本发明涉及利用拉曼光谱分析法来分析高浓度蛋白质溶液的方法和分析装置。
背景技术：
近年来，不断开发使用核酸或蛋白质等生物材料的医药品。例如具有使用抗体的抗体医药品。抗体是蛋白质的一种，使用抗体医药品等蛋白质的医药品是蛋白质溶液的形式。为了在患者体内发挥效果，用作医药品的蛋白质溶液是高浓度的溶液。蛋白质溶液达到高浓度时，因蛋白质的分子间的相互作用，有时会发生蛋白质的结构变化或蛋白质凝集等蛋白质变性。由于蛋白质变性时作为医药品的效果也变化，所以为了进行抗体医药品的制造和质量管理，需要测量蛋白质结构是否变化等高浓度的蛋白质溶液的状态。
测量高浓度的蛋白质溶液的状态比较困难，以往，测量稀释的蛋白质溶液，通过外推测量结果来推测高浓度的蛋白质溶液的状态。但是，在上述方法中，不能准确地测量高浓度的蛋白质溶液的状态。直接测量高浓度蛋白质溶液的状态的方法有x线小角度散射法和中子散射法。此外，在专利文献1中公开了使用拉曼光谱分析法来精制抗体。
现有技术文献
专利文献1：日本专利公开公报特表2013-537235号
x线小角度散射法和中子散射法存在如下问题：装置的规模大、测量成本大，并且不能得到与蛋白质的结构相关的信息。相对于此，拉曼光谱分析法的测量成本比较小，能够直接测量高浓度蛋白质溶液的状态并得到与蛋白质的结构相关的信息。但是，并未确立有如下方法：利用拉曼光谱分析法来分析高浓度蛋白质溶液的状态，并且评价蛋白质溶液是否适用于医药品。
技术实现要素：
鉴于上述问题，本发明的目的在于提供分析方法和分析装置，利用拉曼光谱分析法来分析蛋白质溶液，以便评价是否适用于医药品。
本发明提供一种分析方法，利用拉曼光谱分析法来分析蛋白质溶液，所述分析方法的特征在于，利用拉曼光谱分析法，分别取得使特定蛋白质溶解的多种浓度的蛋白质溶液的拉曼光谱，基于包含在拉曼光谱中的一个或多个规定峰，对各浓度计算根据蛋白质溶液中的蛋白质分子之间的相互作用而增减的指标，根据对各浓度计算的所述指标确定浓度范围，在该浓度范围内相对于浓度的增大而变化的所述指标的变化量是在规定范围之内，基于确定的浓度范围，确定成为所述特定蛋白质是否变性的判断基准的浓度阈值，将确定的阈值与对所述特定蛋白质确定的特定浓度值进行比较。
本发明还提供一种分析方法，利用拉曼光谱分析法来分析蛋白质溶液，所述分析方法的特征在于，利用拉曼光谱分析法，分别取得使特定蛋白质溶解的多种浓度的蛋白质溶液的拉曼光谱，基于包含在拉曼光谱中的一个或多个规定峰，对各浓度计算根据蛋白质溶液中的蛋白质分子之间的相互作用而增减的指标，基于相对于浓度的变化的所述指标的变化，确定成为所述特定蛋白质是否变性的判断基准的浓度阈值。
本发明的分析方法的特征在于，所述指标是表示蛋白质中的酪氨酸的oh基作为氢供体起作用的同时也作为氢受体起作用的程度的、拉曼光谱中规定的两个峰的强度比。
本发明的分析方法的特征在于，所述指标是表示蛋白质中的色氨酸所含的吲哚环的n-h位点在作为氢供体起作用的同时也作为氢受体起作用的程度的、拉曼光谱中规定的两个峰的强度比。
本发明的分析方法的特征在于，所述指标是表示蛋白质中色氨酸的结构上的规定角度的宽度的、拉曼光谱中规定峰的宽度。
本发明的分析方法的特征在于，所述指标是起因于蛋白质中的苯基丙氨酸的规定峰与起因于酰胺基的规定峰的强度比。
本发明的分析方法的特征在于，在与多种浓度相关的拉曼光谱间，对起因于蛋白质中的酰胺基的规定峰的峰形状进行比较，判断与低浓度下的峰形状相比高浓度的峰形状是否变化，与低浓度下的峰形状相比高浓度的峰形状变化时，判断为在峰形状变化的浓度以上的浓度下所述蛋白质溶液不适合于医药品。
本发明的分析方法的特征在于，基于所述阈值与所述特定浓度值的比较结果，判断所述蛋白质溶液是否适合于医药品，所述蛋白质溶液不适合于医药品时，对调整了所述特定蛋白质以外的成分的蛋白质溶液反复进行分析。
本发明还提供一种分析装置，基于拉曼光谱来分析蛋白质溶液，所述分析装置的特征在于包括：存储部，存储对特定蛋白质确定的特定浓度值、以及对使所述特定蛋白质溶解的多种浓度的蛋白质溶液分别取得的拉曼光谱；计算部，基于包含在拉曼光谱中的一个或多个规定峰，对各浓度计算根据蛋白质溶液中的蛋白质分子之间的相互作用而增减的指标；第一确定部，根据对各浓度计算的所述指标确定浓度范围，在该浓度范围内相对于浓度的增大而变化的所述指标的变化量是在规定范围之内；第二确定部，基于确定的浓度范围，确定成为所述特定蛋白质是否变性的判断基准的浓度阈值；以及比较部，将确定的阈值与所述特定浓度值进行比较。
本发明还提供一种分析装置，基于拉曼光谱来分析蛋白质溶液，所述分析装置的特征在于包括：存储部，存储对特定蛋白质确定的特定浓度值、以及对使所述特定蛋白质溶解的多种浓度的蛋白质溶液分别取得的拉曼光谱；计算部，基于包含在拉曼光谱中的一个或多个规定峰，对各浓度计算根据蛋白质溶液中的蛋白质分子之间的相互作用而增减的指标；以及确定部，根据相对于浓度变化的所述指标的变化，确定成为所述特定蛋白质是否变性的判断基准的浓度阈值。
本发明还提供一种分析装置，对蛋白质溶液进行分析，所述分析装置的特征在于包括：存储部，存储有对使特定蛋白质溶解的蛋白质溶液利用拉曼光谱分析法预先确定的、成为所述特定蛋白质是否变性的判断基准的浓度阈值；以及比较部，将对所述特定蛋白质确定的特定浓度值与所述阈值进行比较。
