专利名称：一种玉米综合抗病性鉴定有效ssr标记的开发方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种农作物抗病性鉴定标记的开发方法。
背景技术：
长期以来，玉米病害以其种类多、分布广、危害重等特点，已成为限制玉米产量的主要因素之一，常年损失为6-10%，大发生时达30% 40%，且严重降低了玉米品质。近年来，由于单交种的大面积推广种植，生态环境的改变、农业生产条件的改善和国际间材料交流的日益频繁，使得玉米病害的发生趋势呈两种一度曾被控制的病害再度爆发流行，病害种类增加；一些次要病害上升为主要病害。其中，由真菌引起的病害，如玉米丝黑穗病、大小斑病、茎腐病、纹枯病、弯孢菌叶斑病、锈病等真菌性病害，在玉米病害中更是占有举足轻重的地位。发掘玉米种质的抗病基因及其紧密连锁的分子标记，是抗病分子标记辅助育种的前提和必要过程。近10年来，随着分子生物学突飞猛进的发展，分子标记拓展出许多可以检测DNA多态性的新方法。在各种基于DNA变异的分子标记中，SSR技术以孟德尔方式遗传，为共显性标记，高多态性，杂合度高，分布广泛而均勻，灵敏度好，退火温度高，特异性强等优点，在玉米育种中得到了更为广泛的应用。SSR标记的发展应用，使玉米抗病育种进入分子育种水平，不仅可以定位多个目标性状，而且缩短育种年限，降低育种成本。可见，加强玉米抗病分子遗传学基础研究，把现代分子生物学技术与常规育种紧密结合，开展分子育种将对加速培育抗病虫品种，防止病虫危害，提高玉米产量等具有重要意义。当前的玉米抗病性鉴定主要是通过大田种植，人工调查的方法获得抗病种质，该方法耗时长，病害种类鉴定单一，人为影响因素大，且需要一定数量的土地种植材料，成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种玉米综合抗病性鉴定有效SSR标记的开发方法，从而克服现有玉米抗病性鉴定的不足。玉米综合抗病性鉴定有效SSR标记的开发方法，包括如下步骤(1)对大量玉米种质进行三大病害抗病性调查；(2)对供试材料进行SSR标记分析；(3)综合抗病性鉴定有效SSR标记的筛选。本发明方法具有耗时短，成本低，得到的结果准确等优点。
具体实施例方式(1)在试验基地种植我国常用玉米自交系，其多为育种中常用的杂交种亲本，包括常用杂种优势群和具代表性的自交系类群。采用单粒点播，两行区，行长5. 0m，行距0. 6m, 每行15株，Mol7、黄早四分别是玉米丝黑穗病的抗感对照，齐319、掖478分别是玉米茎腐病的抗感对照。采用人工接种方法，大斑病菌株于7月中旬(12叶期)采用喷雾法进行第一次接种，接种后覆盖塑料膜保湿36小时，以保证发病条件，10日后进行第二次接种。丝黑穗病病菌于在种植前进行病菌拌土接种。茎腐病菌株(禾谷镰刀菌)采用土壤埋入法接种，在玉米抽雄一周后进行茎腐菌根埋，并适当浇水，保证足够的土壤含水量和病菌量，以满足该病菌发病条件。(2)玉米进入乳熟期开始进行调查，按照王晓鸣等人编著的《玉米病虫害手册》专业性鉴定标准对三大病害进行田间调查，根据症状划分单株病级数，根据单株病级数计算病株率和病情指数。抗性评价标准采用国家玉米品种抗病鉴定标准。(3)收集整理前人围绕这三大病害开展的基因定位研究结果，收集SSR引物用于玉米三大病害抗性鉴定的有效标记筛选。(4)基于扩增带型清晰、稳定、易读性强且等位基因数< 3的原则，筛选有效标记。(5)采用NTSYS软件对筛选出抗病鉴定有效标记数据进行主成分分析(PC0， Principle coordinate ￡1115115^818),^:1^1^+21^1.^1^0实例一种玉米综合抗病性鉴定有效SSR标记的开发方法，包括如下步骤(1)2010年5月上旬，在吉林省农科院公主岭试验基地种植我国常用玉米自交系， 共69份，其多为育种中常用的杂交种亲本，包括常用杂种优势群和具代表性的自交系类群。采用单粒点播，两行区，行长5.0m，行距0.6m，每行15株。