用于单个或少量活细胞无标记检测的太赫兹流式细胞传感器及其检测方法与流程

本发明属于传感器技术领域，具体涉及一种用于单个或少量活细胞无标记检测的太赫兹流式细胞传感器及其检测方法。

背景技术：

活细胞结构与功能的解析是当今生物医学领域研究的核心问题之一。从细胞的形态结构到胞内生物大分子的质与量，活细胞相关信息的检测是揭示组织和器官等更高生命层次的病理生理过程的基础，目前已经广泛应用于包括肿瘤的早期诊断、血液系统疾病的分型等各个研究领域。根据检测过程中是否使用标记物，活细胞检测可以分为以传统细胞化学染色、分子断层成像和流式细胞术为代表的有标记检测与以X线、CT、MRI和超声为代表的无标记检测，其中有标记检测技术可以通过各种化学或生物分子的标记细胞获得更多的生物信息和较高的灵敏度，是目前生物医学应用领域的主流技术。但有标记检测技术需要经历复杂的样本制备过程，获得的大多是生物大分子或细胞的群体行为信息并且需要以损伤活细胞为代价，不具备同一时间点获得多种活细胞信息的能力。相比之下，无标记检测技术的样本准备过程简单，且检测过程不会对细胞的正常生理活动造成较大影响，代表着检验医学未来的发展方向，但目前的无标记检测技术通常获得的活细胞信息有限。因此寻找新的一次性获取多种活细胞信息且不损伤细胞的无标记检测技术成为了检验医学追求的终极目标之一，近几十年来快速发展的太赫兹检测(THz)技术为这一目标的实现提供了可能。

THz是频率在0.1-10THz的电磁波，细胞内的生物大分子的振动和转动能级的间距正好处于THz的频带范围之内，因此在用THz光谱探测细胞时能够有效地产生共振吸收，从而有可能为细胞提供特征指纹谱。同时，1THz的光子能量仅为4.14meV，THz波在穿透细胞时不会发生有害的电离作用，因此THz检测技术属于一种纯物理的安全有效的无损伤、无标记检测技术。早期THz检测技术的研究大多局限于固相或者干燥状态下的生物分子，这是因为液相环境下细胞培养基中的水等极性分子会对THz波的检测信号造成极大的干扰，室温时1THz频率下水对THz波的吸收系数高达250cm^-1左右,由于水等极性分子的强烈吸收，液相环境中细胞的THz吸收信号往往被湮没，这种液相环境下水等极性分子对THz检测过程的干扰被称为“水敏感性”问题。考虑到来源于人体的生物样本大多富含水，活细胞的正常状态存在于水相中，同时检测环境里也存在水蒸气的干扰，“水敏感性”问题因此成为阻碍THz技术在细胞层次应用的一大难题。

根据现有文献研究，克服THz波在细胞层次应用的“水敏感性”问题主要有以下几个技术手段：

(1)THz波频段优化：研究表明在小于1THz的低频范围内，THz的“水敏感性”急剧降低，筛选优化THz波的频段有助于克服“水敏感性”；

(2)采用反射式探测方法：目前的太赫兹时域光谱技术可分为透射式与反射式，在透射模式下，THz经过样品时大部分被水吸收，检测信号微弱，而反射式时域光谱技术可以有效减少水对THz波的吸收；

(3)利用微流体技术：微流体技术是指在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的技术，当样品溶液通过微流体的微通道时，待测样品周围的水层厚度被减少到毫米或百微米级别，从而减少THz波接触细胞前的信号损失。

上述3种技术手段中，采用THz波频段优化和反射式的探测方法只是优化THz信号提取的方式，效果有限且并没有从根本上解决水对THz波的强烈吸收，而微流体技术受限于制作工艺和微通道内部摩擦力的影响，最多可将样品周围水层厚度减少至毫米或百微米级别，并不足以有效排除“水敏感性”的问题。