在本发明中，取得多种浓度的蛋白质溶液的拉曼光谱，基于拉曼光谱，确定与蛋白质分子之间的相互作用对应的指标相对于浓度的变化而几乎不变化的浓度范围，确定成为蛋白质是否变性的判断基准的浓度阈值，并且与作为医药品所需要的蛋白质溶液的浓度进行比较。在指标相对于浓度的变化而几乎不变化的浓度范围内，蛋白质分子之间的相互作用饱和，蛋白质有可能变性，基于上述浓度范围，可以确定蛋白质能够变性的浓度阈值。通过对确定的阈值与作为医药品所需要的蛋白质溶液的浓度进行比较，可以评价作为医药品所需要的浓度下的蛋白质溶液的状态。
在本发明中，取得多种浓度的蛋白质溶液的拉曼光谱，基于拉曼光谱，计算与蛋白质分子之间的相互作用对应的指标，基于与浓度变化对应的指标的变化，确定成为蛋白质是否变性的判断基准的浓度阈值。基于蛋白质分子之间的相互作用在饱和时大体固定的指标等、根据拉曼光谱得到的指标相对于浓度变化的变化，可以确定蛋白质能够变性的浓度阈值。
此外，在本发明中，使用表示酪氨酸的oh基作为氢供体起作用的同时也作为氢受体起作用的程度的指标。蛋白质分子之间相互作用时，酪氨酸的oh基作为氢供体和氢受体两者起作用。上述指标相对于浓度的变化而几乎不变化时，蛋白质分子之间的相互作用饱和。因此，通过使用上述指标，可以确定蛋白质分子之间的相互作用饱和的浓度范围。
此外，在本发明中，使用表示色氨酸中包含的吲哚环的n-h位点作为氢供体起作用的同时也作为氢受体起作用的程度的指标。蛋白质分子之间相互作用时，n-h位点作为氢供体和氢受体两者起作用。上述指标相对于浓度的变化而几乎不变化时，蛋白质分子之间的相互作用饱和。因此，通过使用上述指标，可以确定蛋白质分子之间的相互作用饱和的浓度范围。
此外，在本发明中，使用表示色氨酸的结构上的规定角度的宽度的指标。蛋白质分子之间的相互作用大时，角度根据相互作用而变化，角度的偏差变大，角度的分布的宽度变大。上述指标相对于浓度的变化而几乎不变化时，蛋白质分子之间的相互作用饱和。因此，通过使用上述指标，可以确定蛋白质分子之间的相互作用饱和的浓度范围。
此外，在本发明中，将起因于蛋白质中的苯基丙氨酸的规定峰与起因于酰胺基的规定峰的强度比作为指标使用。在较低浓度下上述指标大体固定，在蛋白质凝集的浓度下上述指标变化。上述指标相对于浓度的变化而变化时，蛋白质凝集。因此，通过使用上述指标，可以确定蛋白质凝集的浓度范围。
此外，在本发明中，起因于酰胺基的峰的峰形状在高浓度下变化时，判断为在峰形状变化的浓度以上的浓度下蛋白质溶液不适合于医药品。峰形状变化表示在蛋白质溶液中未保持蛋白质的整体结构。在峰形状变化的浓度以上的浓度下未保持蛋白质的整体结构，导致蛋白质带来的效果发生变化，所以判断为在作为医药品所需要的浓度下蛋白质溶液不适合于医药品。
此外，在本发明中，基于确定的阈值与作为医药品所需要的蛋白质溶液的浓度的比较结果，判断蛋白质溶液是否适合于医药品。判断为蛋白质溶液不适合于医药品时，对调整了蛋白质以外的成分的蛋白质溶液反复进行分析。通过调整蛋白质以外的成分，可以改变ph等蛋白质溶液的条件。通过改变蛋白质溶液的条件，有时蛋白质变性的浓度变化。通过在每次改变蛋白质溶液的条件时进行分析，可以得出适合于医药品的蛋白质溶液的条件。
在本发明中，作为医药品所需要的浓度在蛋白质能够变性的浓度阈值以上时，能够判断为蛋白质溶液不适合于医药品等、评价特定蛋白质溶液是否适合于医药品。因此，本发明具有良好的效果，能够简单地评价使抗体等蛋白质溶解的蛋白质溶液是否适合于医药品等。
附图说明
图1是表示实施方式1的蛋白质溶液的分析方法的步骤的示意图。
图2是表示用于实施方式1的拉曼光谱分析装置的构成的框图。
图3是表示拉曼光谱的例子的特性图。
图4是表示实施方式1的分析装置的内部构成的框图。
图5是放大了蛋白质溶液的拉曼光谱的特性图。
图6是表示色氨酸的化学结构式的图。
图7是表示实施方式1的分析装置执行的处理步骤的流程图。
图8是表示包含在酪氨酸的拉曼光谱带中的856cm-1和837cm-1的峰强度比(856/837cm-1)相对于浓度的变化例(实心圆)、以及包含在色氨酸的拉曼光谱带中的870cm-1和877cm-1的峰强度比(870/877cm-1)相对于浓度的变化例(空心圆)的特性图。
图9是表示包含在色氨酸的拉曼光谱带中的1555cm-1的峰宽度相对于浓度的变化例的特性图。
图10是表示实施方式2的分析装置的内部构成的框图。
图11是表示实施方式2的分析装置执行的处理步骤的流程图。
图12是表示实施方式3的分析装置执行的处理步骤的流程图。
图13是表示igg水溶液的酰胺i的拉曼光谱的例子的特性图。
图14是表示根据igg水溶液的酪氨酸的拉曼光谱得到的856/830cm-1的强度比相对于浓度的变化例的特性图。
图15是表示根据igg水溶液的色氨酸的拉曼光谱得到的1550cm-1的峰宽度相对于浓度的变化例的特性图。
图16是表示根据igg水溶液的拉曼光谱得到的1004/1240cm-1的强度比相对于浓度的变化例的特性图。
具体实施方式
下面，基于表示本发明实施方式的附图对本发明进行详细说明。
(实施方式1)
