毒羊抗兔抗体的制备方法具体为：

马铃薯病毒兔多克隆抗体的制备：取1-2mL马铃薯病毒兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀马铃薯病毒抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀马铃薯病毒抗体,然后用磷酸缓冲液溶解马铃薯病毒抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得马铃薯病毒兔多克隆抗体；

马铃薯病毒羊抗兔抗体的制备：取1-2mL马铃薯病毒羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀病毒；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀马铃薯病毒抗体,然后用磷酸缓冲液溶解马铃薯病毒抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得马铃薯病毒羊抗兔抗体。

马铃薯病毒兔抗血清制备方法：取1-2ml马铃薯病毒,通过皮下4点注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,总共注射三次；第三次注射一周后,通过耳静脉采血,即得到马铃薯病毒的抗血清。

马铃薯病毒羊抗兔抗血清制备方法：取1-2ml马铃薯病毒免血清抗体，通过皮下4点注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血，即得到羊抗兔抗血清；

而且，所述马铃薯病毒羊抗兔抗体和马铃薯病毒兔多克隆抗体可以选择以下组合中的任意一种组合进行制备；

组合1： PVX羊抗兔抗体，PVX兔多克隆抗体；

组合2： PVY^o羊抗兔抗体， PVY^o兔多克隆抗体；

组合3： PVY^NTN羊抗兔抗体，PVY^NTN兔多克隆抗体；

组合4： PLRV羊抗兔抗体，PLRV兔多克隆抗体；

组合5： PVS羊抗兔抗体， PVS兔多克隆抗体；

组合6： PVM羊抗兔抗体， PVM兔多克隆抗体

组合7： PVA羊抗兔抗体， PVA兔多克隆抗体；

组合8：番茄黑环病毒羊抗兔抗体，番茄黑环病毒兔多克隆抗体；

而且，步骤2：NC膜3的制备中：用来划膜质控线C线的马铃薯病毒羊抗兔抗体和用来划膜检测线T线的马铃薯病毒兔多隆抗体可以选择以下组合中的任意一种：

组合1： PVX羊抗兔抗体，PVX兔多克隆抗体；

组合2： PVY^o羊抗兔抗体， PVY^o兔多克隆抗体；

组合3： PVY^NTN羊抗兔抗体，PVY^NTN兔多克隆抗体；

组合4： PLRV羊抗兔抗体，PLRV兔多克隆抗体；

组合5： PVS羊抗兔抗体， PVS兔多克隆抗体；

组合6： PVM羊抗兔抗体， PVM兔多克隆抗体；

组合7： PVA羊抗兔抗体， PVA兔多克隆抗体；

组合8：番茄黑环病毒羊抗兔抗体，番茄黑环病毒兔多克隆抗体；

本发明的目的之三在于提供一种马铃薯病毒快速检测试纸条的应用方法，是通过以下技术方案实现的：

一种马铃薯快速检测试纸条的应用对待检马铃薯样品进行检测，具体检测步骤为：

(1) 样品处理：取马铃薯叶片，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:8-1:10的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.4-7.8；

(2) 把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫上，静置0.5~3分钟，观察检测线T线和质控线C线；

(3) 结果判读：检测线T线和质控线C线均显现紫红色为阳性；检测线T线不显现紫红色，质控线C线显现紫红色，结果为阴性；检测线T线和质控线C线均不显现紫红色或其他现象，提示试纸条失效。

本发明中：PVX代表马铃薯X病毒， PVY^NTN代表马铃薯Y病毒的NTN株系，PVY^o代表马铃薯Y病毒的O株系，PLRV代表马铃薯卷叶病毒，PVS代表马铃薯S病毒，PVM代表马铃薯M病毒，PVA代表马铃薯A病毒。

本发明的检测原理： 选用胶体金标记马铃薯病毒兔多克隆抗体制得马铃薯病毒胶体金标记物，喷涂在金标垫上；在检测线T线上包被能与目的物蛋白复合物发生免疫反应的马铃薯病毒兔多克隆抗体，在质控线C线上包被马铃薯病毒羊抗兔抗体，作为指示线。当把待检样品加样到样品垫上后，样品中马铃薯病毒蛋白与金标垫上的马铃薯病毒胶体金标记物形成免疫复合物，由于毛细管效应，该复合物向吸水垫方向泳动，此复合物与包被在检测线T线上的马铃薯病毒兔多克隆抗体发生特异性免疫结合反应，形成马铃薯病毒胶体金标记物、抗原（抗原是指马铃薯病毒）、马铃薯病毒兔多克隆抗体三联体复合物而被截留在检测线T线上，逐渐富集形成较深的紫红色线；由于毛细效应继续泳动向前，马铃薯病毒胶体金标记物与包被在质控线C线上的马铃薯病毒羊抗兔抗体发生特异性的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线C线上形成较深的紫红色线，多余的未结合的物质继续层析到吸水垫上，因此在检测线T线和质控线C线都出现紫红色线的判为阳性结果；若样品中不含有马铃薯病毒，马铃薯病毒胶体金标记物到达检测线T线时，不与包被在检测线T线上的马铃薯病毒兔多克隆抗体发生免疫反应，因此在检测线T线处没有出现显色线，而马铃薯病毒胶体金标记物继续向前泳动与包被在质控线C线上的马铃薯病毒羊抗兔抗体发生特异的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线上形成紫红色线，因此仅在质控上出现紫红线判为阴性结果。检测线T线和质控线C线均不显现紫红色线或出现其他现象，提示试纸条失效，检测失败。