光透明剂(Optical clearing agent,OCA)是一类生物相容性好、对生物体毒性小的有机溶剂，通过向生物组织内引入OCA，可以可逆性改变生物组织结构，控制生物组织的光散射，从而提高光在生物组织的穿透深度，提高包括THz成像在内的各种光学成像技术的对比度、分辨率和探测深度。常用的OCA包括：氮酮、油酸、亚油酸、聚乙二醇400、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙醇、丙烯乙二醇、三嗪酮等，已经广泛使用在各种光学探测方法中。Oh等人的研究表明甘油在组织层次具有提高THz检测信号的能力，试验中选取在THz频段吸收较小的甘油作为THz渗透增强剂并将其应用于THz组织成像检测中，结果表明将甘油涂于皮肤组织表面后，待测皮肤组织的THz信号峰值几乎是没有使用甘油的2倍，采用甘油覆盖生物样品时可减小组织间隙的水层厚度，减弱水对THz波的吸收，从而降低THz波与样本接触前的信号损失，提高THz检测信号。以上研究为排除“水敏感性”问题提供了新的解决思路，但目前细胞层面的THz检测中将OCA直接用做活细胞的溶剂以提高THz检测信号、降低“水敏感性”的尝试还未曾报道。

OCA具有提高THz检测信号，排除“水敏感性”的能力，但为达到检测单个或少量活细胞的目的，需要解决两个关键技术问题：单个或少量活细胞在OCA中被均匀包裹；单个或少量活细胞依次通过THz检测处。

针对问题一：由于OCA大多属于有机溶剂，亲水性的细胞难以直接在OCA中分散，只能制作成乳浊液进行检测，但传统的搅拌摇匀方法在制作细胞乳浊液时无法实现单个或少量细胞的均匀包裹；

针对问题二：可采用微流体技术让OCA包裹着细胞形成“细胞微滴”通过THz检测处，但难以保证每次检测时仅有一个“细胞微滴”通过检测处。

所以有必要针对上述问题研发一种可使单个或少量活细胞在OCA中被均匀包裹且依次进行检测的THz流式细胞传感器，并研发该传感器的检测方法，从而实现单个或少量活细胞无标记检测。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供用于单个或少量活细胞无标记检测的太赫兹流式细胞传感器，本发明目的之二在于提供所述传感器的检测方法。

为实现上述发明目的，本发明提供了如下的技术方案：

1、用于单个或少量活细胞无标记检测的太赫兹流式细胞传感器，包括细胞微滴制作模块、微流体检测通道以及THz检测模块，所述细胞微滴制作模块包括至少一个微流体管腔，所述微流体管腔包括一个用于传送细胞悬液的入口通道a、用于传送OCA并与入口通道a对称衔接的两个入口通道b，三个入口通道交汇处连接有用于传送细胞微滴的出口通道d，所述THz检测模块包括至少一个与微流体检测通道尺寸相同的检测槽，所述出口通道d通过微流体检测通道与检测槽连接。