为了在患者的体内发挥效果，预先确定用作抗体医药品等医药品的蛋白质溶液的所需要的浓度。在本发明中，利用拉曼光谱分析法，确定蛋白质溶液中的蛋白质能够变性的浓度阈值，通过对确定的阈值与作为医药品所需要的浓度进行比较，评价蛋白质溶液是否适用于医药品。在本发明中作为分析对象的蛋白质包含肽。蛋白质溶液达到某种程度以上的高浓度时，因蛋白质分子之间的相互作用，有时会发生蛋白质的结构变化或蛋白质凝集等蛋白质变性。蛋白质能够变性的浓度阈值是成为用于判断在各浓度下蛋白质是否变性的基准的浓度阈值。蛋白质溶液的浓度在上述阈值以上时，能够推测为蛋白质溶液中的蛋白质变性。图1是表示实施方式1的蛋白质溶液的分析方法的步骤的示意图。分析蛋白质溶液的分析者，首先制作使特定蛋白质溶解的多种浓度的蛋白质溶液。蛋白质溶液是水溶液，可以包含特定蛋白质以外的成分。例如，蛋白质溶液在缓冲溶液中溶解有蛋白质。另外，分析者可以不制作蛋白质溶液而分析其他人员制作的蛋白质溶液。
接着，分析者利用拉曼光谱分析法取得各浓度的蛋白质溶液的拉曼光谱。为了取得拉曼光谱，利用后述的拉曼光谱分析装置。接着，基于各浓度的拉曼光谱，确定蛋白质能够变性的浓度阈值。包含在拉曼光谱中的多个峰内，根据蛋白质分子之间的相互作用而变化的峰，在浓度增加某种程度而相互作用饱和时，相对于浓度的增大而几乎不变化。在蛋白质分子之间的相互作用饱和的状态下，蛋白质因相互作用而变性的可能性高。因此，通过对各浓度的拉曼光谱进行比较，可以确定蛋白质能够变性的浓度阈值。例如，将包含在即使浓度增大、拉曼光谱也不变化的浓度范围内的浓度的最小值作为蛋白质能够变性的浓度阈值。接着，对蛋白质能够变性的浓度阈值与作为医药品所需要的蛋白质溶液的浓度进行比较。在阈值的确定和比较中，可以使用后述的分析装置。接着，基于比较结果，判断分析对象的蛋白质溶液是否适用于医药品。例如，作为医药品所需要的浓度在蛋白质能够变性的浓度阈值以上时，判断为在作为医药品所需要的浓度下蛋白质变性。由于蛋白质变性的蛋白质溶液作为医药品的效果变化，所以分析者判断为分析对象的蛋白质溶液不适合于医药品。相反，作为医药品所需要的浓度小于蛋白质能够变性的浓度阈值时，判断为在作为医药品所需要的浓度下蛋白质不变性。由于作为医药品的效果不变化，所以分析者判断为分析对象的蛋白质溶液适合于医药品。
在判断蛋白质溶液是否适合于医药品之后，结束分析。另外，也可以继续进行分析。分析者判断为蛋白质溶液不适合于医药品时，制作改变条件的多种浓度的蛋白质溶液，再次从取得拉曼光谱开始反复进行分析。为了改变蛋白质溶液的条件，调整蛋白质溶液中的特定蛋白质以外的成分。例如，在蛋白质溶液中，除了特定蛋白质以外，还包含用于调整ph的各种酸、碱、盐或作为稳定剂的糖类，改变这些成分的量或种类。通过改变条件，有时蛋白质溶液中的蛋白质变性的浓度会发生变化。因此，每次改变蛋白质溶液的条件时进行分析，可以得出适用于医药品的蛋白质溶液的条件。例如，分析者得出蛋白质能够变性的浓度阈值超过作为医药品所需要的浓度的蛋白质溶液的条件。
图2是表示用于实施方式1的拉曼光谱分析装置的构成的框图。拉曼光谱分析装置向蛋白质溶液照射单色光，检测产生的拉曼散射光。拉曼光谱分析装置包括产生单色光的光源21。光源21例如是激光光源。光源21向保持在试样单元10中的蛋白质溶液1照射单色光。图2中由实线箭头表示光源21照射的单色光。拉曼光谱分析装置包括分光器22和检测器23。在照射单色光的蛋白质溶液1中产生拉曼散射光，产生的拉曼散射光射入分光器22。图2中由虚线箭头表示拉曼散射光。分光器22对射入的拉曼散射光进行分光。检测器23检测分光器22分光的各波长的光，并且输出与各波长的光的检测强度对应的信号。例如，检测器23由ccd(chargecoupleddevice电荷耦合器件)光传感器或光电倍增管构成。
此外，拉曼光谱分析装置包括控制各部分的动作的控制部24。光源21、分光器22和检测器23与控制部24连接。控制部24控制光源21的导通和断开。控制部24对由分光器22分光并由检测器23检测的光的波长进行控制。检测器23向控制部24输出与光的检测强度对应的信号。检测器23输出的信号输入控制部24，并且控制部24基于由分光器22分光的光的波长和输入的信号所示的光的检测强度，生成拉曼光谱。分析者事先准备保持多种浓度的蛋白质溶液1的试样单元10，每次更换保持各浓度的蛋白质溶液1的试样单元10时，由拉曼光谱分析装置生成拉曼光谱，由此取得各浓度的蛋白质溶液1的拉曼光谱。
图3是表示拉曼光谱的例子的特性图。图中的横轴由波数(cm-1)的单位表示拉曼位移，纵轴由计数的单位表示拉曼散射光的强度。作为蛋白质的例子使用从鸡蛋白抽出的溶菌酶，使溶菌酶溶解在ph8.0的tris盐酸缓冲溶液中，制作溶菌酶溶液(蛋白质溶液)。图3所示的拉曼光谱从下依次是2.5、5、10、20、50、100、150、200、300(mg/ml)的浓度的溶菌酶溶液的拉曼光谱。图3中，2.5和5(mg/ml)的浓度的拉曼光谱几乎重合。
拉曼光谱分析装置还包括分析蛋白质溶液的分析装置3。控制部24与分析装置3连接。图4是表示实施方式1的分析装置3的内部构成的框图。分析装置3利用个人计算机等计算机构成。分析装置3包括：进行计算的cpu(centralprocessingunit)31、存储伴随计算而产生的临时数据的ram(randomaccessmemory)32、从光盘等存储介质4读取信息的驱动部33以及硬盘等非易失性存储部34。此外，分析装置3还包括接收使用者的操作的键盘或鼠标等操作部35、液晶显示器等显示部36和接口部37。接口部37与控制部24连接。cpu31使驱动部33读取存储在存储介质4中的计算机程序40，并且将读取的计算机程序40存储在存储部34中。cpu31根据需要从存储部34将计算机程序40加载到ram32中，按照加载的计算机程序40来执行分析装置3所需要的处理。另外，计算机程序40也可以从分析装置3的外部下载。