本发明的有益效果：

（1）本发明首次将免疫层析技术应用于马铃薯病毒病检测，实现了高特异性、高灵敏的检测性能。

（1）本发明使用方便、适用性强：无需实验室、不需要任何特殊仪器、无需专业人员操作培训、田间地头、马铃薯贮藏窖、海关等任何有马铃薯的地方即可测试，每个马铃薯种植者均会使用。

（2）本发明检测时间短，仅需0.5—3分钟即可得出检测结果。

（3）本发明灵敏度高：一片马铃薯叶子样品即可用于检测，试纸条检测马铃薯样品的马铃薯病毒最低检测浓度为1ng/mL。

（4）本发明准确性高：该试纸条检测马铃薯样品的准确率与双抗体夹心酶联免疫吸附实验法的准确率完全吻合，符合率达100%。

（5）本发明特异性强：马铃薯一病毒的试纸条仅该种病毒阳性材料检测线及质控线均出现明显条带，其他阳性材料仅质控线出现紫红色线，检测线未出现紫红色线；马铃薯病毒的检测试纸条，对健康植株和缓冲液对照的检测结果，仅C线出现紫红色线，T线未出现紫红色线色，结果是阴性，因此本试纸条具有特异性。

（6）本发明稳定性强：将试纸条放在内放干燥剂的密封铝箔袋中，室温和37℃下保存长时间后颜色略减弱，其他不同温度、不同时间的测试结果无明显变化，说明在适当条件下保存，本试纸条具有较好的稳定性。

（7）本发明检测成本低；对温度无特殊需求，无须冷冻，储存运输方便，室温可保存24个月。

附图说明

图1本发明主视图（未画卡壳）；

图2为图1左视图；

图3本发明卡壳结构示意图；

图4中为阳性结果示意图；

图5中为阴性结果示意图；

图6中为试纸条失效示意图。

图中：1样品垫，2金标垫，3NC膜，4检测线T线，5质控线C线，6吸水垫，7PVC底板，8卡壳，9加样孔，10观察槽。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种马铃薯病毒快速检测试纸条，如图1、图2所示，包括样品垫1、金标垫 2、NC膜3、检测线T线4、质控线C线5、吸水垫6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部贴合有NC膜3，所述NC膜3上部两端分别搭接有金标垫2和吸水垫6，所述金标垫2上部搭接有样品垫1，所述检测线T线4设置在靠近样品垫1的NC膜3表面上，所述质控线C线5设置在靠近吸水垫6的NC膜3上，所述检测线T线4上包被有马铃薯病毒兔多克隆抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体溶液划膜浓度为0.5µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒兔多克隆抗体溶液的浓度为0.5mg/mL；所述质控线C线5上包被有马铃薯病毒羊抗兔抗体，所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液划膜浓度为0.5µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液的浓度为0.5mg/mL；所述的金标垫2上结合有马铃薯病毒胶体金标记物，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物溶液喷涂浓度为4µL/cm。

本实施例中，如图3所示，马铃薯病毒快速检测试纸条外部还设有卡壳8，所述卡壳8上部表面与样品垫1对应的位置上设有加样孔9，所述卡壳8上部表面与所述NC膜3对应的位置上设有观察槽10。

本实施例中，所述NC膜3与金标垫 2搭接的长度为1mm，所述NC膜3与吸水垫6 搭接的长度为2mm，所述金标垫 2与样品垫1 搭接的长度为2mm。

本实施例中，所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体、包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体和包被在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物，可以是以下组合中的任意一种：

组合1：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVX羊抗兔抗体，包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVX兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVX胶体金标记物；

组合2：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVY^o羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVY^o兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVY^o胶体金标记物；

组和3： 所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVY^NTN羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVY^NTN兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVY^NTN胶体金标记物；

组合4：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PLRV羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PLRV兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PLRV胶体金标记物；

组合5：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVS羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVS兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVS胶体金标记物；

组合6：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVM羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVM兔多克隆抗体，所述结合在金标垫(2)上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVM胶体金标记物；

组合7：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVA羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVA兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVA胶体金标记物；

组合8：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是番茄黑环病毒羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是番茄黑环病毒兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是番茄黑环病毒胶体金标记物。

