一种分级快速半定量测试早早孕胶体金试纸及试剂盒的制作方法

本实用新型属于生物检测领域，涉及一种医用检测耗材，具体涉及一种分级快速半定量测试早早孕胶体金试纸及试剂盒。

背景技术：

目前市面上大多数的早早孕检测试纸都是采用胶体金方法进行检测的，但均只能告知被检者有没有怀孕，只能定性检测尿液中是否含有hCG，只有当尿液中hCG浓度≥25mIU/ml时T线才显色，用于育龄妇女的早期妊娠诊断，不能定量检测尿液中hCG的浓度，不能对育龄妇女的早期妊娠作出妊娠周数和是否正常妊娠的预判。而对于一些意外怀孕或月经期不准的女性，在6-8周之前都是没有明显的早孕反应的，此时需要一种经济简单的方法知道怀孕的具体周数，以备对自己后期的工作以及生活作进一步的计划，以及对自己后期的身体健康等起到提示作用。

技术实现要素：

根据上述领域的需求和不足，本实用新型旨在提供一种分级半定量测试早早孕胶体金试纸，本实用新型试纸用于怀孕早期分级半定量快速检测人尿液中hCG的浓度，本实用新型方法利用不同浓度的显示，一是可以用于妊娠早期的检测，预估早期的受孕周数，二是可以根据不同怀孕周数HCG浓度的变化辅助判断是否为正常妊娠，如果浓度一直处于较低浓度，可以推测是否为宫外孕、胎停育等非正常妊娠情况。

本实用新型的技术方案如下：

一种分级半定量测试早早孕胶体金试纸，其特征在于，包括左侧试纸和右侧试纸，两侧试纸在高度方向上包括基板支撑层、反应试剂载体吸附层，反应试剂载体吸附层固定在基板支撑层上，且从加样端到手持端依次设有样品纤维垫，金标纤维垫，硝酸纤维素药膜，手持端吸水材料垫，在金标纤维垫和手持端吸水材料垫上覆盖有保护膜层，在硝酸纤维素药膜上印制有条状的且均与试纸长度方向垂直的检测线和质控线C线，从手持端到加样端，所述左侧试纸上的检测线依次为T3，T1，所述右侧试纸上的检测线依次为T4，T2。

在所述金标纤维垫上包被有胶体金标记的α-hCG单抗；在所述T1、T2、T3、T4线上分别包被有包被浓度为1.0-2.0mg/ml，包被浓度为0.1-0.5mg/ml，包被浓度为0.2-1.0mg/ml，包被浓度为0.05-0.25mg/ml的β-hCG单抗；所述质控线C线包被有羊抗鼠IgG多抗，其包被浓 度为1-2mg/ml。

所述T1、T2、T3、T4线上的β-HCG抗体的单位面积包被量比值为20:2:4:1-8:2:4:1。

所述试纸为测试条二合一、双联板，或双联笔。

一种分级快速半定量测试早早孕胶体金双联试剂盒，其特征在于：包括上述的胶体金试纸。

还包括由盒体和盒盖构成的两个并列的盒封闭体，所述盒体内设有安装胶体金试纸条的定位槽，所述两个盒封闭体之间设有连接装置，两个盒封闭体之间通过连接装置可拆卸式连接。当两个试剂盒封闭体拆开时可分别单独使用。

所述盒盖上均设有加样孔和结果观察孔；当所述胶体金试纸条放置于盒体内的定位槽时，对应于盒盖加样孔处为样品纤维垫；对应于结果观察孔处为硝酸纤维素药膜。

所述连接装置为两个，分别为可拆卸式装置1和可拆卸式装置2，并分别设于两个盒封闭体的对应于加样孔和结果观察孔的边缘处。

两个并列的盒封闭体均为长方形。生产、安装、运输、使用、保存极为方便，简单大方。

技术效果：

本实用新型通过四条检测线实现4种浓度范围的检测，左侧反应区包被有C、T3、T1三条线，T1为高灵敏度，最低能检测出孕3-4周的尿液(25mIU/ml≤hCG浓度＜100mIU/ml)，T3最低能检测出孕5-6周的尿液(300mIU/ml≤hCG浓度＜1000mIU/ml)，右侧反应区包被有C、T4、T2三条线，T2最低能检测孕4-5周的尿液(100mIU/ml≤hCG浓度＜300mIU/ml)，T4最低能检测孕6周以上的尿液(hCG浓度≥1000mIU/ml)。

