本发明属于生物技术领域,具体涉及一种多层纳米金球的液相开管柱及其制作方法和应用。
背景技术:
纳米金球即指金的微小球形颗粒,其直径在1~100 nm,具有高电子密度、介电特性和催化作用,能与多种生物大分子结合,且不影响其生物活性。由氯金酸通过还原法可以方便地制备各种不同粒径的纳米金球,其颜色依直径大小而呈红色至紫色。纳米金球因其独特的物理化学性质而受到越来越广泛的关注。纳米金球可以轻易地与氨基发生静电相互作用,与巯基之间生成化学键。因此纳米金球可以有条件的自主装在毛细管的内表面。
常规的Si基或玻璃毛细管内表面可以进行内部修饰, 例如修饰氨基或巯基。当毛细管内充满金溶胶时,金溶胶内悬浮的纳米金球就会通过静电吸引或者化学键作用,自主装在毛细管内表面。只要通入的金溶胶足够多,就有可能形成连续的纳米金球自主装层。当相邻金球使用二巯基试剂相连时,该纳米金球自组装层就会比较牢固,可以承受十个以上气压的液体冲刷。
连续多层的纳米金球层的金属层作为毛细管内壁的修饰层是复杂修饰的前导步骤。因为其不但可以将内壁改造为导体层,方便电位控制和信号传导,而且还可以大大丰富吸附的功能分子种类,这在医学检测、生物分离、DNA鉴定等领域广为应用。
同时,连续多层的纳米金球层是一个多孔结构,而它的孔则来自于金球与金球之间堆积形成的空隙。空隙的大小有可能类似于色谱保留所需的孔隙。因此,经过进一步的修饰,内壁自主装了多层纳米金球的毛细管可以成为毛细管液相开管柱,对物质进行分离分析。液相开管柱的极小体积可以用来分离少量细胞中的微量蛋白质和肽段,这在单细胞分析领域很有作用。
技术实现要素:
本发明的目的在于提供一种多层纳米金球的液相开管柱及其制作方法和应用。
本发明提供的多层纳米金球的液相开管柱及其制作方法,其步骤为:
(1)首先,预处理毛细管内壁,并通入氨基硅烷偶联剂反应,在毛细管内壁修饰氨基;
(2)然后,将纳米金溶胶通过气体压入内壁修饰了氨基的毛细管中,在毛细管内壁自主装上第一层金球;
(3)再将二巯基试剂通入内壁修饰了第一层纳米金球的毛细管中,在第一层金球上修饰巯基;
(4)再将纳米金溶胶通过气体压入内壁修饰了带巯基的纳米金球的毛细管中,在毛细管内壁自主装上第二层金球;
(5)重复通入二巯基试剂和纳米金溶胶的步骤,在毛细管内壁自主装上更多层金球;
(6)最后向毛细管内通入巯基试剂,使内壁自组装了多层纳米金球的毛细管成为液相开管柱。
将制作好的固定相为多层纳米金球的液相开管柱用于100个细胞的蛋白酶解液的色谱分离,利用Orbitrap MS在线检测色谱馏分。
本发明提供的多层纳米金球的液相开管柱的制作方法,具体操作流程如下:
(1)取一根200-1000 μm外径、5-500 μm内径、长度1-1000 cm的玻璃或石英毛细管,4-50 ℃下,依次用0.1-1 mol/L NaOH、水、0.1-1 mol/L HCl、水、CH3CN分别冲洗5-30 min;
(2)将硅烷偶联剂反应液通入步骤(1)所得毛细管中,20-150 ℃下加热反应0.5-24 h;硅烷偶联试剂包括但不限于3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷(1-99%,v/v)溶液,溶液的溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙醇、二甲基亚酰胺、二甲亚砜;硅烷偶联反应完成后用溶剂洗净,溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、二甲基亚酰胺;
(3)将纳米金球颗粒直径为1-100 nm的金溶胶置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中;气瓶和钢瓶之间用内径为5-500 μm内径的石英毛细管连接;将步骤(2)所得毛细管直接插在气瓶内的金溶胶中;在4-50 ℃、0.1-10 bar压力下,使用气体钢瓶的气体,气体包括但不限于氮气、氩气、氦气,将10-1000倍毛细管体积金溶胶压入毛细管中;
(4)将二巯基试剂置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中;二巯基试剂包括但不限于二巯基丙烷、二巯基丁烷、二巯基戊烷、二巯基己烷、二巯基庚烷、二巯基辛烷、二巯基壬烷、二巯基癸烷,浓度为0.1-50%(v/v),溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙醇、二甲基亚酰胺、二甲亚砜;气瓶和钢瓶之间用内径为5-500 μm内径的石英毛细管连接;将步骤(3)所得毛细管直接插在气瓶内的二巯基试剂中;在4-50 ℃、0.1-10 bar压力下,使用气体钢瓶的气体,气体包括但不限于氮气、氩气、氦气,将10-1000倍毛细管体积二巯基试剂压入毛细管中;
