一种马铃薯病毒快速检测试纸条的制作方法

文档序号：12248323阅读：375来源：国知局

本实用新型涉及利用免疫层析技术检测植物病毒技术领域，具体涉及一种马铃薯病毒快速检测试纸条。

背景技术：

马铃薯是我国应用价值较高的经济作物，己被列为我国7大作物之一，也是中国西部最重要的作物品种和主要的支柱型产业，发展势头良好，但目前我国马铃薯单产却远远低于发达国家，马铃薯病毒是造成马铃薯产量低、质量差的主要原因。在中国的医学检验如早孕、乙肝、寄生虫、性病的检验和动物疫病的检验如禽病诊断、家畜疫病、小鼠肝炎病毒、猪旋毛虫病、犬病病毒的诊断中有免疫层析试纸条的应用；在烟草、南瓜、莴苣、黄瓜花叶病毒、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒、烟草脉带病毒、柑橘溃疡病菌、葫芦科病毒、莴苣丛枝植原体的检测中已有免疫层析试纸条的应用，但在马铃薯作物中还没有田间快速检测试纸条的应用。

常规的检测马铃薯病毒的技术是双抗体夹心酶联免疫吸附试验法，该方法需要专门的技术人员在专门的实验室利用专门的设备进行实验，操作过程繁琐，实验时间长：1.5-2天。不能现场取样，现场出结果。目前生产上普遍采用马铃薯脱毒种薯来防治病毒病的危害，为确保马铃薯原原种、原种的脱毒质量，建立快速、准确、灵敏、高效的马铃薯病毒类病毒检测技术是马铃薯种薯生产的关键技术环节。

通过检索发现如下与本专利相关的专利公开文献：

1、公开号为CN 103757138B的专利公开了一种云南马铃薯主栽品种丽薯6号、云薯401、宣薯2号病株中马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒4种病毒的检测方法。本实用新型通过对云南马铃薯主栽品种丽薯6号、云薯401、宣薯2号病株中马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒4种特异性混合抗体诱捕病样中病毒，不必提取样品总RNA进行随机引物逆转录和特异性病毒引物复合PCR反应。本方法将快速、特异的免疫沉淀与灵敏的复合RT-PCR结合，同时设置健康马铃薯随机引物cDNA产物相应病毒PCR特异片段阳性质粒作为阴、阳性对照，从而快速、准确、灵敏的应用于检测田间马铃薯植株样品、抗病毒材料及田间环境疑似侵染源等方面。

2、公开号为CN 103757138B的专利涉及两步法双重RT一PCR同步检测马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒，三重RT一PCR同步检测马铃薯X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒的方法及检测试剂盒，是专门针对马铃薯产业影响较大的5种马铃薯病毒而建立的一种同步检测2或3种病毒的快速方法，检测时间仅用4h，且灵敏度高、特异性强、稳定可靠。该方法克服了现有对马铃薯病毒病依据症状学的常规诊断方法误判率较高、血清学方法难以检测休眠马铃薯中的病毒及病毒含量较少的韧皮部病毒—马铃薯卷叶病毒等缺点;该方法适用于马铃薯种苗、种薯多种病毒病的早期诊断，对马铃薯种薯质量监测和病毒病预防有着重要的作用。

通过对比，本专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

技术实现要素：

本实用新型所要解决的技术问题是为了克服现有方法的不足，将马铃薯病毒快速检测试纸条应用到马铃薯病毒检测中，可实现对样品中马铃薯病毒高特异性、高灵敏度、高准确性、高稳定性的检测，快速检测出马铃薯病毒病的发生情况，为马铃薯脱毒薯种薯级别的定级和马铃薯病毒的防控提供理论依据。

本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的：

一种马铃薯病毒快速检测试纸条，包括样品垫1、金标垫 2、NC膜3、检测线T线4、质控线C线5、吸水垫6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部贴合有NC膜3，所述NC膜3上部两端分别搭接有金标垫2和吸水垫6，所述金标垫2上部搭接有样品垫1，所述检测线T线4设置在靠近样品垫1的NC膜3表面上，所述质控线C线5 设置在靠近吸水垫6的NC膜3上，所述检测线T线4上包被有马铃薯病毒兔多克隆抗体，所述质控线C线5上包被有马铃薯病毒羊抗兔抗体，所述的金标垫2上结合有胶体金标记物。

而且，马铃薯病毒快速检测试纸条外部还设有卡壳8，所述卡壳8上部表面与样品垫1对应的位置上设有加样孔9，所述卡壳8上部表面与所述NC膜3对应的位置上设有观察槽10。

而且，所述NC膜3与金标垫 2搭接的长度为1-2mm，所述NC膜3与吸水垫6搭接的长度为2-3mm，所述金标垫 2与样品垫1 搭接的长度为2-3mm。

而且，所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体、包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体和包被结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物，可以是以下组合中的任意一种：

组合1：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVX羊抗兔抗体，包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVX兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVX胶体金标记物；

组合2：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVY^c羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVY^c兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVY^c胶体金标记物；

组合3：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVY^NTN羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVY^NTN兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVY^NTN胶体金标记物；

组合4：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVY^o羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVY^o兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVY^o胶体金标记物；

组合5：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PLRV羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PLRV兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PLRV胶体金标记物；

组合6：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVS羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVS兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVS胶体金标记物；

组合7：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVM羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVM兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVM胶体金标记物；

组合8：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是PVA羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是PVA兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是PVA胶体金标记物；

组合9：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是TMV羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是TMV兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是TMV胶体金标记物；