控制部24将表示生成的拉曼光谱的拉曼光谱数据向分析装置3输出。分析装置3利用接口部37接收拉曼光谱数据，cpu31将拉曼光谱数据存储在存储部34中。存储部34对各浓度存储有拉曼光谱数据。分析者对操作部35进行操作，输入表示蛋白质溶液1的浓度的浓度数据，cpu31将浓度数据存储在存储部34中。表示各浓度的拉曼光谱的拉曼光谱数据与浓度数据所示的各浓度相互关联。通过由分析者对操作部35进行操作来进行拉曼光谱与浓度的关联。此外，存储部34存储有特定浓度值，该特定浓度值表示作为医药品所需要的蛋白质溶液的浓度。通过由分析者对操作部35进行操作来输入浓度值。
分析装置3基于拉曼光谱中包含的特定峰相对于浓度的增加而产生的变化，进行分析蛋白质溶液的处理。图5是放大了蛋白质溶液的拉曼光谱的特性图。图中的横轴表示拉曼位移，纵轴表示拉曼散射光的强度。拉曼光谱中包含的峰内的1650cm-1的峰是起因于蛋白质中的酰胺基的峰。酰胺基构成蛋白质中的氨基酸的主链。保持蛋白质的整体结构时出现该峰。
拉曼光谱中包含的峰内的856cm-1和837cm-1的峰起因于酪氨酸。酪氨酸是构成蛋白质的氨基酸之一。856cm-1的峰强度除以837cm-1的峰强度的强度比(以下记载为856/837cm-1)表示酪氨酸的水合状态。856/837cm-1的强度比小到某种程度时，表示包含在酪氨酸中的oh基成为氢供体，并且伴随强度比变大，表示oh基作为氢供体和受体两者起作用。其中，o是碳，h是氢。如果蛋白质溶液的浓度升高，则蛋白质分子之间的距离接近，所以蛋白质分子之间相互作用，因此酪氨酸的oh基开始作为受体起作用，856/837cm-1的强度比变大。即，856/837cm-1的强度比表示蛋白质分子与其他蛋白质分子相互作用的比例。在某种程度以上的高浓度下，蛋白质分子之间的相互作用饱和，856/837cm-1的强度比大体固定。
拉曼光谱中包含的峰内的1555cm-1的峰起因于色氨酸。色氨酸是构成蛋白质的氨基酸之一。更具体地说，1555cm-1的峰起因于色氨酸中的吲哚环的c＝c伸缩振动。其中，c是碳。图6是表示色氨酸的化学结构式的图。1555cm-1的峰起因于图6中赋予2来表示的c2和赋予3来表示的c3之间的c＝c伸缩振动。1555cm-1的峰宽度表示与c2＝c3-cα-cβ的结构相关的信息，该c2＝c3-cα-cβ的结构包含图6中赋予α来表示的cα和赋予β来表示的cβ。更具体地说，表示c2＝c3与cα-cβ之间的扭转角的状态。峰宽度窄时表示扭转角的偏差小，峰宽度宽时表示扭转角的偏差大。如果蛋白质溶液的浓度升高，则因蛋白质分子之间的相互作用，扭转角变化，扭转角的偏差变大、扭转角的分布的宽度变大，1555cm-1的峰的峰宽度变宽。即，1555cm-1的峰宽度也表示蛋白质分子与其他蛋白质分子相互作用的比例。在某种程度以上的高浓度下，蛋白质分子之间的相互作用饱和，峰宽度大体固定。
拉曼光谱中包含的峰内的877cm-1的峰起因于色氨酸中的吲哚环的n-h位点。其中，n是氮。图6中表示了吲哚环的n-h位点。877cm-1的峰表示吲哚环的n-h位点的状态，在氢键较强的情况下，峰宽度向低波数侧扩大。870cm-1的峰强度除以877cm-1的峰强度的强度比(以下记载为870/877cm-1)表示色氨酸的氢键的状态。870/877cm-1的强度比小到某种程度时，表示n-h位点成为氢供体，并且伴随强度比变大，表示n-h位点作为氢供体和受体两者起作用。蛋白质溶液是低浓度时，n-h位点主要被水包围，与水形成氢键而作为氢供体起作用。蛋白质溶液是高浓度时，其他蛋白质分子位于n-h位点周围，蛋白质分子与水的氢键更换为蛋白质分子之间的相互作用，氢键变得更强，n-h位点作为氢供体和受体两者起作用。即，870/877cm-1的强度比也表示蛋白质分子与其他蛋白质分子相互作用的比例。在某种程度以上的高浓度下，蛋白质分子之间的相互作用饱和，870/877cm-1的强度比大体固定。
图7是表示实施方式1的分析装置3执行的处理步骤的流程图。cpu31按照计算机程序40执行以下处理。cpu31从存储部34向ram32读取多种浓度的拉曼光谱数据，并且对多种浓度的拉曼光谱中包含的1650cm-1的峰形状进行比较(s1)。接着，cpu31基于比较结果，判断与低浓度下的峰形状相比高浓度下的峰形状是否变化(s2)。例如，在s1中，cpu31对多种浓度的拉曼光谱以使1650cm-1的峰强度相同的方式，使包含1650cm-1的规定波数范围的拉曼散射光强度归一化，并且计算在多种浓度的拉曼光谱之间对规定波数范围的各波数的拉曼散射光强度的差进行平方并相加的差的平方和。cpu31计算最小浓度与其他浓度之间的差的平方和。在s2中，cpu31将由s1计算的差的平方和与规定的容许量进行比较，差的平方和超过容许量时，判断为峰形状变化。与低浓度相比在高浓度下1650cm-1的峰形状发生变化，是表示在高浓度的蛋白质溶液中未保持蛋白质的整体结构。推测在高浓度下因蛋白质分子的相互作用而不能保持蛋白质的整体结构。未保持蛋白质的整体结构时，蛋白质带来的效果发生变化。在溶菌酶溶液中，在1650cm-1的峰形状上未出现变化。