本实用新型一是采用包被不同浓度的捕捉抗体可以捕捉不同浓度的hCG，来区分不同的检测灵敏度，二是采用包被不同位置的捕捉抗体，来区分不同的检测灵敏度。如果尿液中含有hCG，将与金标α-hCG单抗反应形成复合物，在层析作用下，被预先固定在膜上的β-HCG单抗捕获，在检测区内形成1-4条紫红色条带(T1/T2/T3/T4)，根据尿液中HCG的浓度决定与反应区的T1、T2、T3、T4哪条线反应。

本实用新型产品在使用时，同时在两侧试纸的加样端加入尿液，根据检测线的显色情况从而预测出妊娠早期的hCG水平预估早期的受孕周数，进而辅助判断是否为正常妊娠。

本实用新型可以预测妊娠早期的hCG水平，是否呈递增趋势，从而判断受精后的早期的妊娠周数，根据以下参考值，将测试条设计成四条检测线：

参考值:正常人:0-3mIU/ml

本实用新型可以根据不同检测线的出现，确定尿液中HCG的浓度，从而预测早期的怀孕 周数，怀孕周数对应的HCG浓度(mIU/ml)如下：

孕早期(孕周是从未次月经开始计算)

孕3周5.8-71.2mIU/ml

孕4周9.5-750mIU/ml

孕5周217-7138mIU/ml

孕6周158-31795mIU/m

孕7周3697-163563mIU/mL

孕8周32065-149571mIU/mL

孕9周63803-151410mIU/ml

孕10周46509-186977mIU/ml

孕11-12周27832-210612mIU/ml

孕13-14周13950-62530mIU/ml

孕15周12039-70971mIU/ml

孕16周9040-56451mIU/ml

孕17周8175-55868mIU/ml

孕18周8099-58176mIU/ml

T1敏感性25mIU/ml：T1线会显色，提示最低能检测出孕3-4周的尿液(25mIU/ml≤hCG浓度＜100mIU/ml)。

T2敏感性100mIU/ml：，T1和T2线会显色，提示最低能检测孕4-5周的尿液(100mIU/ml≤hCG浓度＜300mIU/ml)。

T3敏感性300mIU/ml：T1、T2和T3线会显色，提示最低能检测出孕5-6周的尿液(300mIU/ml≤hCG浓度＜1000mIU/ml)。

T4敏感性1000mIU/ml：T1、T2、T3和T4线会显色，提示最低能检测孕6周以上的尿液(hCG浓度≥1000mIU/ml)。

本实用新型产品及方法为半定量测试，可以得知受孕早期尿液中HCG浓度范围值，从而利用不同含量的显示用于受孕早期的检测，可以预估受孕后前四周的情况，其次可以根据不同怀孕周期HCG浓度的变化辅助判断是否为正常妊娠，如果浓度一直处于较低浓度，可以推测是否为宫外孕、胎停育等非正常妊娠情况。

现有方法学试剂的现状及局限

1、25年前经典传统的方法学、产品设计和使用理念；

2、被人诟病的单一定性主观性判读或经验型猜测结果；

3、20多年如一日缺乏创新和研发；

4、良莠不齐的厂家，伪劣品质的粗糙乱造，OEM和假冒品牌，价格贫瘠和市场的混乱，被作死的产品。

本实用新型产品的新方法和试剂特点

1、新概念的引领使用，方法学原剂型生命周期的延展和更新；

2、科学客观地实现了从定性到半定量的快速检测；

3、依然是用尿液样本测试，较比血定量更有实用性、普遍性和经济性；

4、分级区划可以直观地判读妊娠早期周数；

5、辅助性的配件还可以勾画出孕期曲线。

附图说明：

图1本实用新型左侧试纸的俯视图；

图2本实用新型右侧试纸的俯视图；

图3本实用新型试纸的单侧纵向剖面图；

图4本实用新型双联试剂盒俯视图；

图5本实用新型双联试剂盒仰视图；

其中：1-手持端，2-质控线C线，3-检测线T1线，4-MAX标志线，5-加样端，6-硝酸纤维素膜层，7-样品纤维层,8-手持端吸水材料层，9-金标纤维层,10-大无纺布，11-小无纺布，12-手持端胶带，13-箭头胶带,14-基板支撑层，15-检测线T3线，16-检测线T2线，17-检测线T4线，18-盒盖，19-盒体，20-加样孔，21-结果观察孔，22-可拆卸连接装置1，23-可拆卸连接装置2。