作为本技术方案的优选，所述两个入口通道b与入口通道a成T型连接结构。

作为本技术方案的进一步优选，所述两个入口通道b与入口通道a成Y型连接结构。

优选的，所述入口通道a及两个入口通道b内径尺寸与单细胞尺寸匹配设置，所述出口通道d内径尺寸与细胞微滴尺寸匹配设置。

优选的，所述入口通道a及两个入口通道b内径尺寸为15～20μm，所述出口通道d内径尺寸为25～30μm。

优选的，所述微流体检测通道为U型结构。

2、用于单个或少量活细胞无标记检测的太赫兹流式细胞传感器的检测方法，包括如下步骤：

1)用微型泵以稳定的流速将OCA抽进两个入口通道b，将充分稀释的细胞悬液抽进入口通道a，确认细胞悬液在三个入口的交汇处形成包裹单个或少量细胞的细胞微滴；

2)步骤1)的细胞微滴通过出口通道d进入微流体检测通道再通过THz检测模块的检测槽进行检测。

优选的，控制通道a、b中流体的速度，确认生成的细胞微滴尺寸均一，在微流体检测通道内分布均匀。

优选的，所述OCA为肉豆蔻酸异丙酯或二甲基硅油。

优选的，所述细胞悬液为单一种类细胞或多种细胞的混合。

本发明的有益效果在于：本发明首次利用生物相容性好的OCA作为活细胞检测时的溶剂将单个或少量细胞包裹起来，形成独立的“细胞微滴”并依次通过THz检测处，实现单个或少量活细胞的无标记检测。拟首次利用生物相容性好的OCA作为活细胞检测时的溶剂，拟采用改良后的三通道微流体技术解决上述两个关键技术问题，通过整合生物相容性OCA和三通道微流体技术实现了效果更明显的THz细胞检测技术。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1表示实施例1所述的太赫兹流式细胞传感器结构示意图；

图2表示实施例1所述的细胞微滴制作模块示意图；

图3表示实施例1所述THz检测模块示意图；

图4表示实施例2所述的细胞微滴制作模块示意图；

图5表示实施例3所述的太赫兹流式细胞传感器结构示意图；

图6表示常见8种OCA的生物相容性实验结果；

图7表示二甲基硅油、肉豆蔻酸异丙酯和纯水在THz频段的吸收系数图；

图8表示二甲基硅油和肉豆蔻酸异丙酯在THz频段的吸收系数图；

图9表示OCA包裹单个或少量细胞形成细胞悬滴；

图10表示OCA包裹细胞后在THz检测时降低“水敏感性”的效果评价。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一种用于单个或少量活细胞无标记检测的太赫兹流式细胞传感器，如图1所示，所述传感器包括细胞微滴制作模块、微流体检测通道以及THz检测模块，所述细胞微滴制作模块包括一个微流体管腔，所述微流体管腔包括一个用于传送细胞悬液的入口通道a、用于传送OCA并与入口通道a对称衔接的两个入口通道b，三个入口通道交汇处连接有用于传送细胞微滴的出口通道d，所述THz检测模块包括一个与微流体检测通道尺寸相同的检测槽，所述出口通道d通过微流体检测通道与检测槽连接；所述两个入口通道b与入口通道a成T型连接结构；所述两个入口通道b与入口通道a内径尺寸为20微米，出口通道d内径尺寸为25微米。

其中图2表示实施例1所述的细胞微滴制作模块示意图；

其中图3表示实施例1所述THz检测模块示意图。

实施例1所述用于单个或少量活细胞无标记检测的太赫兹流式细胞传感器的检测方法，包括如下步骤：

(1)优选生物相容性好、在THz频段吸收小的OCA：用微型泵以稳定的流速抽进三通道微流体的上下两个管腔内；

(2)将细胞悬液进行充分的稀释；

(3)将步骤(2)获得的细胞样本稀释液用稳定的流速抽进三通道微流体中间的管腔内；

(4)确认细胞样本稀释液是否在三通道微流体管腔的T型连接结构处形成包裹单个或少量细胞的细胞微滴，是，向下进行，否则重复步骤(1)至(3)；

(5)控制三通道内部流体的速度，确认生成的细胞微滴尺寸均一，在微流体检测通道内分布均匀，是，开始检测，否则，重复步骤(1)至(4)；

(6)细胞微滴通过THz检测区域，细胞信号被检测。

通过控制三通道管腔内部的流体速度，可调节细胞微滴的生成速度和尺寸。当保持流体速度稳定时，生成的“细胞微滴”尺寸均一，单个或少量细胞在微滴内部分散均匀，当“细胞微滴”的生成速度合适时，微流体出口通道管腔内的微滴会保持一定的距离排列并依次通过THz检测处。