1650cm-1的峰形状变化时(s2：是)，cpu31判断与低浓度时相比1650cm-1的峰形状发生变化的浓度是否在特定浓度值以下，该特定浓度值表示作为医药品所需要的蛋白质溶液的浓度(s3)。在s3中，cpu31确定峰形状发生变化的浓度，并且从存储部34向ram32读取特定浓度值，对确定的浓度与浓度值进行比较。峰形状变化的浓度在特定浓度值以下时(s3：是)，cpu31判断为分析对象的蛋白质溶液不适合于医药品(s4)。峰形状变化的浓度在特定浓度值以下时，在作为医药品所需要的浓度下未保持蛋白质的整体结构，因此蛋白质溶液不适合于医药品。接着，cpu31使显示部36显示判断结果(s5)，并且使处理结束。
1650cm-1的峰形状不变化时(s2：否)或峰形状变化的浓度超过特定浓度值时(s3：否)，cpu31计算多种浓度的拉曼光谱中包含的856cm-1和837cm-1的峰的强度比(856/837cm-1)(s6)。接着，cpu31确定856/837cm-1的强度比相对于浓度的变化而大体固定的浓度范围(s7)。在s7中，cpu31计算相对于浓度变化的856/837cm-1的强度比的变化量，将变化量在预先确定的微小的规定范围内的浓度范围确定为强度比大体固定的浓度范围。显然在上述浓度范围内蛋白质溶液内的蛋白质分子之间的相互作用大体饱和，蛋白质有可能变性。
图8是表示酪氨酸的拉曼光谱带中包含的856cm-1和837cm-1的峰的强度比(856/837cm-1)相对于浓度的变化例(实心圆)、以及色氨酸的拉曼光谱带中包含的870cm-1和877cm-1的峰的强度比(870/877cm-1)相对于浓度的变化例(空心圆)的特性图。横轴表示浓度，纵轴表示峰的强度比。图8中表示根据溶菌酶溶液的拉曼光谱计算的峰的强度比。图中由实心圆表示856/837cm-1的强度比，由空心圆表示870/877cm-1的强度比。在图8所示的例子中，856/837cm-1的强度比在100mg/ml以上的浓度范围内大体固定。
接着，cpu31确定多种浓度的拉曼光谱中包含的1555cm-1的峰宽度(s8)，并且确定峰宽度相对于浓度变化而大体固定的浓度范围(s9)。在s9中，cpu31计算相对于浓度变化的1555cm-1的峰宽度的变化量，并且将变化量在预先确定的微小的规定范围内的浓度范围，确定为峰宽度大体固定的浓度范围。s6、s8和s10的处理相当于本发明的计算部，s7、s9和s11的处理相当于本发明的第一确定部。
图9是表示色氨酸的拉曼光谱带中包含的1555cm-1的峰宽度相对于浓度的变化例的特性图。横轴表示浓度，纵轴表示峰宽度。图9中表示根据溶菌酶溶液的拉曼光谱计算的峰宽度。在图9所示的例子中，1555cm-1的峰宽度在100mg/ml以上的浓度范围内大体固定。显然在上述浓度范围内蛋白质溶液内的蛋白质分子之间的相互作用大体饱和，蛋白质有可能变性。
接着，cpu31计算多种浓度的拉曼光谱中包含的870cm-1和877cm-1的峰的强度比(870/877cm-1)(s10)，并且确定870/877cm-1的强度比相对于浓度变化而大体固定的浓度范围(s11)。在s11中，cpu31计算相对于浓度变化的870/877cm-1的强度比的变化量，并且将变化量在预先确定的微小的规定范围内的浓度范围，确定为强度比大体固定的浓度范围。在图8所示的例子中，870/877cm-1的强度比在150mg/ml以上的浓度范围内大体固定。显然在上述浓度范围内蛋白质溶液内的蛋白质分子之间的相互作用大体饱和，蛋白质有可能变性。
接着，cpu31确定分析对象的蛋白质溶液中包含的蛋白质能够变性的浓度阈值(s12)。例如，cpu31在取得拉曼光谱的多种浓度内，将由s7、s9和s11确定的浓度范围的至少一个中包含的浓度的最小值，确定为阈值。在溶菌酶溶液的例子中，阈值是100mg/ml。确定的阈值以上的浓度包含在由s7、s9或s11确定的浓度范围内。因此，在阈值以上的浓度下，蛋白质溶液内的蛋白质分子之间的相互作用大体饱和，蛋白质变性的可能性高。
另外，cpu31可以进行将以下值确定为阈值的处理，该值小于由s7、s9和s11确定的浓度范围的至少一个中包含的浓度的最小值。显然在使根据蛋白质分子之间的相互作用而变化的指标成为固定的、由s7、s9或s11确定的浓度范围内，蛋白质会变性，但是实际上蛋白质从更低的浓度起开始变性的可能性高。为了更可靠地排除在高浓度下蛋白质变性的蛋白质溶液，希望将判断蛋白质是否变性的基准设定得更低。在此，在s12中，根据指标成为固定的浓度范围的最小值，按照规定的规则，将比该最小值小的值确定为阈值。例如，cpu31将以下值确定为阈值，该值为从由s7、s9和s11确定的浓度范围的至少一个中包含的浓度的最小值中减去正的规定值。此外，例如，cpu31可以将以下值确定为阈值，该值为将由s7、s9和s11确定的浓度范围的至少一个中包含的浓度的最小值乘以大于0且小于1的规定值。s12的处理相当于本发明的第二确定部。
接着，cpu31对确定的浓度值与表示作为医药品所需要的蛋白质溶液的浓度的特定浓度值进行比较(s13)。在s13中，cpu31对从存储部34读取的浓度值与阈值进行比较。s13的处理相当于本发明的比较部。cpu31使显示部36显示比较结果(s14)，并且使处理结束。分析者基于显示在显示部36中的比较结果，以上述方式判断分析对象的蛋白质溶液是否适合于医药品。例如，特定浓度值在阈值以上时，由于在作为医药品所需要的浓度下蛋白质变性而导致作为医药品的效果发生变化，所以分析者判断为分析对象的蛋白质溶液不适合于医药品。另外，分析装置3对于s1～s14处理内的s6～s7处理、s8～s9处理和s10～s11处理，也能够以其他顺序执行或并行执行。此外，分析装置3也可以执行省略s6～s7处理、s8～s9处理和s10～s11处理内任意一个或两个的处理。