具体实施方式：

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本实用新型，并不局限于所述最佳实施方式，不对本实用新型的内容和保护范围构成限制，任何人在本实用新型的启示下或是将本实用新型与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本实用新型相同或相近似的产品，均落在本实用新型的保护范围之内。

根据胶体金免疫层析法检测的原理，将本实用新型的胶体金试纸条的加样端加入尿液，尿液在纤维层材料的毛细作用下沿着试纸条从加样端向手持端移动，当尿液中含有hCG时， 尿液随着层析作用先与胶体金标记的α-hCG单抗反应，当爬行至反应区又与β-HCG单抗反应，根据尿液中hCG的浓度决定与反应区的T1、T2、T3、T4哪条线反应。

实施例1.试剂盒的制备

1试纸条的制备：

1.1包被

1.1.1准备：用pH7.4 10mM PBS稀释β-hCG单抗，分别配制成2.0mg/ml，1.0mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml用于T1、T3、T2、T4线的包被；用pH7.4 10mM PBS稀释抗鼠IgG多抗，配制成2.0mg/ml用于C线的包被。将硝酸纤维素膜裁切成270mm*19mm。

1.1.2包被

1.1.2.1左侧反应区包被

用BIODOT包被机进行包被，左侧反应区的包被尺寸为C线上边缘距膜上边缘为6.5mm，T1下边缘距膜下边缘为6.5mm，然后将C、T3、T1三条线均分，三条线中心线间距约为2.6mm，CT线宽度为0.8±0.1mm，三条线的包被量为0.8μl/cm，包被速度为70mm/s。包被完毕后，干燥6小时，干燥温度控制在35-40℃，湿度≤35％，干燥后加干燥剂4-30℃密封保存。

1.1.2.2右侧侧反应区包被

用BIODOT包被机进行包被，右侧反应区的包被尺寸为C线上边缘距膜上边缘为6.5mm，T2下边缘距膜下边缘为6.5mm，然后将C、T4、T2三条线均分，三条线中心线间距约为2.6mm，CT线宽度为0.8±0.1mm，三条线的包被量为0.8μl/cm，包被速度为70mm/s。包被完毕后，干燥6小时，干燥温度控制在35-40℃，湿度≤35％，干燥后加干燥剂4-30℃密封保存。

1.2标记

1.2.1胶体金颗粒的制备

1.2.1.1准备：所用玻璃仪器为2L三角烧瓶，用之前反复清洗，晾干后备用。配制2％氯金酸40ml和2％柠檬酸三钠50ml备用。

1.2.2.2量取2000ml电阻18MΩ以上超纯水于三角烧瓶中，并量取2％氯金酸溶液40ml也加入三角烧瓶中，此时溶液为黄色，将其加热至沸腾后再加入2％柠檬酸三钠溶液50ml，沸腾后溶液变成紫红色，继续煮沸后5分钟停止加热，并加上盖，室温中自然冷却备用。

1.2.3胶体金标记α-hCG单抗

1.2.3.1首先取胶体金35ml，先加入0.2M K2CO3调节pH，加入量为10μl/ml，然后加入α-hCG单抗与胶体金结合，蛋白浓度为10μg/ml，反应15分钟，然后加入牛血清白蛋白20μl/ml进行封闭，再反应15分钟后，进行10000rpm，30分钟离心，弃上清液，沉淀用10mM Tris 缓冲系统(含有柠檬酸三钠0.3％，1.2％casein，0.05％PVP40，0.7％TW20，2.5％蔗糖，1％葡萄糖，0.1％NaN3)10％复溶，即得胶体金标记α-hCG单抗原液3.5ml。