实施例2

一种马铃薯病毒快速检测试纸条，如图1、图2所示，包括样品垫1、金标垫 2、NC膜3、检测线T线4、质控线C线5、吸水垫6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部贴合有NC膜3，所述NC膜3上部两端分别搭接有金标垫2和吸水垫6，所述金标垫2上部搭接有样品垫1，所述检测线T线4设置在靠近样品垫1的NC膜3表面上，所述质控线C线5设置在靠近吸水垫6的NC膜3上，所述检测线T线4上包被有马铃薯病毒兔多克隆抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体溶液划膜浓度为1µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒兔多克隆抗体溶液的浓度为1mg/mL；所述质控线C线5上包被有马铃薯病毒羊抗兔抗体，所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液划膜浓度为1µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液的浓度为1mg/mL；所述的金标垫2上结合有马铃薯病毒胶体金标记物，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物溶液喷涂浓度为5µL/cm。

本实施例中，如图3所示，马铃薯病毒快速检测试纸条外部还设有卡壳8，所述卡壳8上部表面与样品垫1对应的位置上设有加样孔9，所述卡壳8上部表面与所述NC膜3对应的位置上设有观察槽10。

本实施例中，所述NC膜3与金标垫 2搭接的长度为1.5mm，所述NC膜3与吸水垫6 搭接的长度为2.5mm，所述金标垫 2与样品垫1 搭接的长度为2.5mm。

本实施例中，所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体、包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体和包被在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物，可以是实施例1中8种组合中的任意一种。

实施例3

一种马铃薯病毒快速检测试纸条，如图1、图2所示，包括样品垫1、金标垫 2、NC膜3、检测线T线4、质控线C线5、吸水垫6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部贴合有NC膜3，所述NC膜3上部两端分别搭接有金标垫2和吸水垫6，所述金标垫2上部搭接有样品垫1，所述检测线T线4设置在靠近样品垫1的NC膜3表面上，所述质控线C线5设置在靠近吸水垫6的NC膜3上，所述检测线T线4上包被有马铃薯病毒兔多克隆抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体溶液划膜浓度为1.5µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒兔多克隆抗体溶液的浓度为1.5mg/mL；所述质控线C线5上包被有马铃薯病毒羊抗兔抗体，所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液划膜浓度为1.5µL/cm，所述用来进行划膜的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液的浓度为1.5mg/mL；所述的金标垫2上结合有马铃薯病毒胶体金标记物，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物溶液喷涂浓度为6µL/cm。

本实施例中，如图3所示，马铃薯病毒快速检测试纸条外部还设有卡壳8，所述卡壳8上部表面与样品垫1对应的位置上设有加样孔9，所述卡壳8上部表面与所述NC膜3对应的位置上设有观察槽10。

本实施例中，所述NC膜3与金标垫 2搭接的长度为2mm，所述NC膜3与吸水垫6 搭接的长度为3mm，所述金标垫 2与样品垫1 搭接的长度为3mm。

本实施例中，所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体、包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体和包被在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物，可以是实施例1中8种组合中的任意一种。

实施例4

一种马铃薯病毒快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：金标垫2的制备：

1) PVX胶体金标记物的制备：

用胶体金溶液标记PVX兔多克隆抗体，PVX兔多克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/mL；

复溶液配方：PH8.0-8.8，8-12%蔗糖，3-6%海藻糖，0.5-2%牛血清白蛋白，溶剂为0.1-0.2mol/L的 Tris-Hcl溶液；

胶体金溶液的制备：取297-300 mL超纯水于圆底烧瓶中，加入2-4 mL浓度为1-2%氯金酸溶液，混匀；将圆底烧瓶置于恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾；一次性加入2-4mL、1-2%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；时刻观察溶液颜色变化，由浅黄色→黑色→紫色→紫红色，当变为酒红色时，继续煮沸4-6min后，停止加热，冷却至室温；超纯水做空白对照，扫描胶体金溶液在500-550nm 之间的吸收值，如果吸收峰值在515-525nm出现，则制备的胶体金溶液合格；制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，液面出现油状物和大量黑色颗粒状沉淀物杂质时弃用；最佳胶体金的颜色是红色，形状是圆形；

PVX胶体金标记物的制备工艺：取2支离心管，加入1-2mL 胶体金溶液，加入3-5µL 0.1mol/L 的K₂CO₃，再加入4-6µLPVX兔多克隆抗体，静置25-35min，再加入80-120µl 封闭剂，静置25-35min,在8000-10000rpm、4℃条件下离心25-35min ，弃上清，加入80-120µL复溶液悬浮沉淀，在400-600rpm、4℃条件下离心10-20min ，吸取上清液，保存备用；

2) 金标垫2与PVX胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫的支撑材料，将步骤1)制备的PVX胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂胶体金标记物的喷涂浓度为4-6µL /cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥时间2-4h，取出，放入铝箔袋中，180-230℃ 热合封口，保存备用；