如上所述，在本实施方式中，取得多种浓度的蛋白质溶液的拉曼光谱，基于拉曼光谱，确定蛋白质溶液中的蛋白质能够变性的浓度阈值，并且与作为医药品所需要的蛋白质溶液的浓度进行比较。通过将856/837cm-1的强度比、1555cm-1的峰宽度或870/877cm-1的强度比用作表示蛋白质分子与其他蛋白质分子相互作用的比例的指标，可以确定蛋白质分子之间的相互作用饱和而蛋白质能够变性的浓度阈值。通过对确定的阈值与作为医药品所需要的蛋白质溶液的浓度进行比较，能够评价作为医药品所需要的浓度在阈值以上时蛋白质溶液不适合于医药品等、特定蛋白质溶液是否适合于医药品。因此，通过本实施方式，可以简单地评价使抗体等蛋白质溶解的蛋白质溶液是否适合于医药品。
另外，在本发明中，可以将856/837cm-1的强度比或870/877cm-1的强度比的倒数用作指标。此外，在本实施方式中表示了利用拉曼光谱中的856cm-1、837cm-1、870cm-1、877cm-1、1555cm-1和1650cm-1的峰的方式，但是有时根据蛋白质溶液的条件，上述峰的拉曼位移的值会偏移。即使上述峰的拉曼位移的值偏移时，也同样可以执行蛋白质溶液的分析方法。此外，在本实施方式中，表示了控制部24与分析装置3分离的方式，但是拉曼光谱分析装置也可以是控制部24和分析装置3一体的方式。此外，在本实施方式中表示了分析装置3包含在拉曼光谱分析装置中的方式，但是也可以是分析装置3与拉曼光谱分析装置分离的方式。上述方式的分析装置3输入并存储由拉曼光谱分析装置生成的拉曼光谱数据。此外，在本发明中，也可以不使用分析装置3来分析蛋白质溶液。
(实施方式2)
在本实施方式中，在具有想要用作医药品的特定浓度的蛋白质溶液的情况下，分析者评价该蛋白质溶液是否适合于医药品。图10是表示实施方式2的分析装置5的内部构成的框图。分析装置5包括：cpu51、ram52、驱动部53、存储部54、操作部55和显示部56。cpu51使驱动部53读取存储在未图示的存储介质中的计算机程序57，并且将读取的计算机程序57存储在存储部54中。计算机程序57也可以从分析装置5的外部下载。根据需要，cpu51将计算机程序57从存储部54加载到ram52中，并且按照加载的计算机程序57来执行分析装置5所需要的处理。利用与实施方式1相同的分析方法，对用作医药品的候选的蛋白质溶液预先确定蛋白质能够变性的浓度阈值，并且将确定的阈值预先存储在存储部54中。例如，分别与多种蛋白质的种类关联来存储阈值。
图11是表示实施方式2的分析装置5执行的处理步骤的流程图。cpu51按照计算机程序57执行以下处理。预先测量分析对象的蛋白质溶液的浓度。分析者对操作部55进行操作，输入蛋白质溶液的浓度值。cpu51利用操作部55来接收浓度值，并将接收的浓度值存储在ram52中(s21)。此时，分析装置5可以与浓度值一起接收蛋白质的种类，也可以进一步接收蛋白质溶液的条件。接着，cpu51对接收的浓度值与蛋白质能够变性的浓度阈值进行比较(s22)。在s22中，cpu51从存储部54读取阈值，并且对读取的阈值与浓度值进行比较。例如，cpu51与接收的蛋白质的种类关联地读取存储在存储部54中的阈值。s22的处理相当于本发明的比较部。cpu51使显示部56显示比较结果(s23)，并使处理结束。分析者基于显示在显示部56中的比较结果，与实施方式1同样，判断分析对象的蛋白质溶液是否适合于医药品。如上所述，利用本实施方式，也可以简单地评价使抗体等蛋白质溶解的蛋白质溶液是否适合于医药品。
(实施方式3)
在本实施方式中表示了将分析对象的蛋白质溶液作为igg(免疫球蛋白g)溶液的方式。在本实施方式中，主要表示了将igg水溶液作为分析对象的例子。igg是抗体的一种，有时用作抗体医药品。igg溶液的分析方法与图1所示的实施方式1的情况相同。用于igg溶液的分析的拉曼光谱分析装置和分析装置3的结构也与图2和图4所示的实施方式1的情况相同。分析者制作多种浓度的igg溶液，利用拉曼光谱分析装置来取得igg溶液的拉曼光谱。拉曼光谱分析装置生成各浓度的igg溶液的拉曼光谱。分析装置3将表示各浓度的拉曼光谱的拉曼光谱数据存储在存储部34中。分析者输入表示igg溶液浓度的浓度数据，cpu31将浓度数据存储在存储部34中。表示各浓度的拉曼光谱的拉曼光谱数据与浓度数据所示的各浓度相互关联。可以通过分析者对操作部35进行操作来进行拉曼光谱与浓度的关联。此外，存储部34存储有特定浓度值，该特定浓度值表示作为医药品所需要的igg溶液的浓度。
分析装置3基于拉曼光谱中包含的规定峰相对于浓度的增加而产生的变化，进行分析igg溶液的处理。图12是表示实施方式3的分析装置3执行的处理步骤的流程图。分析装置3的cpu31按照计算机程序40来执行以下处理。cpu31将多种浓度的拉曼光谱数据从存储部34读取到ram32中，并且对多种浓度的拉曼光谱中包含的1500～1800cm-1的峰形状进行比较(s31)。
图13是表示igg水溶液的酰胺i的拉曼光谱的例子的特性图。图中的横轴以波数(cm-1)的单位表示拉曼位移，纵轴表示归一化的强度。在图13中表示了10、50、100、200(mg/ml)的各浓度的igg水溶液的拉曼光谱中包含的1500～1800cm-1的谱带。各浓度的拉曼光谱以基线相互不同的方式表示。出现在igg溶液的拉曼光谱中包含的1500～1800cm-1的谱带上的峰是起因于igg中的酰胺基的酰胺i谱带的峰。在保持igg的整体结构时，出现该谱带的峰。
