本申请要求于2015年12月2日提交的美国临时专利申请序列号62/262,058的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
基准标记在各种类型的成像系统中的载玻片或样品上提供稳定的固定点。所有的测量参考这些点来消除样品漂移。
现有的基准标记基于金纳米颗粒、荧光标记的纳米尺度的珠粒以及不太常见的量子点。所有这三种基准标记都有多个限制。
目前最常使用的基准标记是金纳米颗粒，其可以从许多来源例如hestzigllc商购获得。在这种方法中，金纳米颗粒被嵌入玻璃盖玻片中。金颗粒表现出依赖于大小和形状的发射，其不会随着时间而变白。
然而，金纳米颗粒基准标记具有多个缺点：它们具有窄的发射(光致发光)波长，其与颗粒的大小有关。由于发射波长、发射强度和颗粒大小被耦合，所以难以控制金颗粒的发射。因此，在不改变发射波长的情况下调整发射强度可能是困难的。另外，金可以表现出依赖于偏振的发射强度。很难获得多个波长的相关性。此外，金颗粒会随着时间而闪烁。
染料标记的纳米尺度珠粒例如tetraspeck珠粒(lifetechnologies，目录#t7279)是另一种较少使用的基准标记。优点是尺寸小(100nm)，并且并入了涵盖大范围的发射波长的四种不同的染料。这些珠粒的关键限制是它们随着时间而漂白，限制了它们在扩展成像试验中的用途。
量子点作为基准标记而使用得少得多。虽然它们是明亮的荧光探针，但它们经受闪烁、发射波长窄、它们的发射强度难以调节，并且它们随着长的时间段而漂白。因此，它们通常太明亮而不能用于其中测量的荧光团相当暗的许多应用，并且它们不适合于在延长的时间段内的跟踪应用。
尽管有传统荧光显微镜的优点，但由于光衍射所决定的分辨率极限，这限制了可以用标准物镜捕获的信息量，因此这种技术在超微结构研究中受到阻碍。光显微镜的分辨率极限被统称为超分辨率显微镜的技术超过。
近来已经开发了各种超分辨率显微镜技术以克服光显微镜的衍射极限，使得实现小分子结构的可视化。其中，称为单分子定位显微镜(smlm)的一类超分辨率技术包括光激活定位显微镜(palm)和随机光学重建显微镜(storm)，实现了最高水平的成像精度(10-20nm)。smlm技术具有通用的荧光探针，其可以在开启(荧光)和关闭(暗/光切换)状态之间切换，从单个分子中分离荧光，以及顺序定位高斯拟合的荧光峰。
由于其兼容商业染料和显微镜，直接storm(dstorm)已成为广泛采用的smlm技术。另外，与利用palm实现的约20nm相比，dstorm可以常规地实现约10nm的定位精度。然而，尽管定位精度很高(通常使用汤普森方程计算)，但使用smlm精确定位单分子已经受到许多问题的阻碍。首先，“定位精度”通常与“定位准确性”混淆(例如，10nm精度的高斯拟合峰被错误地假定为在荧光探针的真实位置的10nm内)。这具有如下重要的后果：5-10nm的定位精度(通过大多数dstorm研究实现)不足以以高置信度准确定位单个分子。其次，通过包括漂移和振动的显微镜台运动引入附加的定位不确定性。
除了衍射极限之外，研究人员还受限于光显微镜的光谱极限。同时可视化多个分子需要荧光探针具有不交叠的光谱轮廓，从而通常将荧光显微镜限制为6种颜色。在smlm中，只有少数荧光探针具有精确单分子定位所需的性质，从而将大多数研究限制为2-3种颜色。此外，颜色通道之间的非线性色差增加了复用图像的对准的显著的不确定性(pertsinidis,a.等人(2010)nature466(7306)：647-651；erdelyi,m.等人(2013)optexpress21(9)：10978-10988)。为了克服这些光谱极限，已经设计了替代的复用方案(gerdes,m.j.等人(2013)procnatlacadsciusa110(29)：11982-11987；jungmann,r.等人(2014)natmethods11(3)：313-318；schubert,w.(2014)/molrecognit27(1)：3-18)。这些策略利用如下循环：预标记与细胞内感兴趣的蛋白质结合的荧光探针、成像，然后进行光漂白或化学漂白。这样的复用策略确实可以绕过显微镜的光谱极限，但荧光探针的最终积累将可能导致细胞中其他结合位点的空间阻断，从而阻止进一步的复用。此外，由于已知荧光漂白是一种毒性过程(jacobson,k.等人(2008)trendscellbiol18(9)：443-450)，因此长时间的光漂白或化学漂白将可能导致不希望的效果，例如细胞蛋白质的反向交联和变性。