步骤2：NC膜3的制备：

检测线T线和质控线C线的制备：用缓冲液稀释待包被PVX兔多隆抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVX兔多隆抗体划膜到距离金标垫1-2cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的浓度划膜于NC膜上，构成检测线T线；用缓冲液稀释待包被PVX羊抗兔抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVX羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫2-3cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜上，构成质控线C线；检测线T线和质控线C线距离4-6mm；将划有检测线T线和质控线C线的NC膜3)置于35-40℃条件下烘干，封装备用；

缓冲液：缓冲液的作用是提供一定pH和离子强度使PVX兔多克隆抗体和PVX羊抗兔抗体牢固包被于NC膜上，缓冲液的pH值为7.0~7.4；

步骤3：样品垫1的制备：

选用玻璃纤维膜做为制备样品垫1的材料，玻璃纤维膜经处理后方可使用；

玻璃纤维膜的处理步骤：戴手套，将玻璃纤维膜放入处理液中，完全浸泡，浸泡5-15min,后取出脱水3-5min，平置在筛网上，放入35-40℃干燥箱，烘干至湿度恒定在20-30左右，将烘干后的玻璃纤维膜装入铝箔袋热封保存；

处理液的配方：PH7.8-8.0磷酸缓冲液，0.5-1.5%S9表面活性剂溶液，0.4-0.5%吐温20，0.5-1.5%牛血清白蛋白，0.1-0.3%聚乙烯吡咯烷酮溶液，溶剂为水；

步骤4：试纸条的组装

把步骤1 ~ 3所制作完成材料，根据PVC底板7的规格切割成一定的长度和宽度，粘贴PVC底板7上并安装在卡壳8里；

试纸条的组装步骤：

1）将NC膜3粘贴在PVC底板7上；

2）将金标垫2搭接在NC膜3一端的上方，搭接长度为1-2mm；

3）将吸水垫6搭接在NC膜3另一端的上方，搭接长度为2-3mm；

4）将样品垫1搭接在金标垫2的上方，搭接长度为2-3mm；

5）在斩切机中将粘贴好的PVC底板7剪切成条；

6）剪切成条后装壳并和干燥剂一并装入铝箔袋，密封后贴上标签。

本实施例中，所述PVX兔多克隆抗体和PVX羊抗兔抗体的制备方法具体为：

PVX多克隆抗体的制备：取1-2mLPVX兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVX抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVX抗体,再用磷酸缓冲液溶解PVX抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVX兔多克隆抗体。

PVX羊抗兔抗体的制备：取1-2mLPVX羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVX抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVX抗体,然后用磷酸缓冲液溶解PVX抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVX羊抗兔抗体。

PVX兔抗血清的制备方法：取2mLPVX,通过皮下4点注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血,即得到PVX的抗血清。

PVX羊抗兔抗血清的制备方法：取2mLPVX兔血清抗体，通过皮下4点注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血，即得到PVX羊抗兔抗血清。

实施例5

一种马铃薯病毒快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：金标垫2的制备：

1) PVY^o胶体金标记物的制备：

用胶体金溶液标记PVY^o兔多克隆抗体，PVY^o兔多克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/mL；

复溶液配方和胶体金溶液的制备同实施例4；

PVY^o胶体金标记物的制备工艺：取2支离心管，加入1-2mL 胶体金溶液，加入3-5µL 0.1mol/L 的K₂CO₃，再加入4-6µLPVY^o兔多克隆抗体，静置25-35min，再加入80-120µL 封闭剂，静置25-35min,在8000-10000rpm、4℃条件下离心25-35min ，弃上清，加入80-120µL复溶液悬浮沉淀，在400-600rpm、4℃条件下离心10-20min ，吸取上清液，保存备用；

2) 金标垫2与PVY^o胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫的支撑材料，将步骤1)制备的PVY^o胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂PVY^o胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4-6µL /cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥时间2-4h，取出，放入铝箔袋中，180-230℃ 热合封口，保存备用；

步骤2：NC膜3的制备：

检测线T线和质控线C线的制备：用缓冲液稀释待包被PVY^o兔多隆抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVY^o兔多隆抗体划膜到距离金标垫1-2cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的浓度划膜于NC膜上，构成检测线T线；用缓冲液稀释待包被PVY^o羊抗兔抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVY^o羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫2-3cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜上，构成质控线C线；检测线T线和质控线C线距离4-6mm；将划有检测线T线和质控线C线的NC膜3置于35-40℃条件下烘干，封装备用；

步骤3：样品垫1的制备：同实施例4

步骤4：试纸条的组装：同实施例4

本实施例中，所述PVY^o兔多克隆抗体和PVY^o羊抗兔抗体的制备方法具体为：

PVY^o多克隆抗体的制备：取1-2mLPVY^o兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVY^o抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVY^o抗体,再用磷酸缓冲液溶解PVY^o抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVY^o兔多克隆抗体；

PVY^o羊抗兔抗体的制备：取1-2mLPVY^o羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVY^o抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVY^o抗体,然后用磷酸缓冲液溶解PVY^o抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVY^o羊抗兔抗体；

PVY^o兔抗血清的制备方法：取2mLPVY^o,通过皮下4点注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血,即得到PVY^o的抗血清；