接着，cpu31基于比较结果，判断与低浓度下的光谱形状相比，高浓度下的光谱形状是否变化(s32)。例如，cpu31在s31中计算归一化的多种浓度的拉曼光谱间的差的平方和，并且在s32中将差的平方和与规定的容许量进行比较，差的平方和超过容许量时，判断为光谱形状变化。与低浓度相比，在高浓度下1500～1800cm-1的峰形状变化时，表示在高浓度的igg溶液中未保持igg的整体结构。在图13所示的igg水溶液的例子中，在10、50、100和200(mg/ml)的任意一种浓度下，1500～1800cm-1的峰形状均未发生变化。即，在图13所示的例子中，在任意一种浓度中，在igg水溶液中均保持igg的整体结构。
1500～1800cm-1的峰形状发生变化时(s32：是)，cpu31判断与低浓度时相比1500～1800cm-1的峰形状发生变化的浓度，是否在表示作为医药品所需要的igg溶液的浓度的特定浓度值以下(s33)。在s33中，cpu31确定光谱形状发生变化的浓度，并且将特定浓度值从存储部34读取到ram32中，对确定的浓度与浓度值进行比较。光谱形状变化的浓度在特定浓度值以下时(s33：是)，cpu31判断为分析对象的igg溶液不适合于医药品(s34)。在这种情况下，在作为医药品所需要的浓度下未保持igg的整体结构，所以igg溶液不适合于医药品。接着，cpu31使显示部36显示判断结果(s35)，并使处理结束。
1500～1800cm-1的峰形状不变化时(s32：否)或光谱形状变化的浓度超过了特定浓度值时(s33：否)，cpu31计算多种浓度的拉曼光谱中包含的856cm-1和830cm-1的峰的强度比(856/830cm-1)(s36)。
igg溶液的拉曼光谱中包含的856cm-1和830cm-1的峰，起因于酪氨酸。峰位置与实施方式1所示的溶菌酶时稍许不同。856cm-1的峰强度除以830cm-1的峰强度的强度比(856/830cm-1)，表示igg中的酪氨酸的oh基作为氢供体起作用的同时也作为氢受体起作用的程度。igg溶液的浓度比较低时，酪氨酸的oh基作为氢供体起作用，856/830cm-1的强度比比较小。如果igg溶液的浓度升高，则igg分子之间相互作用，酪氨酸的oh基开始作为受体起作用，856/830cm-1的强度比变大。即，856/830cm-1的强度比表示igg分子与其他igg分子相互作用的比例。在某种程度以上的高浓度下，igg分子之间的相互作用饱和，856/830cm-1的强度比大体固定。
接着，cpu31确定856/830cm-1的强度比相对于浓度的变化而大体固定的浓度范围(s37)。在s37中，cpu31计算相对于浓度变化的856/830cm-1的强度比的变化量，将变化量在预先确定的微小的规定范围内的浓度范围，确定为强度比大体固定的浓度范围。显然在上述浓度范围内，igg分子之间的相互作用大体饱和，igg有可能变性。
图14是表示根据igg水溶液的酪氨酸的拉曼光谱得到的856/830cm-1的强度比相对于浓度的变化例的特性图。横轴表示浓度，纵轴表示峰的强度比。在图14所示的例子中，856/830cm-1的强度比在100mg/ml以上的浓度范围内大体固定。
接着，cpu31确定多种浓度的拉曼光谱中包含的1550cm-1的峰宽度(s38)。igg溶液的拉曼光谱中包含的1550cm-1的峰，起因于色氨酸中的吲哚环的c＝c伸缩振动。峰位置与实施方式1所示的溶菌酶时稍许不同。1550cm-1的峰的宽度表示图6所示的c2＝c3和cα-cβ之间的扭转角的分布的宽度。如果igg溶液的浓度升高，则因igg分子之间的相互作用，扭转角变化，扭转角的偏差变大，1550cm-1的峰宽度变宽。即，1550cm-1的峰宽度也表示igg分子与其他igg分子相互作用的比例。在某种程度以上的高浓度下，igg分子之间的相互作用饱和，峰宽度大体固定。
接着，cpu31确定1550cm-1的峰宽度相对于浓度的变化而大体固定的浓度范围(s39)。在s39中，cpu31计算相对于浓度的变化的1550cm-1的峰宽度的变化量，将变化量在预先确定的微小的规定范围内的浓度范围，确定为峰宽度大体固定的浓度范围。
图15是表示根据igg水溶液的色氨酸的拉曼光谱得到的1550cm-1的峰宽度相对于浓度的变化例的特性图。横轴表示浓度，纵轴以波数(cm-1)的单位表示峰宽度。在图15所示的例子中，1550cm-1的峰宽度在100mg/ml以上的浓度范围内大体固定。显然在1550cm-1的峰宽度大体固定的浓度范围内，igg溶液内的igg分子之间的相互作用大体饱和，igg有可能变性。
接着，cpu31计算多种浓度的拉曼光谱中包含的1004cm-1和1240cm-1的峰的强度比(1004/1240cm-1)(s40)。igg溶液的拉曼光谱中包含的1004cm-1的峰，起因于苯基丙氨酸。苯基丙氨酸是构成igg的氨基酸之一。此外，1240cm-1的峰是起因于igg中的酰胺基的酰胺iii的峰。1004cm-1的峰强度在苯基丙氨酸的周围环境变化时变化。具体地说，igg不可逆地凝集时，相对于苯基丙氨酸的相互作用变大，1004cm-1的峰强度增大。1240cm-1的峰强度用作相对于1004cm-1的峰强度的基准。1004cm-1的峰强度除以1240cm-1的峰强度的强度比(1004/1240cm-1)，表示igg中相对于苯基丙氨酸的相互作用的强度。igg溶液的浓度比较低时，相对于苯基丙氨酸的相互作用弱，1004/1240cm-1的强度比大体固定。如果igg溶液的浓度升高，则igg不可逆地凝集，相对于苯基丙氨酸的相互作用变强，1004/1240cm-1的强度比根据浓度而增大。即，1004/1240cm-1的强度比表示igg不可逆的凝集的程度。