(5)将纳米金球颗粒直径为1-100 nm的金溶胶置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中;气瓶和钢瓶之间用内径为5-500 μm内径的石英毛细管连接;将步骤(4)所得毛细管直接插在气瓶内的金溶胶中;在4-50 ℃、0.1-10 bar压力下,使用气体钢瓶的气体,气体包括但不限于氮气、氩气、氦气,将10-1000倍毛细管体积金溶胶压入毛细管中;
(6)重复步骤(4)和步骤(5),重复次数1到20次;
(7)将巯基试剂置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中;巯基试剂包括但不限于巯基丁烷、巯基戊烷、巯基庚烷、巯基十八烷,浓度为0.1-50%(v/v),溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙醇、二甲基亚酰胺、二甲亚砜;气瓶和钢瓶之间用内径为5-500 μm内径的石英毛细管连接;将步骤(6)所得毛细管直接插在气瓶内的巯基试剂中;在4-50 ℃、0.1-10 bar压力下,使用气体钢瓶的气体,气体包括但不限于氮气、氩气、氦气,将10-1000倍毛细管体积巯基试剂压入毛细管中;即得到固定相为多层纳米金球的液相开管柱。
本发明所制备的多层纳米金球的液相开管柱,可用于分离10-1000个细胞蛋白质和肽。具体步骤为:
(1)将多层纳米金球的液相开管柱装入色谱系统;
(2)使用色谱系统对多层纳米金球的液相开管柱进样,样品为10-1000个细胞的蛋白酶解液;
(3)使用色谱系统洗脱步骤(2)所得液相开管柱中的10-1000个细胞的蛋白酶解液,流动相为A相水,0.1%甲酸,B相乙腈,0.1%甲酸;
(4)使用Orbitrap MS对步骤(3)所得色谱馏分进行在线检测,离子源为电喷雾离子源。
本发明的特点是利用纳米金球方便快速的构建开管柱的多孔层固定相,能够在很宽内径范围的毛细管中操作。所得的液相开管柱柱体积极小,分离少量细胞时,肽段和蛋白质的稀释作用小,利于检测。
附图说明
图1为所得20 μm内径固定相为四层纳米金球的液相开管柱横截面的扫描电镜图。
图2为所得通过Orbitrap MS检测到的20 μm内径固定相为四层纳米金球的液相开管柱100个Hep3B细胞的蛋白酶解液馏分的总离子流图。
图3为所得40 μm内径固定相为六层纳米金球的液相开管柱横截面的扫描电镜图。
图4为所得通过Orbitrap MS检测到的40 μm内径固定相为六层纳米金球的液相开管柱500个HeLa细胞的蛋白酶解液馏分的总离子流图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明,而不是限制本发明的范围。
实施例1:20 μm内径固定相为四层纳米金球的液相开管柱的制作:
(1)取一根2 m长,365 μm外径,20 μm内径的石英毛细管,室温下,依次用0.2 mol/L NaOH冲洗10 min,用水冲洗5 min,用0.1 mol/L HCl冲洗5 min,用水冲洗5 min,用CH3CN冲洗5 min;
(2)将100 μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷溶于400 μL 乙腈中,将所得溶液通入步骤(1)所得石英毛细管中,在60 ℃下加热反应14 h;
(3)将纳米金球颗粒直径为60 nm的金溶胶置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中;气瓶和钢瓶之间用内径为100 μm内径的石英毛细管连接;步骤(2)所得石英毛细管直接插在气瓶内的金溶胶中;在30 ℃,2 bar压力下,使用氦气钢瓶的氦气,将500倍毛细管体积金溶胶压入毛细管中;
(4)将二巯基壬烷的二甲亚砜溶液置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中,浓度为20%(v/v);气瓶和钢瓶之间用内径为100 μm内径的石英毛细管连接;步骤(3)所得石英毛细管直接插在气瓶内的二巯基壬烷试剂中;在30 ℃,2 bar压力下,使用氦气钢瓶的氦气,将100倍毛细管体积二巯基壬烷试剂压入毛细管中;
(5)将纳米金球颗粒直径为60 nm的金溶胶置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中;气瓶和钢瓶之间用内径为100 μm内径的石英毛细管连接;步骤(4)所得石英毛细管直接插在气瓶内的金溶胶中;在30 ℃,2 bar压力下,使用氦气钢瓶的氦气,将500倍毛细管体积金溶胶压入毛细管中;
(6)重复步骤(4)和(5),重复次数2次;