PVY^o羊抗兔抗血清的制备方法：取2mLPVY^o兔血清抗体，通过皮下4点注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血，即得到PVY^o羊抗兔抗血清。

实施例6

一种马铃薯病毒快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：金标垫2的制备：

1)PVY^NTN胶体金标记物的制备：

用胶体金溶液标记PVY^NTN兔多克隆抗体，PVY^NTN兔多克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/mL；

复溶液配方和胶体金溶液的制备同实施例4；

PVY^NTN胶体金标记物的制备工艺：取2支离心管，加入1-2mL 胶体金溶液，加入3-5µL 0.1mol/L 的K₂CO₃，再加入4-6µL PVY^NTN兔多克隆抗体，25-35min，再加入80-120µL 封闭剂，静置25-35min,在8000-10000rpm、4℃条件下离心25-35min ，弃上清，加入80-120µL复溶液悬浮沉淀，在400-600rpm、4℃条件下离心10-20min ，吸取上清液，保存备用；

2) 金标垫2与PVY^NTN胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫的支撑材料，将步骤1)制备的PVY^NTN胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂PVY^NTN胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4-6µL /cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥时间2-4h，取出，放入铝箔袋中，180-230℃ 热合封口，保存备用；

步骤2：NC膜3的制备：

检测线T线和质控线C线的制备：用缓冲液稀释待包被PVY^NTN兔多隆抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVY^NTN兔多隆抗体划膜到距离金标垫1-2cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的浓度划膜于NC膜上，构成检测线T线；用缓冲液稀释待包被PVY^NTN羊抗兔抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVY^NTN羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫2-3cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜上，构成质控线C线；检测线T线和质控线C线距离4-6mm；将划有检测线T线和质控线C线的NC膜3置于35-40℃条件下烘干，封装备用；

步骤3：样品垫1的制备：同实施例4

步骤4：试纸条的组装：同实施例4

本实施例中，所述PVY^NTN兔多克隆抗体和PVY^NTN羊抗兔抗体的制备方法具体为：

PVY^NTN多克隆抗体的制备：取1-2mL PVY^NTN兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVY^NTN抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVY^NTN抗体,再用磷酸缓冲液溶解PVY^NTN抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVY^NTN兔多克隆抗体；

PVY^NTN羊抗兔抗体的制备：取1-2mL PVY^NTN羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVY^NTN抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVY^NTN抗体,然后用磷酸缓冲液溶解PVY^NTN抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVY^NTN羊抗兔抗体；

PVY^NTN兔抗血清的制备方法：取2mLPVY^NTN,通过皮下4点注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血,即得到PVY^NTN的抗血清；

PVY^NTN羊抗兔抗血清的制备方法：取2mLPVY^NTN兔血清抗体，通过皮下4点注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血，即得到PVY^NTN羊抗兔抗血清。

实施例7

一种马铃薯病毒快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：金标垫2的制备：

1)PLRV胶体金标记物的制备：

用胶体金溶液标记PLRV兔多克隆抗体，PLRV兔多克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/mL；

复溶液配方和胶体金溶液的制备同实施例4；

PLRV胶体金标记物的制备工艺：取2支离心管，加入1-2mL 胶体金溶液，加入3-5µL 0.1mol/L 的K₂CO₃，再加入4-6µL PLRV兔多克隆抗体，静置25-35min，再加入80-120µL 封闭剂，静置25-35min,在8000-10000rpm、4℃条件下离心25-35min ，弃上清，加入80-120µL复溶液悬浮沉淀，在400-600rpm、4℃条件下离心10-20min ，吸取上清液，保存备用；

2) 金标垫2与PLRV胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫的支撑材料，将步骤1)制备的PLRV胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂PLRV胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4-6µL /cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥时间2-4h，取出，放入铝箔袋中，180-230℃ 热合封口，保存备用；

步骤2：NC膜3的制备：

检测线T线和质控线C线的制备：用缓冲液稀释待包被PLRV兔多隆抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PLRV兔多隆抗体划膜到距离金标垫1-2cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的浓度划膜于NC膜上，构成检测线T线；用缓冲液稀释待包被PLRV羊抗兔抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PLRV羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫2-3cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜上，构成质控线C线；检测线T线和质控线C线距离4-6mm；将划有检测线T线和质控线C线的NC膜3置于35-40℃条件下烘干，封装备用；

步骤3：样品垫1的制备：同实施例4

步骤4：试纸条的组装：同实施例4

本实施例中，所述PLRV兔多克隆抗体和PLRV羊抗兔抗体的制备方法具体为：

PLRV多克隆抗体的制备：取1-2mL PLRV兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PLRV抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PLRV抗体,再用磷酸缓冲液溶解PLRV抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PLRV兔多克隆抗体；

PLRV羊抗兔抗体的制备：取1-2mL PLRV羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PLRV抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PLRV抗体,然后用磷酸缓冲液溶解PLRV抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PLRV羊抗兔抗体；