组合10：所述包被在质控线C线5上的马铃薯病毒羊抗兔抗体是番茄黑环病毒羊抗兔抗体，所述包被在检测线T线4上的马铃薯病毒兔多克隆抗体是番茄黑环病毒兔多克隆抗体，所述结合在金标垫2上的马铃薯病毒胶体金标记物是番茄黑环病毒胶体金标记物。

本实用新型中：PVX代表马铃薯X病毒，PVY^c代表马铃薯Y病毒的C株系，PVY^NTN代表马铃薯Y病毒的NTN株系，PVY^o代表马铃薯Y病毒的O株系，PLRV代表马铃薯卷叶病毒，PVS代表马铃薯S病毒，PVM代表马铃薯M病毒，PVA代表马铃薯A病毒，TMV代表烟草花叶病毒。

本实用新型的检测原理：选用胶体金标记马铃薯病毒兔多克隆抗体制得胶体金标记物，喷涂在金标垫上；在检测线T线上包被能与目的物蛋白复合物发生免疫反应的马铃薯病毒兔多克隆抗体，在质控线C线上包被马铃薯病毒羊抗兔抗体，作为指示线。当把待检样品加样到样品垫上后，样品中马铃薯病毒蛋白与金标垫上的胶体金标记物形成免疫复合物，由于毛细管效应，该复合物向吸水垫方向泳动，此复合物与包被在检测线T线上的马铃薯病毒兔多克隆抗体发生特异性免疫结合反应，形成胶体金标记物、抗原（抗原是指马铃薯病毒）、兔多克隆抗体三联体复合物而被截留在检测线T线上，逐渐富集形成较深的紫红色条带；由于毛细管效应继续泳动向前，胶体金标记物与包被在质控线C线上的马铃薯病毒羊抗兔抗体发生特异性的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线C线上形成较深的紫红色条带，多余的未结合的物质继续层析到吸水垫上，因此在检测线T线和质控线C线都出现紫红色线的判为阳性结果；若样品中不含有马铃薯病毒，胶体金标记物到达检测线T线时，不与包被在检测线T线上的马铃薯病毒兔多克隆抗体发生免疫反应，因此在检测线T线处没有出现显色带，而胶体金标记物继续向前泳动与包被在质控线C线上的马铃薯病毒羊抗兔抗体发生特异的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线上形成紫红色线，因此仅在质控上出现紫红线判为阴性结果。检测线T线和质控线C线均不显现紫红色线或出现其他现象，提示试纸条失效，检测失败。

本实用新型的有益效果：

（1）本实用新型首次将免疫层析技术应用于马铃薯病毒病检测，实现了高特异性、高灵敏的检测性能。

（1）本实用新型使用方便、适用性强：无需实验室、不需要任何特殊仪器、无需专业人员操作培训、田间地头、马铃薯贮藏窖、海关等任何有马铃薯的地方即可测试，每个马铃薯种植者均会使用。

（2）本实用新型检测时间短，仅需1—5分钟即可得出检测结果。

（3）本实用新型准确性高：该试纸条检测马铃薯样品的准确率与双抗体夹心酶联免疫吸附实验法的准确率完全吻合，符合率达100%。

（4）本实用新型特异性强：马铃薯一种病毒的试纸条仅该种病毒阳性材料检测线及质控线均出现明显条带，其他阳性材料仅质控线出现条带，检测线未出现条带；马铃薯病毒的检测试纸条，对健康植株和缓冲液对照的检测结果，仅C线出现紫红色，T线未出现紫红色，结果是阴性，因此本试纸条具有特异性。

（5）本实用新型稳定性强：从试纸条测试结果来看，将试纸条放在内放干燥剂的密封铝箔袋中，37℃下保存长时间后颜色略减弱，其他不同温度、不同时间的测试结果无明显变化，说明在适当条件下保存，本试纸条具有较好的稳定性。

（6）本实用新型检测成本低；对温度无特殊需求，无须冷冻，储存运输方便，室温可保存24个月。

附图说明

图1本实用新型主视图（未画卡壳）；

图2为图1左视图；

图3本实用新型卡壳结构示意图；

图4中为阳性结果示意图；

图5中为阴性结果示意图；

图6中为试纸条失效示意图。

图中：1样品垫，2金标垫，3NC膜，4检测线T线，5质控线C线，6吸水垫，7PVC底板，8卡壳，9加样孔，10观察槽。

具体实施方式

下面结合实施例，对本实用新型作进一步详细的描述，但本实用新型的实施方式不限于此，不能以下述实施例来限定本实用新型的保护范围。

下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种马铃薯病毒快速检测试纸条，如图1、图2所示，一种马铃薯病毒快速检测试纸条，包括样品垫1、金标垫 2、NC膜3、检测线T线4、质控线C线5、吸水垫6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部贴合有NC膜3，所述NC膜3上部两端分别搭接有金标垫2和吸水垫6，所述金标垫2上部搭接有样品垫1，所述检测线T线4设置在靠近样品垫1的NC膜3表面上，所述质控线C线5 设置在靠近吸水垫6的NC膜3上，所述检测线T线4上包被有PVX兔多克隆抗体，所述质控线C线5上包被有PVX羊抗兔抗体，所述的金标垫2上结合有PVX胶体金标记物。

本实施例中，如图3所示，马铃薯病毒快速检测试纸条外部还设有卡壳8，所述卡壳8上部表面与样品垫1对应的位置上设有加样孔9，所述卡壳8上部表面与所述NC膜3对应的位置上设有观察槽10。