(7)将巯基十八烷的丙醇溶液置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中,浓度为30%(v/v);气瓶和钢瓶之间用内径为100 μm内径的石英毛细管连接;步骤(6)所得石英毛细管直接插在气瓶内的巯基十八烷试剂中;在30 ℃,2 bar压力下,使用氦气钢瓶的氦气,将300倍毛细管体积二巯基壬烷试剂压入毛细管中。
图1为所得20 μm内径固定相为四层纳米金球的液相开管柱横截面的扫描电镜图。
实施例2:将实施例1所得20 μm内径固定相为四层纳米金球的液相开管柱用于100个细胞的蛋白酶解液的色谱分离与Orbitrap MS在线检测:
(1)将实例1所得液相开管柱装入纳升色谱系统;
(2)使用纳升色谱系统的自动进样系统对实施例1所得液相开管柱进样,样品为100个Hep3B细胞的蛋白酶解液,进样量为20 fmol;
(3)使用纳升色谱系统洗脱实例1所得液相开管柱中的100个Hep3B细胞的蛋白酶解液,流速100 nL/min,梯度洗脱,从99% 流动相A相(水,0.1%甲酸),1% 流动相B相(乙腈,0.1%甲酸)到60%流动相A相,40%流动相B相;
(4)使用Orbitrap MS对步骤(10)所得色谱馏分进行在线检测,离子源为电喷雾离子源。
图2为所得通过Orbitrap MS检测到的20 μm内径固定相为四层纳米金球的液相开管柱100个Hep3B细胞的蛋白酶解液馏分的总离子流图。
实施例3:40 μm内径固定相为六层纳米金球的液相开管柱的制作:
(1)取一根3 m长,365 μm外径,40 μm内径的石英毛细管,室温下,依次用0.1 mol/L NaOH冲洗5 min,用水冲洗5 min,用0.2 mol/L HCl冲洗15 min,用水冲洗35 min,用CH3CN冲洗3 min;
(2)将100 μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷溶于500 μL 乙腈中,将所得溶液通入步骤(1)所得石英毛细管中,在80 ℃下加热反应12 h;
(3)将纳米金球颗粒直径为30 nm的金溶胶置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中;气瓶和钢瓶之间用内径为100 μm内径的石英毛细管连接;步骤(2)所得石英毛细管直接插在气瓶内的金溶胶中;在25 ℃,1 bar压力下,使用氦气钢瓶的氦气,将400倍毛细管体积金溶胶压入毛细管中;
(4)将二巯基壬烷的甲醇溶液置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中,浓度为15%(v/v);气瓶和钢瓶之间用内径为100 μm内径的石英毛细管连接;步骤(3)所得石英毛细管直接插在气瓶内的二巯基壬烷试剂中;在25 ℃,1 bar压力下,使用氦气钢瓶的氦气,将70倍毛细管体积二巯基壬烷试剂压入毛细管中;
(5)将纳米金球颗粒直径为30 nm的金溶胶置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中;气瓶和钢瓶之间用内径为100 μm内径的石英毛细管连接;步骤(4)所得石英毛细管直接插在气瓶内的金溶胶中;在25 ℃,1 bar压力下,使用氦气钢瓶的氦气,将400倍毛细管体积金溶胶压入毛细管中;
(6)重复步骤(4)和(5),重复次数4次;
(7)将巯基十八烷的丙醇溶液置于瓶口具有橡胶塞的气瓶中,浓度为40%(v/v);气瓶和钢瓶之间用内径为100 μm内径的石英毛细管连接;步骤(6)所得石英毛细管直接插在气瓶内的巯基十八烷试剂中;在25 ℃,1 bar压力下,使用氦气钢瓶的氦气,将400倍毛细管体积二巯基壬烷试剂压入毛细管中。
图3为所得40 μm内径固定相为六层纳米金球的液相开管柱横截面的扫描电镜图。
实施例4:将实施例1所得40 μm内径固定相为六层纳米金球的液相开管柱用于500个细胞的蛋白酶解液的色谱分离与Orbitrap MS在线检测:
(1)将实例1所得液相开管柱装入纳升色谱系统;
(2)使用纳升色谱系统的自动进样系统对实施例1所得液相开管柱进样,样品为500个HeLa细胞的蛋白酶解液,进样量为100 fmol;
(3)使用纳升色谱系统洗脱实例1所得液相开管柱中的500个HeLa细胞的蛋白酶解液,流速300 nL/min,梯度洗脱,从99% 流动相A相(水,0.1%甲酸),1% 流动相B相(乙腈,0.1%甲酸)到60%流动相A相,40%流动相B相;
(4)使用Orbitrap MS对步骤(10)所得色谱馏分进行在线检测,离子源为电喷雾离子源。
图4为所得通过Orbitrap MS检测到的40 μm内径固定相为六层纳米金球的液相开管柱500个HeLa细胞的蛋白酶解液馏分的总离子流图。