迄今为止，超分辨率成像一直受到可用基准标记的性能的限制。这些限制因为连续成像10、20或更多个蛋白质所需的长记录时间而变得复杂。每个蛋白质的成像可能花费超过1小时，并且可能存在由重复洗涤以及与对每个蛋白质进行成像相关联的温育步骤引起的相当大的机械漂移。对于各个蛋白质的图像的最终分辨率和配准由基准跟踪的稳定性和准确性来确定。
因此，对用于成像应用例如荧光成像特别是用于可以长达一周或更长时间段的单个样品的扩展成像的改进的基准标记存在需求。
技术实现要素：
本文公开了包含荧光纳米金刚石(fnd)的基准标记组合物以及用于制备和使用所述组合物的方法。
在实施方式中，基准标记组合物包含基底和固定在基底的表面上的荧光纳米金刚石(fnd)，其中，基底和固定的fnd至少部分地顶涂覆有惰性顶部涂层。
在实施方式中，基准标记组合物包含基底、固定在基底的表面上的透明聚合物以及嵌入在透明聚合物中的荧光纳米金刚石(fnd)。
在实施方式中，基准标记组合物包含标记复合物，其包含荧光纳米金刚石和用于非荧光成像方法的造影剂。
在实施方式中，制造基准标记组合物的方法包括将荧光纳米金刚石(fnd)固定在基底的表面上，并用惰性顶部涂层涂覆固定的fnd和表面。
还公开了使用fnd作为基准标记的方法。
在实施方式中，成像方法包括：使样品与本文公开的基准标记组合物接触；获取样品中的目标和fnd的多个荧光图像；以及通过对准所有图像中的fnd的位置来校正每个图像中的目标位置。
在实施方式中，超分辨率成像校正方法包括：通过对每个fnd在每个图像中的点扩散函数进行高斯拟合来确定n图像中的多个(多个n个图像)的每个图像中的m个荧光纳米金刚石(fnd)中的每一个的位置坐标，其中m≥4且n>1；位移(转移、迁移、替换，displace)每个图像以对准所有图像中的第一fnd(fnd1)的坐标；对于除fnd1以外的每个fnd，计算fnd在所有n个位移图像上的位置分布的中心；以及位移每个图像，使得除fnd1以外的所有fnd的位置变化在所有图像上最小化。
根据以下附图、具体实施方式、实施例和权利要求，这些和其他优点以及附加的发明特征将变得明显。
附图说明
以下是对附图的简要描述，其中相同的元件附图标记相同，并且出于说明本文公开的示例性实施方式的目的而呈现，而不是为了限制本公开的目的。
图1示出了在荧光显微镜成像中荧光强度作为从纳米金或纳米金刚石基准标记测量的图像帧的函数的图。
图2示出了在荧光显微镜成像中纳米金或纳米金刚石基准标记的图像及其相关联的预期和观察到的位置误差的标准偏差。
图3是示出了对于纳米金或纳米金刚石基准标记沿着x或y轴的荧光显微镜成像中观察到的位置误差的标准偏差的柱状图。
图4是通过在jurkatt细胞中对三个t细胞受体微复合物形成蛋白质(lat、slp76和pzeta)进行连续成像获得的免疫突触的复用超分辨率图，其中alexafluor-647标记的抗体针对三个蛋白质之一和fnd同时成像以消除每个连续成像蛋白质的成像期间和之间的漂移。平均定位精度＝3.61nm；平均对准精度＝2.07nm。
图5是未染色的荧光纳米金刚石(～5nm)的透射电子显微照片。
图6比较了三种技术(交互相关、基准校正和点校正)以校正所获得的smlm图像中的台移动。图a至图c分别示出了通过交互相关、基准校正或点校正校正后的fnd的图像；图d至图f示出了图a至图c的图像的定位分布的三维柱状图；图g是示出通过每种方法校正后的不确定性比率的柱状图；并且图h是通过每种方法校正后的x/y定位比率的柱状图。
图7a至图7f，图a和图b呈现示出了观察到的标准偏差作为fnd(图a)和alexafluor-647-标记的抗体(a647)(图b)的平均值的预期标准误差的函数的图，图c和图d分别呈现fnd和alexafluor-647标记的抗体的x-y分布的图；图e和图f示出了在三种类型的校正后抗体的可视化和定位的图像(e)和三维柱状图(f)。