1.3金标垫的制备

量取10mM Tris缓冲溶液(含有柠檬酸三钠0.3％，1.2％casein，0.05％PVP40，0.7％TW20，2.5％蔗糖，1％葡萄糖，0.1％NaN3)31.5ml，与胶体金标记α-hCG单抗原液3.5ml混合均匀，铺在30cm*30cm玻璃纤维上，干燥6小时，干燥温度控制在35-40℃，湿度≤35％，干燥后加干燥剂4-30℃密封保存。

1.4样品垫的制备：首先配制pH 9.0的10mM Tris缓冲液，并同时加入0.5％casein，1％PVP40，0.1％triton100，0.05％NaN3混匀，量取35ml液体铺在30*30cm玻璃纤维上，干燥6小时，干燥温度控制在35-40℃，湿度≤35％，干燥后加干燥剂4-30℃密封保存。

1.4产品贴板、裁测

将1.1-1.3以上组分分别贴在带有背胶的塑料板上，切成规定条宽的测试条，用hCG阴性尿液进行在线检测，合格后送QC进行半成品检测。

1.5包装

将QC检测合格的测试条组装成条型、板型或笔型，装入铝箔袋中，装干燥剂，封口，装盒，装箱，然后送QC进行成品检测。

2.使用方法：

条型：

1.待测样本、检测试纸条或其他检测用材料等均在室温10℃-30℃平衡后取出。

2.将测试条有箭头的一端插入尿液标本容器中，5秒钟后取出平放，5分钟观察显示结果。

3.测试条插入尿液深度不可超过MAX标志线。

板型：

1.待测样本、检测板或其他检测用材料等均在室温10℃-30℃平衡后沿铝箔袋切口撕开，取出检测板及滴管。

2.将测试板平放，用滴管垂直加2-3滴尿样于各加样孔中。5分钟在观察孔中观察显示结果。

笔型：

1.待测样本、检测笔或其他检测用材料等均在室温10℃-30℃平衡后沿铝箔袋切口撕开，取出检测笔。

2.将笔帽拔开，拿住检测试笔手持端，将尿液直接淋在试笔采集孔处约5秒钟左右。5分钟后在观察孔中观察显示结果。

3.判读结果

3.1.1阳性

在质控线位置(C)及检测线位置(T1-T4)显色，提示可能已怀孕。

3.1.1.1 C线、T1线显色，提示：25mIU/ml≤hCG浓度＜100mIU/ml，可能怀孕3-4周。

3.1.1.2 C线、T1和T2线显色，提示：100mIU/ml≤hCG浓度＜300mIU/ml，可能怀孕4-5周。

3.1.1.3 C线、T1、T2和T3线显色，提示：300mIU/ml≤hCG浓度＜1000mIU/ml，可能怀孕5-6周。

3.1.1.4 C线、T1、T2、T3和T4线显色，提示：hCG浓度≥1000mIU/ml，可能怀孕6周以上。

3.1.2阴性

仅在质控线位置(C)显色，提示hCG浓度＜25mIU/ml,可能未怀孕或怀孕浓度很低，需隔1-2天后再测。

3.1.3无效

质控线不显色，或仅在检测线位置(T1-T4)显色，表明实验失败或产品失效。

包被及检测情况如表1：

表1如下

结果分析：

通过以上结果可知，包被浓度和最低检测浓度呈反向关系，包被浓度越高，所能检测的浓度越低；捕捉抗体先后和最低检测浓度呈反向关系，先和T线反应的灵敏度较高，也就是所能检测的浓度较低。

实施例2.本实用新型产品的效果性能验证。

表2

结果分析：

通过对怀孕前五周尿液的检测，可以看出T1-T4检测线的逐渐显色，能大概判断孕妇尿液中HCG浓度以及怀孕周数。

实施例3.本实用新型产品与现有技术的产品的对比试验

表3

结果分析：

根据以上结果得知，现有技术只能区分阴性和阳性，而本实用新型产品可以根据不同检测线的出现大概判读孕妇尿液中hCG浓度以及怀孕周数。

实施例4.本实用新型产品的效果验证

表4型式检验报告

结果分析：

根据以上结果得知，本实用新型产品的物理性状、最低检测限、特异性、重复性、稳定性、批间差均满足目前行业标准，而且在此基础上区分了怀孕早期的hCG浓度范围。