PLRV兔抗血清的制备方法：取2mLPLRV,通过皮下4点注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血,即得到PLRV的抗血清；

PLRV羊抗兔抗血清的制备方法：取2mLPLRV兔血清抗体，通过皮下4点注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血，即得到PLRV羊抗兔抗血清。

实施例8

一种马铃薯病毒快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：金标垫2的制备：

1)PVS胶体金标记物的制备：

用胶体金溶液标记PVS兔多克隆抗体，PVS兔多克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/mL；

复溶液配方和胶体金溶液的制备同实施例4；

PVS胶体金标记物的制备工艺：取2支离心管，加入1-2mL 胶体金溶液，加入3-5µl 0.1mol/L 的K₂CO₃，再加入4-6µL PVS兔多克隆抗体，置25-35min，再加入80-120µL 封闭剂，静置25-35min,在8000-10000rpm、4℃条件下离心25-35min ，弃上清，加入80-120µL复溶液悬浮沉淀，在400-600rpm、4℃条件下离心10-20min ，吸取上清液，保存备用；

2) 金标垫2与PVS胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫的支撑材料，将步骤1)制备的PVS胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂PVS胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4-6µL /cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥时间2-4h，取出，放入铝箔袋中，180-230℃ 热合封口，保存备用；

步骤2：NC膜3的制备：

检测线T线和质控线C线的制备：用缓冲液稀释待包被PVS兔多隆抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVS兔多隆抗体划膜到距离金标垫1-2cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的浓度划膜于NC膜上，构成检测线T线；用缓冲液稀释待包被PVS羊抗兔抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVS羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫2-3cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜上，构成质控线C线；检测线T线和质控线C线距离4-6mm；将划有检测线T线和质控线C线的NC膜3 置于35-40℃条件下烘干，封装备用；

步骤3：样品垫1的制备：同实施例4

步骤4：试纸条的组装：同实施例4

本实施例中，所述PVS兔多克隆抗体和PVS羊抗兔抗体的制备方法具体为：

PVS多克隆抗体的制备：取1-2mL PVS兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVS抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVS抗体,再用磷酸缓冲液溶解PVS抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVS兔多克隆抗体；

PVS羊抗兔抗体的制备：取1-2mL PVS羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVS抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVS抗体,然后用磷酸缓冲液溶解PVS抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVS羊抗兔抗体；

PVS兔抗血清的制备方法：取2mLPVS,通过皮下4点注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血,即得到PVS的抗血清；

PVS羊抗兔抗血清的制备方法：取2mLPVS兔血清抗体，通过皮下4点注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血，即得到PVS羊抗兔抗血清。

实施例9

一种马铃薯病毒快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：金标垫2的制备：

1)PVM胶体金标记物的制备：

用胶体金溶液标记PVM兔多克隆抗体，PVM兔多克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/mL；

复溶液配方和胶体金溶液的制备同实施例4；

PVM胶体金标记物的制备工艺：取2支离心管，加入1-2mL 胶体金溶液，加入3-5µL 0.1mol/L 的K₂CO₃，再加入4-6µLPVM兔多克隆抗体，置25-35min，再加入80-120µL 封闭剂，静置25-35min,在8000-10000rpm、4℃条件下离心25-35min ，弃上清，加入80-120µL复溶液悬浮沉淀，在400-600rpm、4℃条件下离心10-20min ，吸取上清液，保存备用；

2) 金标垫2与PVM胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫的支撑材料，将步骤1)制备的PVM胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂PVM胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4-6µL /cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥时间2-4h，取出，放入铝箔袋中，180-230℃ 热合封口，保存备用；

步骤2：NC膜3的制备：

检测线T线和质控线C线的制备：用缓冲液稀释待包被PVM兔多隆抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVM兔多隆抗体划膜到距离金标垫1-2cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的浓度划膜于NC膜上，构成检测线T线；用缓冲液稀释待包被PVM羊抗兔抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVM羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫2-3cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜上，构成质控线C线；检测线T线和质控线C线距离4-6mm；将划有检测线T线和质控线C线的NC膜3 置于35-40℃条件下烘干，封装备用；

步骤3：样品垫1的制备：同实施例4

步骤4：试纸条的组装：同实施例4

本实施例中，所述PVM兔多克隆抗体和PVM羊抗兔抗体的制备方法具体为：

PVM多克隆抗体的制备：取1-2mL PVM兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVM抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVM抗体,再用磷酸缓冲液溶解PVM抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVM兔多克隆抗体；

PVM羊抗兔抗体的制备：取1-2mL PVM羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVM抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVM抗体,然后用磷酸缓冲液溶解PVM抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVM羊抗兔抗体；

PVM兔抗血清的制备方法：取2mLPVM,通过皮下4点注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血,即得到PVM的抗血清；

PVM羊抗兔抗血清的制备方法：取2mLPVM兔血清抗体，通过皮下4点注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血，即得到PVM羊抗兔抗血清。