图8a至图8e呈现示出了在每个图像帧中使用四个fnd基准标记的点校正方法的步骤的示意图。
图9a至图9g呈现表征来自单个发光源的多个定位的分布的曲线图和图像。
图10呈现使用不同放大率设置的相同fnd的图像。
图11是示出如下复用抗体大小受限的dstorm(madstorm)的示意图：alexa-647结合的抗体(标记的抗体，conjugatedantibody)与固定的细胞样品结合并使用抗体大小受限的dstorm成像(图11a)，它们使用剥离缓冲剂解结合并将它们的荧光进行光漂白(图11b)，然后将细胞样品与新的alexa-647结合的抗体结合，成像，解结合和光漂白(图11c、d)。
具体实施方式
公开了包含荧光纳米金刚石(fnd)的基准标记组合物以及制造和使用该基准标记组合物的方法。
fnd是不闪烁或漂白的明亮的荧光探针。此外，fnd具有较宽的荧光激发和发射峰，并且荧光强度可以容易地通过fnd的大小、纳米金刚石中产生的荧光中心的数量或通过原位施加弱磁场(具体地用于nv-或负氮空位中心的情况)(sarkar，s.k.等人，(2014)biomedoptexpress5(4)：1190-1202)来控制。这些性能使fnd成为用于荧光显微镜的理想基准标记。本发明人已经显示fnd在头对头比较中胜过当前用于荧光显微镜的基准标记，并且相对于当前的基准标记(诸如金纳米颗粒或荧光珠粒)提供许多重要的优点。
在一些实施方式中，公开了一种基准标记组合物。在实施方式中，基准标记组合物包含基底和固定在基底的表面上的荧光纳米金刚石(fnd)。可以使用各种不同的固定技术。根据固定技术的不同，可以添加顶部涂层以更永久地固定fnd。例如，底物和固定的fnd至少部分地顶涂覆有惰性材料例如二氧化硅(sio2)。在另一实施方式中，基准标记组合物包含基底、固定在基底的表面上的透明聚合物和嵌入透明聚合物中的荧光纳米金刚石(fnd)，并且可选地包含惰性顶部涂层。在另一实施方式中，基准标记组合物包含标记复合物，其包含荧光纳米金刚石和用于非荧光成像方法的造影剂。
fnd可以用聚合物固定在基底上。聚合物可以是带电聚合物或透明聚合物。带电聚合物的实例包括天然存在的或合成的多肽，例如均聚物聚-l-赖氨酸和聚-l-精氨酸。透明聚合物的实例包括硅氧烷例如聚(二甲基硅氧烷)(pdms)、聚(甲基)丙烯酸酯例如聚(丙烯酸甲酯)和聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚碳酸酯、聚膦酸酯、聚(乙烯醇缩丁醛)、聚酯和聚酰亚胺。可替换地，fnd可以分散在凝胶如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中。fnd可以以合适的浓度悬浮在聚合物的溶液或熔体中，然后可以通过本领域已知的任何方法将悬浮液或熔体分散在基底上，例如通过移液或旋涂。可替换地，可以首先用聚合物涂覆基底，然后可以将悬浮液形式的fnd例如分散到涂覆有聚合物的基底上。聚合物涂层可以在将荧光纳米金刚石分散到基底上之前或之后进行图案化。基底也可以首先用聚合物图案化，然后可以将fnd的悬浮液分散到基底上的聚合物图案上。可以使用任何常规的图案化技术来产生聚合物图案，例如光刻或软光刻。也可以通过用与fnd反应的官能团或官能化fnd的官能团来官能化基底的表面，并将fnd或官能化fnd的溶液应用于官能化表面来将fnd固定在基底的表面上。官能化的基底的表面基底的表面可以可选地被图案化。在将fnd固定到表面的任何方法中，可以通过用合适的溶液(例如水或缓冲剂)洗涤表面来去除未固定的fnd。