采用人工接种方法，大斑病菌株(未区分生理小种)由吉林省农科院植保所提供， 于2010年5月自己繁殖，于7月中旬(12叶期)采用喷雾法进行第一次接种，接种后覆盖塑料膜保湿36小时，以保证发病条件，10日后进行第二次接种。丝黑穗病病菌于2009年收集，在种植前进行病菌拌土接种。茎腐病菌株(禾谷镰刀菌)由吉林省农科院植保所提供， 并于2010年5月自己繁殖，接种方法采用土壤埋入法，在玉米抽雄一周后进行茎腐菌根埋， 并适当浇水，保证足够的土壤含水量和病菌量，以满足该病菌发病条件。(2)玉米进入乳熟期开始进行调查，按照王晓鸣等人编著的《玉米病虫害手册》专业性鉴定标准对三大病害进行田间调查，根据症状划分单株病级数，根据单株病级数计算病株率和病情指数。抗性评价标准采用国家玉米品种抗病鉴定标准(王晓鸣等，200 。病级分级采用5级制1级高抗(HR) ；3级抗(R) ；5级中抗(MR) ；7级感(S) ；9级高感(HS)。病株率(Disease incidence)计算公式病株率=(病株/调查总株数)X 100% ；病情指数(Disease Index)计算公式病情指数=(各级病株数X相应级数之和/调查株数X 9) X 100%。(3)收集整理前人围绕这三大病害开展的基因定位研究结果，发现抗病位点主要集中在玉米第2、6、7、8、10条染色体上，选取其中引物用于玉米三大病害抗性鉴定的有效标记蹄选。(4)本研究利用所选取的引物，针对玉米大斑病、丝黑穗病和茎腐病三大病害，进行抗性鉴定有效标记的筛选。前人研究结果表明，大斑病抗病基因Htl、Ht2、Ht3、HtN属于单显性抗病基因，丝黑穗病主要受主效QTLqHSRl控制，茎腐病主要受Rfgl和Rpi 1基因的控制。鉴于上述原因， 本研究基于扩增带型清晰、稳定、易读性强且等位基因数< 3的原则，从引物中筛选出可作为检测玉米大斑病的有效标记umc2212、umcl316、umcl327,丝黑穗病有效标记SSR148152， 茎腐病有效标记SSR58。(5)采用NTSYS软件对筛选出的5个抗病鉴定有效标记数据进行主成分分析，结果表明，抗病自交系和感病自交系分化较明显，在PCO图上虽有部分重叠，没有形成两个相对独立的群，但大部分抗病自交系形成一个B群，部分感病自交系聚类成A群，部分兼有抗病表现和感病表现的自交系重叠在一起。通过筛选获得的5 对有效标记(umc2212、umcl316、umcl327、SSR148152、SSR58) 进行聚类分析，结果显示可将这些自交系分为2大类群，第一个类群主要由综合表现抗病的自交系组成，第二个类群主要由综合表现感病的自交系组成。类群I由43份综合抗病自交系和8份综合感病自交系组成，其中43份综合抗病自交系中表现高抗性的有13份；类群 II包括7份综合抗病和11份综合感病自交系，其中7份表现综合抗性的自交系为齐319、 !199、四观7、武314、B73、综31、丹598。利用5对抗病SSR标记数据对69份自交系综合抗感情况进行验证，大体上可以将抗病和感病自交系区分。因此，筛选出的5对分子标记可作为抗病鉴定有效SSR标记，进而为已有抗病种质的筛选提供技术支撑。
权利要求
1. 一种玉米综合抗病性鉴定有效SSR标记的开发方法，其特征是采用如下步骤完成(1)对大量玉米种质进行三大病害抗病性调查；(2)对供试材料进行SSR标记分析；(3)综合抗病性鉴定有效SSR标记的筛选。
全文摘要
一种玉米综合抗病性鉴定有效SSR标记的开发方法，属于分子生物学领域，完成的步骤是对大量玉米种质进行三大病害抗病性调查；对供试材料进行SSR标记分析；综合抗病性鉴定有效SSR标记的筛选。本发明方法具有耗时短，成本低，得到的结果准确等优点。
文档编号C12Q1/68GK102409086SQ20111021718
公开日2012年4月11日 申请日期2011年8月1日 优先权日2011年8月1日
发明者张春宵, 李晓辉, 李海云, 李红, 赵泽双 申请人:吉林省农业科学院