实施例10

一种马铃薯病毒快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：金标垫2的制备：

1)PVA胶体金标记物的制备：

用胶体金溶液标记PVA兔多克隆抗体，PVA兔多克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/mL；

复溶液配方和胶体金溶液的制备同实施例4；

PVA胶体金标记物的制备工艺：取2支离心管，加入1-2mL 胶体金溶液，加入3-5µL 0.1mol/L 的K₂CO₃，再加入4-6µL PVA兔多克隆抗体，置25-35min，再加入80-120µL 封闭剂，静置25-35min,在8000-10000rpm、4℃条件下离心25-35min ，弃上清，加入80-120µL复溶液悬浮沉淀，在400-600rpm、4℃条件下离心10-20min ，吸取上清液，保存备用；

2) 金标垫2与PVA胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫的支撑材料，将步骤1)制备的PVA胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂PVA胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4-6µL /cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥时间2-4h，取出，放入铝箔袋中，180-230℃ 热合封口，保存备用；

步骤2：NC膜3的制备：

检测线T线和质控线C线的制备：用缓冲液稀释待包被PVA兔多隆抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVA兔多隆抗体划膜到距离金标垫1-2cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的浓度划膜于NC膜上，构成检测线T线；用缓冲液稀释待包被PVA羊抗兔抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将PVA羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫2-3cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜上，构成质控线C线；检测线T线和质控线C线距离4-6mm；将划有检测线T线和质控线C线的NC膜3 置于35-40℃条件下烘干，封装备用；

步骤3：样品垫1的制备：同实施例4

步骤4：试纸条的组装：同实施例4

本实施例中，所述PVA兔多克隆抗体和PVA抗羊兔抗体制备方法具体为：

PVA多克隆抗体的制备：取1-2mL PVA兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVA抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVA抗体,再用磷酸缓冲液溶解PVA抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVA兔多克隆抗体；

PVA羊抗兔抗体的制备：取1-2mL PVA羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀PVA抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀PVA抗体,然后用磷酸缓冲液溶解PVA抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得PVA羊抗兔抗体；

PVA兔抗血清的制备方法：取2mLPVA,通过皮下4点注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血,即得到PVA的抗血清；

PVA羊抗兔抗血清的制备方法：取2mLPVA兔血清抗体，通过皮下4点注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血，即得到PVA羊抗兔抗血清。

实施例11

一种马铃薯病毒快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：金标垫2的制备：

1)番茄黑环病毒胶体金标记物的制备：

用胶体金溶液标记 番茄黑环病毒兔多克隆抗体，番茄黑环病毒兔多克隆抗体的浓度为0.5-1.5mg/mL；

复溶液配方和胶体金溶液的制备同实施例4；

番茄黑环病毒胶体金标记物的制备工艺：取2支离心管，加入1-2mL 胶体金溶液，加入3-5µL 0.1mol/L 的K₂CO₃，再加入4-6µL番茄黑环病毒多克隆抗体，静置25-35min，再加入80-120µL 封闭剂，静置25-35min,在8000-10000rpm、4℃条件下离心25-35min ，弃上清，加入80-120µL复溶液悬浮沉淀，在400-600rpm、4℃条件下离心10-20min ，吸取上清液，保存备用；

2) 金标垫2与番茄黑环病毒胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫的支撑材料，将步骤1)制备的番茄黑环病毒胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂番茄黑环病毒胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4-6µL/cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥时间2-4h，取出，放入铝箔袋中，180-230℃ 热合封口，保存备用；

步骤2：NC膜3的制备：

检测线T线和质控线C线的制备：用缓冲液稀释待包被番茄黑环病毒兔多隆抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将番茄黑环病毒兔多隆抗体划膜到距离金标垫1-2cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的浓度划膜于NC膜上，构成检测线T线；用缓冲液稀释待包被番茄黑环病毒羊抗兔抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将番茄黑环病毒羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫2-3cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜上，构成质控线C线；检测线T线和质控线C线距离4-6mm；将划有检测线T线和质控线C线的NC膜3 置于35-40℃条件下烘干，封装备用；

步骤3：样品垫1的制备：同实施例4

步骤4：试纸条的组装：同实施例4

本实施例中，所述 番茄黑环病毒兔多克隆抗体和番茄黑环病毒羊抗兔抗体制备方法具体为：

番茄黑环病毒多克隆抗体的制备：取1-2mL番茄黑环病毒兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀番茄黑环病毒抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀番茄黑环病毒抗体,再用磷酸缓冲液溶解 番茄黑环病毒抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得番茄黑环病毒兔多克隆抗体；

番茄黑环病毒羊抗兔抗体的制备：取1-2mL番茄黑环病毒羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸缓冲液在振荡器中振荡,混匀后加入2-4mL饱和硫酸铵沉淀 番茄黑环病毒抗体；接着在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右条件下离心，沉淀番茄黑环病毒抗体,然后用磷酸缓冲液溶解番茄黑环病毒抗体,然后通过PD-10coLum纤维柱过滤除掉多余的硫酸铵，即得番茄黑环病毒羊抗兔抗体；