可以使用本领域已知的用于基底的表面官能化的任何合适的方法。共价衍生二氧化硅或玻璃表面的一种方法是用如下进行硅烷化：有机官能三(c1-8烷氧基)硅烷或三氯硅烷，例如氨基(c1-8烷基)三(c1-8烷氧基)硅烷、氨基(c1-8烷基)三氯硅烷、巯基(c1-8烷基)三(c1-8烷氧基)硅烷、羟基(c1-8烷基)三(c1-8烷氧基)硅烷、羟基(c1-8烷基)三氯硅烷、羧基(c1-8烷基)三(c1-8烷氧基)硅烷、环氧基(c1-8烷基)三(c1-8烷氧基)硅烷、n-(氨基c1-8烷基)(氨基c1-8烷基)三(c1-8烷氧基)硅烷等。具体示例包括3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)、(3-氨基丙基)-二甲基乙氧基硅烷(apdmes)、n-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(aeaps)、3-醛基丙基三甲氧基硅烷(apms)、巯基丙基三甲氧基硅烷(mptms)和巯基丙基三乙氧基硅烷(mptes)等，例如氨基三乙氧基硅烷。特别适用于改性二氧化硅表面的物理特性(例如亲水性)的衍生剂的其他具体示例包括2-[甲氧基(聚乙烯氧基)丙基]三甲氧基硅烷、2-[甲氧基(聚乙烯氧基丙氧基)丙基]三甲氧基硅烷、(c1-32烷基)三氯硅烷如十八烷基三氯硅烷。
当衍生剂包含官能团时，官能团可以进一步衍生化。因此，也可以使用官能化三烷氧基硅烷或三氯硅烷作为二氧化硅表面与另一分子如单体或亲水性聚合物(例如甲基纤维素、聚(乙烯醇)、葡聚糖、淀粉或葡萄糖)之间的连接基团。三烷氧基硅烷或三氯硅烷的官能团被选择与另一分子反应，并且可以是上述那些中的任何一种，例如乙烯基、烯丙基、环氧基、丙烯酰基、甲基丙烯酰基、巯基、氨基、羟基等。官能化可以同时或逐步进行。
二氧化硅表面的非共价官能化可以基于由于高于约ph3.5的二氧化硅的负性质引起的静电相互作用。例如，带正电的聚合物可以静电吸附到二氧化硅表面。
可以使用本领域已知的用于fnd的表面官能化的任何合适的方法。官能化fnd的一种方法是如在wo2014014970中或在bumb，a.等人(2013)journaloftheamericanchemicalsociety135(21)：7815-7818中用二氧化硅包封fnd。官能化二氧化硅前体可用于包封过程以获得官能化二氧化硅涂层。二氧化硅涂覆的fnd也可以通过利用fnd和硅烷如烷氧基硅烷与诸如交联剂n-羟基磺基琥珀酰亚胺(nhs)钠或衍生的nhs的试剂反应而衍生化。(wo2014014970；bumb等人，(2013))fnd可通过酸处理而氧化，从而在纳米金刚石表面上产生阴离子羧酸根基团(chang，b.m.等人，(2013)advancedfunctionalmaterials23(46)：5737-5745)。氧化的fnd吸附具有带正电基团的各种生物分子，例如具有氨基的蛋白质(ermakovaa.等人，(2013)nanoletters13：3305-3309)或聚赖氨酸(fu，c.-c.等人，(2007)procnatlacadsciusa104(3)：727-732)。这种氧化的fnd可以进一步用氨基官能化。例如，氧化的fnd的表面羧酸根基团可以与试剂例如n-(3-二甲基氨基丙基)-n-乙基-碳化二亚胺盐酸盐反应(fu等人，2007)。fnd也被聚乙二醇化并进一步衍生化(chang等人，2013)。
可替换地，将固定在基底上的透明聚合物可以在形状固定在基底上之前首先形成(例如铸造)为薄片或其他形状。fnd可以在透明聚合物的溶液中混合，使得在将溶液形成为形状时，fnd位于整个形状的随机位置，从而导致fnd在透明形状内的不同焦平面中。可替换地，在形状固定在表面上之后，fnd可以分散并固定在形状的表面上。在实施方式中，将透明聚合物浇铸成薄片，然后将薄片分割(例如切割)成更小的形状。如果固定的透明聚合物形状在高度上变化，则固定在透明聚合物形状的表面上的fnd将在多个焦平面中具有fnd基准标记，因此可用于提供三维成像方法的优良校正。
基底上fnd的密度可以为每100μm2约10至约500个fnd、具体地每100μm2约10至约300个fnd、更具体地每100μm2约10至约50个fnd、每100μm2约50至约150个fnd、或每100μm2约150至约300个fnd。
在实施方式的任一个中，至少两个fnd可以固定在透明聚合物中或固定在基底的表面基底的表面上，使得fnd和基底的表面基底的表面之间的距离对于两个fnd是不同的。
惰性顶部涂层可以是惰性材料，例如二氧化硅、氧化铝、或杂合有机-无机材料，例如铝基有机无机符合薄膜(alucone)。顶部涂层可以通过本领域已知的任何方法制造。例如，可以通过分别用二氧化硅或氧化铝溅射涂覆组合物来制备二氧化硅或氧化铝顶部涂层。组合物上的惰性顶部涂层消除了任何fnd运动的可能性，将组合物与任何样品分离，并且允许组合物的再使用。