接着，cpu31确定根据浓度的增大，1004/1240cm-1的强度比增大的浓度范围(s41)。在s41中，cpu31计算相对于浓度变化，1004/1240cm-1的强度比的变化量，将变化量超过预先确定的微小的规定范围的浓度范围，确定为根据浓度的增大而强度比增大的浓度范围。
图16是表示根据igg水溶液的拉曼光谱得到的1004/1240cm-1的强度比相对于浓度的变化例的特性图。横轴表示浓度，纵轴表示峰的强度比。在图16所示的例子中，1004/1240cm-1的强度比在90mg/ml以下的浓度范围内大体固定，在100mg/ml以上的浓度范围内根据浓度而增大。显然在1004/1240cm-1的强度比根据浓度而增大的浓度范围内，在igg溶液内igg不可逆地凝集，igg有可能变性。通过将1004/1240cm-1的强度比用作根据igg分子之间的相互作用而增减的指标，能够确定igg不可逆地凝集而igg能够变性的浓度阈值。
接着，cpu31确定包含在分析对象的igg溶液中的igg能够变性的浓度阈值(s42)。例如，cpu31将取得拉曼光谱的多种浓度内包含在由s37、s39和s41确定的浓度范围的至少一个中的浓度的最小值确定为阈值。在igg水溶液的例子中，阈值是100mg/ml。在阈值以上的浓度下，igg溶液内的igg分子之间的相互作用大体饱和，igg变性的可能性高。
另外，cpu31可以进行将以下值确定为阈值的处理，该值小于包含在由s37、s39和s41确定的浓度范围的至少一个中的浓度的最小值。例如，cpu31将以下值确定为阈值，该值为从包含在由s37、s39和s41确定的浓度范围的至少一个中的浓度的最小值中减去正的规定值。此外，例如，cpu31可以将以下值确定为阈值，该值为将包含在由s37、s39和s41确定的浓度范围的至少一个中的浓度的最小值乘以小于1的正的规定值。s36、s38和s40的处理相当于计算部，s37、s39、s41和s42的处理相当于本发明的第一确定部。
接着，cpu31对确定的浓度值与表示作为医药品所需要的igg溶液浓度的特定浓度值进行比较(s43)。在s43中，cpu31对从存储部34读取的浓度值与阈值进行比较。s43的处理相当于比较部。cpu31使显示部36显示比较结果(s44)，并使处理结束。分析者基于显示在显示部36中的比较结果，以上述方式判断分析对象的igg溶液是否适合于医药品。例如，特定浓度值在阈值以上时，由于在作为医药品所需要的浓度下igg变性而导致作为医药品的效果发生变化，所以分析者判断为分析对象的igg溶液不适合于医药品。另外，分析装置3对于s31～s44处理内的s36～s37处理、s38～s39处理和s40～s41处理，也能够以其他顺序执行或并行执行。此外，分析装置3也可以执行省略s36～s37处理、s38～s39处理和s40～s41处理内任意一个或两个的处理。
另外，在以上的处理中表示了在s41中确定1004/1240cm-1的强度比根据浓度的增大而增大的浓度范围的方式，但是分析装置3也可以代替s41进行确定1004/1240cm-1的强度比相对于浓度的变化而大体固定的浓度范围的处理。在这种情况下，分析装置3在s42中将由s37和s39确定的浓度范围的下限以及在代替s41的处理中确定的浓度范围的上限中的最小值确定为阈值。此外，可以将比最小值小的值设为阈值。
如上所述，在本实施方式中，取得多种浓度的igg溶液的拉曼光谱，基于拉曼光谱来确定igg能够变性的浓度阈值。通过对确定的阈值与作为医药品所需要的浓度进行比较，能够评价在作为医药品所需要的浓度在阈值以上时igg溶液不适合于医药品等、特定igg溶液是否适合于医药品。因此，利用本实施方式，能够简单地评价包含igg等抗体的溶液是否适合于医药品。
另外，在igg溶液等蛋白质溶液的分析方法中，可以将856/830cm-1的强度比或1004/1240cm-1的强度比的倒数用作指标。此外，作为1004cm-1的峰的基准，可以使用1240cm-1以外的峰。此外，拉曼光谱分析装置可以是控制部24和分析装置3一体的方式。此外，可以是分析装置3与拉曼光谱分析装置分离的方式。此外，在分析方法中，也可以不使用分析装置3来分析igg溶液。此外，在本实施方式中将igg水溶液作为分析对象，但是分析方法也可以将使igg溶解在缓冲溶液中的溶液等水溶液以外的igg溶液作为分析对象。此外，分析方法也可以将igg以外的抗体的溶液作为分析对象。此外，在本实施方式中表示了利用拉曼光谱中的856cm-1、830cm-1、1004cm-1、1240cm-1和1550cm-1的峰的方式，但是根据抗体的种类或抗体的溶液的条件，有时上述峰的拉曼位移的值偏移。即使上述峰的拉曼位移的值偏移时，也同样可以执行分析方法。
附图标记说明
1蛋白质溶液
21光源
22分光器
23检测器
24控制部
3分析装置
31、51cpu
32、52ram
34、54存储部
35、55操作部
36、56显示部
4存储介质
40、57计算机程序