番茄黑环病毒兔抗血清的制备方法：取2mL番茄黑环病毒,通过皮下4点注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血,即得到番茄黑环病毒的抗血清；

番茄黑环病毒羊抗兔抗血清的制备方法：取2mL番茄黑环病毒免血清抗体，通过皮下4点注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,总共注射三次;第三次注射一周后,通过耳静脉采血，即得到番茄黑环病毒羊抗兔抗血清。

实施例12

一种马铃薯快速检测试纸条的应用，具体检测步骤为：

(1) 样品处理：取马铃薯叶片，按叶片重量g和缓冲液体积V的比为1:8-1:10的比例加入磷酸盐缓冲液，研磨出绿色汁液，磷酸盐缓冲液的PH为7.4-7.8；

(2) 把上述处理过的样品滴加到马铃薯快速检测试纸条的样品垫上，静置0.5~ 3分钟，观察检测线T线和质控线C线；

(3) 结果判读：如图4所示，检测线T线和质控线C线均显现紫红色为阳性；如图5所示，检测线T线不显现紫红色，质控线C线显现紫红色，结果为阴性；如图6所示，检测线T线和质控线C线均不显现紫红色或其他现象，提示试纸条失效。

实验内容

1、马铃薯病毒快速检测试纸条灵敏度的测定

取检测样品，分别稀释10¹倍、10² 倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶ 倍、10⁷倍、10⁸倍。进行灵敏度比较，将马铃薯病毒浓度设定为1ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL，试纸条检出马铃薯病毒的最小浓度为1ng/mL。马铃薯病毒包括PVX、PVY^NTN 、PVY^o、PLRV、PVS、PVM、PVA和番茄黑环病毒。

2、马铃薯病毒快速检测试纸条稳定性的测定

将试纸条用铝箔袋密封，加入干燥剂，分别置于4℃、37℃、室温条件下，其中置于4℃和室温条件试纸条每隔7天取出3条，置于37℃的每天取出3条，分别检测阴性样本和阳性样本。观察检测线T线和质控线C线的有无、颜色深浅及金标垫2上马铃薯病毒胶体金标记物上的释放程度。从试纸条测试结果来看，将试纸条放在内放干燥剂的密封铝箔袋中，室温和37℃下保存长时间后颜色略减弱，其他不同温度、不同时间的测试结果无明显变化，说明在适当条件下保存，本试纸条具有较好的稳定性。马铃薯病毒包括PVX、PVY^NTN 、PVY^o、PLRV、PVS、PVM、PVA和番茄黑环病毒。

3、马铃薯病毒快速检测试纸条特异性的测定

PVX的检测试纸条经过与PVX、PVS、PVA、PLRV、PVM 、PVY^o 、PVY^NTN病毒的阳性材料测试比较，仅PVX病毒阳性材料检测线T线及质控线C线均出现明显紫红色线，其他阳性材料仅质控C线出现紫红色线，检测线T线未出现紫红色线；马铃薯病毒的检测试纸条，对健康植株和缓冲液对照的检测结果，仅C线出现紫红色，T线未出现紫红色，结果是阴性，因此本试纸条具有特异性。

4、马铃薯病毒快速检测试纸条准确性的测定

用PVX的检测试纸条对96个马铃薯的植株做是否含有X病毒的检测；同时用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法对上述样品进行检测，两种检测方法的检测结果完全一致，符合率达100%；用PVY⁰的检测试纸条对100个马铃薯的植株做是否含有Y病毒的O株系病毒的检测；同时用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法对上述样品进行检测，两种检测方法的检测结果完全一致，符合率达100%；用PVA病毒的检测试纸条对100个马铃薯的植株做是否含有A病毒的检测；同时用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法对上述样品进行检测，两种检测方法的检测结果完全一致，符合率达100%；用PVS的检测试纸条对100个马铃薯的植株做是否含有S病毒的检测；同时用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法对上述样品进行检测，两种检测方法的检测结果完全一致，符合率达100%；用PVM的检测试纸条对100个马铃薯的植株做是否含有M病毒的检测；同时用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法对上述样品进行检测，两种检测方法的检测结果完全一致，符合率达100%;用番茄黑环病毒的检测试纸条对100个马铃薯的植株做是否含有番茄黑环病毒病毒的检测；同时用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法对上述样品进行检测，两种检测方法的检测结果完全一致，符合率达100%。用PVY^NTN的检测试纸条对98个马铃薯的植株做是否含有Y病毒的NTN株系病毒的检测；同时用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法对上述样品进行检测，两种检测方法的检测结果完全一致，符合率达100%;用PLRV的检测试纸条对100个马铃薯的植株做是否含有V病毒的检测；同时用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法对上述样品进行检测，两种检测方法的检测结果完全一致，符合率达100%。本实验足以说明马铃薯病毒快速检测试纸条的准确性高。