如本文所用，术语“纳米金刚石”是指纳米尺寸的金刚石颗粒。如本文所用，“金刚石”包括天然金刚石和来自各种合成工艺的人造金刚石两者以及颗粒形式的“类金刚石碳(diamond-likecarbon)”(dlc)。金刚石可以是任何形状的，例如矩形、球形、圆柱形、立方形或不规则形，条件是至少一个尺寸是纳米级，即小于：约1微米、约800nm、约500nm、约250nm、约200nm、约150nm、约100nm、约90nm、约80nm、约70nm、约60nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm、约20nm或约10nm。具体地，纳米金刚石的最大尺寸应小于在成像条件下由阿贝衍射极限定义的显微镜的衍射极限光斑尺寸。
如本领域所知，准确确定纳米范围内的颗粒尺寸可能是困难的。在实施方式中，使用它们的流体动力学直径来确定纳米金刚石的尺寸。纳米金刚石或纳米金刚石聚集体的流体动力学直径可以在合适的溶剂体系如水溶液中测量。流体动力学直径可以通过沉降、动态光散射或本领域已知的其他方法来测量。在实施方式中，流体动力学直径通过差速离心沉降来确定。差速离心沉降可以在例如盘式离心机中进行。在实施方式中，流体动力学直径是通过动态光散射确定的z平均直径。z平均直径是从测量的相关曲线的累积量分析得出的平均强度直径，其中假定了单个颗粒尺寸并且将单指数拟合应用于自相关函数。z平均直径可以通过使样品分散在例如去离子水中的动态光散射来确定。用于通过动态光散射确定颗粒尺寸和/或多分散指数的合适仪器的实例是malvernzetasizernano。
如本文所用，术语“荧光纳米金刚石”(缩写为“fnd”)是指当暴露于合适的吸收(激发)光谱时呈现荧光的纳米金刚石。荧光纳米金刚石可以从如下许多来源商购获得：例如，adámasnanotechnologies(北卡罗来纳州罗利)或sigma-aldrich。fnd的尺寸可以是约5nm至约200nm。
纳米金刚石颗粒的荧光基于掺入金刚石晶格中的色心。这种荧光可以由氮空位(nv)中心的存在引起，其中氮原子位于纳米金刚石中空位附近，其提供红色荧光和/或氮空位氮(n-v-n或h3)中心，其发出绿光。nv中心的光学特性非常适用于生物成像应用，其光学激发从490nm-560nm，并且以远离大多数自发荧光细胞分量的红外\近红外(637-800nm)发射。由于光在周围组织中的渗透性更强，所以发射还发生在对生物标记有吸引力的低吸收光谱窗中。含有nv中心的纳米金刚石发射的发光强度取决于颗粒中nv中心的数量。n-v-n中心在蓝光激发下发出最大约530nm的绿色荧光。除了nv和n-v-n中心外的许多色心都是在纳米金刚石中制造和表征的。在fnd中制造的其他色心的实例包括在797nm发射的铬(cr)中心、硅空位(si-v)中心和镍(ni)-氮配合物(aharonovich,i.等人，phys.rev.b81，121201，2010年3月15日；vlasovi.i.等人，adv.mater.2009，21，808-812；rabeauj.r.等人，appl.phys.lett.(2005)86，131926)。用任何合适的色心生产的纳米金刚石可用于本文公开的组合物和方法中。因此，在公开的组合物和方法中，fnd可以是具有至少两个色心的多色fnd。例如，多色fnd可以包括nv和n-v-n中心，或者多色fnd可以包括n-v-n和si-v中心。金刚石内的色心的一个有利特征是即使在连续的高能激发条件下它们也不会光漂白或闪烁，这使得它们由于其前所未有的光稳定性而优于常规发色团。此外，由于色心嵌入金刚石基质中，因此其荧光性能不受表面改性或环境条件(如溶剂、ph和温度)的影响。
“基底”是指具有刚性或半刚性表面或多个表面的材料或材料组。这些材料的实例包括聚合物(例如聚碳酸酯、聚烯烃、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(甲基)丙烯酸酯)、玻璃和硅晶片、具体地玻璃、更具体地石英。在一些方面，基底的至少一个表面是基本上平坦的，但是在一些方面，可以期望具有例如井、凸起区域、针、蚀刻沟槽等。在某些方面，基底可以采取珠粒(例如胶乳珠粒)、凝胶、微球体或其他几何构型的形式。