“细胞微滴”内部包括单个或少量细胞及部分水层，当微滴尺寸被控制在100微米以下，内部水层厚度可被控制在几十微米级别，此时胞外水层对THz波的吸收会急剧减少。同时微滴外部的OCA层具有生物相容性好，不损伤活细胞且THz频段吸收小的特点，可形成THz波的信号保护层。因此在检测细胞微滴时可最大程度的避免THz波接触细胞前的信号损失，达到排除“水敏感性”，无标记、无损伤的检测单个或少量活细胞的效果。

实施例2

如图4所示，实施例2与实施例1不同的是将细胞微滴制作模块的两个入口通道b与入口通道a成Y型连接结构。减少OCA在管腔内的流动路径，细胞悬液更容易形成细胞微滴，效果更佳。

实施例3

如图5所示，实施例3与实施例1不同的是将微流体检测通道设计成U型结构，此结构在增加微流体长度的同时，更容易将细胞微滴分散开，使得细胞微滴更容易依次通过THz检测区域，效果更佳。

生物相容性好、在THz频段吸收小的OCA的筛选

1)常见8种OCA的生物相容性实验：采用CCK8细胞增殖-毒性检测试验，以乳腺癌MDA-MB-231细胞为模型细胞，评价常见8种OCA(氮酮、甘油、油酸、1，2-丙二醇(C₃H₈O₂)、一缩二丙二醇(C₆H₁₄O₃)、肉豆蔻酸异丙酯、聚乙二醇和二甲基硅油)的生物相容性。因THz光谱检测过程用时较短，可在2分钟之内完成样品检测过程，故将上述8种物质分别作用于贴壁细胞5分钟后计算细胞存活情况，测试结果如图6所示，由图6可看出肉豆蔻酸异丙酯和二甲基硅油这两种物质作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞5分钟后，细胞存活率均在95％左右，可认为这两种物质的生物相容性较好，无细胞毒性，适宜用作本发明所述检测方法所涉及的OCA；

2)所筛选的OCA在THz频段的吸收情况：检测肉豆蔻酸异丙酯和二甲基硅油在THz频段的吸收情况，并和纯水做对比。检测结果分别如图7、8所示，肉豆蔻酸异丙酯和二甲基硅油在THz频段的吸收系数明显低于水，其中吸收最大的二甲基硅油在1THz处的吸收仅为水的10％左右，在包裹活细胞进行THz检测时可在细胞外形成THz波的信号保护层，减少了THz接触细胞前因水吸收造成的信号损失，从而降低“水敏感性”。

肉豆蔻酸异丙酯包裹细胞后在THz检测时降低“水敏感性”的效果评价：

用肉豆蔻酸异丙酯包裹单个或少量乳腺癌MDA-MB-231细胞后形成细胞悬滴，如图9所示，比较THz光谱检测OCA包裹的细胞悬滴中的细胞和DMEM细胞培养基中的细胞的差异，得到如图10所示的检测结果，当使用THz光谱检测DMEM细胞培养基中的细胞时，DMEM培养基中有细胞时的THz吸收曲线与纯DMEM培养基(无细胞)的吸收曲线基本重合，DMEM培养基中有无细胞的差异并不明显。这是由于DMEM培养基中90％以上是水，水层对THz波的强烈吸收产生了极强的背景干扰，使得细胞本身的吸收信号被湮没；

而当使用THz光谱检测OCA肉豆蔻酸异丙酯包裹的细胞悬滴时，OCA层中有细胞悬滴时的THz吸收曲线明显高于纯OCA层的吸收曲线。这是由于OCA层本身对THz波吸收很小，可在细胞悬滴外部形成信号保护层，虽然“细胞悬滴”内部既包括单个或少量细胞又含有部分水层，但是当悬滴尺寸被控制在100微米以下，内部水层厚度可被控制在几十微米级别，此时胞外水层对THz波的吸收会急剧减少，细胞周围的背景吸收明显降低。在较低背景吸收下，细胞悬滴中细胞本身的吸收信号得以体现。因此采用上述检测方案可最大程度的避免THz波接触细胞前的信号损失，达到排除“水敏感性”，无标记、无损伤的检测单个或少量活细胞的效果。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。