在另一方面中，公开了制造基准标记组合物的方法。
在实施方式中，该方法包括将荧光纳米金刚石(fnd)固定在基底的表面上，并用惰性顶涂层如sio2涂覆固定的fnd和表面。固定的fnd和基底的表面基底的表面可以通过任何合适的方法涂覆，例如溅射涂覆基底的表面基底的表面。惰性顶部涂层可以具有约50nm至约300nm、具体地约100nm至约200nm、更具体地约150nm的厚度。
fnd可通过任何已知方法例如本文公开的任何方法固定在基底的表面基底的表面上。fnd可以通过将fnd在聚合物水溶液中的混合物施加到基底的表面基底的表面来固定。fnd也可以通过用聚合物涂覆表面来固定；并将fnd分散到聚合物涂层上。可选地，聚合物涂层可以在fnd分散到涂层上之前或之后被图案化。聚合物可以是例如透明聚合物或带电聚合物，例如多肽，诸如聚-l-赖氨酸或聚-l-精氨酸。以上公开了合适的带电聚合物和透明聚合物的实例。通过将包含透明聚合物的预制对象(物体，object)固定在基底的表面基底的表面上，fnd也可以固定在基底上，其中fnd被包含在对象内或对象的表面上。fnd也可以通过用与fnd或官能化fnd反应的官能团对基底的表面官能化来固定；并将fnd或官能化fnd的溶液应用于官能化表面。在实施方式的任一个中，未固定的fnd可以通过用合适的溶液(例如水或缓冲剂)洗涤基底的表面来去除。
在另一方面中，公开了一种成像方法。
在实施方式中，该方法包括使样品与本文公开的基准标记组合物接触；获取样品中的目标和fnd的多个荧光图像；以及通过将每个图像与fnd的荧光的位置配准(register)来校正用于漂移和对准的多个图像的每个图像中的目标位置。
成像方法可以是多模态成像方法，其中使用不同于荧光成像的至少一种另外成像技术。另外的成像方法可以是磁共振成像(mri)、计算机断层扫描(ct)成像、x射线成像或电子显微术。在这种多模态成像方法的一些实施方式中，fnd被包封在脂质体中，并且脂质体进一步包封用于另外成像技术的造影剂或成像剂。在这种多模态成像方法的一些实施方式中，fnd连接到用于另外成像技术的造影剂或成像剂。造影剂或显像剂的实例包括含锇部分、含钆部分、含镝部分或高电子密度(z)材料。含锇部分的实例是四氧化锇。含钆部分的实例包括钆螯合物如wo1996010359中公开的钆-二亚乙基三胺五乙酸二葡胺([nmg]2gd-dtpa])、omniscantm(gd二亚乙基三胺五乙酸双(甲基酰胺))、prohancetm(gd(10-(2'-羟丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-n,n',n”-三乙酸))和其他、以及钆的聚氨基多羧酸络合物。含镝部分的实例包括镝(dy)螯合物，例如在wo1996010359中公开的dy-二乙烯三胺五乙酸双(甲基酰胺)等。高z材料的实例包括金、铀或钨。
可以通过多种方法进行样品与所公开的基准标记组合物接触。将样品与基准标记组合物接触的方法包括：将样品移液或包埋到基准标记组合物上，或将基准标记组合物移液或包埋到样品上；将基准标记组合物注入样品中；或将基准标记组合物供给生物体。荧光纳米金刚石可以通过fnd表面上的官能团或配体与样品结合。
“样品”是指包含要成像的目标的样品。样品可以是溶液、悬浮液、细胞、组织、器官、细胞膜、细胞器或生物体。
术语“目标”是指待成像的感兴趣的分子或分子复合物。目标可以是天然存在或人造分子。此外，它们可以以未改变的状态使用，或作为其他物种的聚集体使用。目标的实例包括生物分子复合物(例如t细胞受体微团簇)、蛋白质(例如细胞膜受体或抗体)、药物、寡核苷酸、核酸、肽、辅因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜、和细胞器。
在实施方式中，超分辨率成像校正方法包括：通过对每个fnd在每个图像中的点扩散函数进行高斯拟合来确定n个图像中的多个的每个图像中的m个荧光纳米金刚石(fnd)中的每一个的位置坐标，其中，m≥4且n>1；位移每个图像以对准所有图像中的第一fnd(fnd1)的坐标；对于除fnd1外的每个fnd，计算fnd在所有n个位移图像上的位置分布的中心；并且位移每个图像，使得除fnd1外的所有fnd在所有图像上的位置变化最小化。在实施方式中，fnd1被选择为具有最大强度的fnd。
待校正的成像方法可以是其中fnd适合用作基准标记的任何成像方法。这些成像方法的实例包括荧光显微术、电子显微术、mri、ct和x射线成像，具体地是任何超分辨率显微术方法，诸如包括光激活定位显微术(palm)的单分子定位显微术(smlm)、随机光学重建显微术(storm)和直接storm(dstorm)。成像方法可以是二维(2-d)或三维(3-d)成像方法。此外，成像方法可以是多模态的。
确定通过特定成像方法获得的图像中的对象的位置或位置坐标的方法在本领域中是公知的，并且可以使用任何合适的方法。确定图像中位置的软件可以从商业和各种免费网络源两者获得。例如，用于image-j或fiji的几个免费插件例如mosaic、trackmate、multitracker和thunderstorm。另外，可以在来自nikon的专有软件(例如，nis-an-storm)或matlab或labview环境中执行位置确定。参见例如(chenouard，n.等人，(2014)natmeth11(3)：281-289)，以获得最新跟踪软件的概要。几种算法可用于位置确定，包括荧光强度分布的二维高斯拟合、质心确定和局部最大值拟合。
位移可以是平移、旋转或扩张/收缩中的至少一个。
可以通过任何合适的方法来执行位移每个图像，使得除fnd1以外的所有fnd的位置变化最小化。在实施方式中，位移每个图像，使得除fnd1外的所有fnd的位置变化最小化包括：对于除了fnd1外的所有fnd计算fnd的位置分布的中心在所有n个位移图像上的平均值；计算除fnd1外的所有fnd在每个图像中的平均位置；并且位移给定图像以最小化针对除了fnd1外的所有fnd的fnd的位置分布的中心在所有n个位移图像上的平均值与除fnd1外的所有fnd在给定图像中的平均位置之间的差。可替换的方法涉及确定一个参考图像中m个基准标记的位置。每个随后的图像被变换以最小化参考和变换图像中基准标记的位置之间差的平方和。这些差可以通过每个基准标记的亮度来加权，以增加变换过程的鲁棒性。该变换可以是简单的刚体变换、刚体变换和旋转的组合、刚体变换、旋转和均匀扩张或收缩的组合、或变换后的图像非线性映射到参考图像上。以下实施例仅仅是本文公开的基准标记组合物和方法的说明，并不意图限制本文的范围。
实施例
实施例1.荧光成像中fnd和金颗粒的比较
荧光纳米金刚石基准标记载玻片通过用聚赖氨酸将fnd旋涂到载玻片上而产生。
将fnd基准标记与商业上可获得的纳米金颗粒基准标记载玻片进行比较。
使用nikoneclipseti倒置显微镜获得全内反射荧光(tirf)共焦图像。荧光团alexa
图1示出了从每种类型的基准标记测量的随时间的强度。fnd标记显示比纳米金标记更好的时间稳定性。
图2分别显示了纳米金和纳米金刚石标记的图像，以及对于每个标记的位置误差的预期和观测到的标准偏差(σ)的值。fnd基准标记的位置误差具有小于纳米金基准标记一半的观察到的标准偏差。
图3呈现了分别比较沿x轴和y轴的纳米金或纳米金刚石基准标记的横向分辨率的观察到的标准偏差的柱状图。每个方向的观察到的标准偏差对于fnd基准标记小于对于纳米金基准标记。
因此，与纳米金基准标记相比，fnd基准标记提供更高精度的位置追踪和更好的稳定性。
实施例2.透射电子显微镜中的fnd基准标记
通过透射电子显微镜(em)测试fnd基准标记在成像中的实用性。
将具有约5nm颗粒尺寸的fnd铺开并在没有染色的情况下通过tem成像。图5示出了这种fnd样品的电子显微照片，其示出了～5nmfnd在没有染色的情况下在tem中提供良好的对比度。
实施例3.复用dstorm
在这个实施例中，我们描述了一种如下新的算法：使用荧光纳米金刚石(fnd)基准标记来配准漂移校正和对准的样品，并结合一种新的成像技术，其可能允许使用dstorm无限制地复用荧光探针。使用基于fnd的漂移校正和复用dstorm，探测了t细胞受体(tcr)微团簇和t细胞的活化膜表面附近的其他细胞结构的分子组分的纳米尺度形貌。
光显微镜的分辨率极限已经被统称为超分辨率显微镜的技术超越。但是，光显微镜存在光谱极限。由于不同荧光探针的非交叠波长分布的有限可用性，多色成像限于六种颜色。我们开发了一种新技术，以允许使用直接随机光学重建显微术(dstorm)进行潜在的无限复用超分辨率成像。此外，我们开发了一种更精确的方法，其使用荧光纳米金刚石基准标记进行用于漂移校正和对准的样品配准，与以前的研究相比，精度提高>2倍。使用这种dstorm技术，我们成功地在同一细胞中可视化20个不同的分子，并且平均定位精度为2.5nm，且对准精度为3.5nm。同时探测涉及tcr信号传导级联和其他分子网络的分子的空间分布将很快可能用复用dstorm进行。
tcr的接合导致形成在t细胞活化期间充当基本信号传导单元的tcr微团簇(bunnell，s.c.等人，(2002)jcellbiol158(7)：1263-1275；campi，g.等人，(2005)jexpmed202(8)：1031-1036)。此外，这些微团簇在活化的t细胞表面的不同转运和积聚导致称为免疫突触的结构。尽管tcr微团簇已经使用常规光显微镜进行了广泛的研究，但由于光显微镜的衍射和光谱极限，它们的纳米结构和tcr信号传导分子的相对分布不能很好地表征。
我们已经显示了使用palm，tcr微团簇的分子组分显示不同的定位模式(sherman，e.等人，(2011)immunity35(5)：705-720)。然而，使用palm成像tcr微团簇组分的相对分布已经受到仅有2种颜色成像的能力的阻碍。此外，我们已经观察到荧光标记分子的人工聚类，尤其是那些用荧光蛋白质pa-mcherry标记的分子，导致寻求新的成像模态来可视化免疫突触(wang，s.y.等人，(2014)proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica111(23)：8452-8457)。
点校正
为了补偿在dstorm采集期间的台运动，当前校正方法或者通过从整个视场中采样定位峰(‘交互相关’)或者从已知基准标记基于回归平滑定位位置(‘基准校正’)来估计台漂移的轨迹。这些方法要求优化每个图像的采样/回归参数，并且如下所示，不能充分校正所有的台运动。不是校正台运动后图像采集，一些研究而是采用基于硬件的策略来实时主动稳定台。但是，它们需要复杂的硬件和软件修改，从而使其难以实施。
开发了一种使用fnd作为基准标记的新的校正方法，称为“点校正”。fnd是理想的smlm基准标记，因为它们很小(<100nm)、明亮、光稳定，并且显示出广泛的荧光光谱范围。点校正是一个5步骤过程，并且要求在所有图像帧中存在>4个fnd基准标记。首先，对所有fnd定位高斯峰，将最亮的fnd指定为fnd1，并且将fnd1中的所有定位的x、y位置移动到其在第一帧中的位置(步骤1；图8a)。接下来，将来自步骤1的位移应用于所有其他fnd(步骤2；图8b)。第三，为除fnd1以外的所有fnd定义定位分布的中心，并且将它们的定位和分布中心之间的最小距离作为每个帧的单个位移来计算(步骤3；图8c)。然后将该位移应用于fnd1(步骤4；图8d)。最后，将步骤1和3的位移应用于整个图像堆栈以校正台移动(步骤5；图8e)。
使用嵌在聚-l-赖氨酸包被的盖玻片上的fnd，我们测试了交互相关、基准校正和点校正的能力，以校正所获得的smlm图像中的台运动。尽管交互相关和基准校正可以补偿大的台漂移，但它们不能校正小的台振动，从而导致在振动方向上定位的细长、非对称分布。(n＝30000帧；图6，图a-图b和图h)。相比之下，用点校正校正的相同fnd始终产生对称的定位分布(图6c和图6h)。此外，如从3d柱状图(图6d-图f)和它们的标准偏差(sd)(6.0nm、11.3nm[x，y轴]、交互相关；4.8nm、10.87nm、基准校正；3.8nm、3.9nm、点校正)可以清楚地看出，与其他校正方法相比，采用点校正定位分布的范围较小。点校正后的多个定位的sd紧密匹配针对每个定位计算的平均值(sem；由σ表示)的平均标准误差(比较3.8、3.9nmsd与4.0nmsem，图6c、图6f)，这表明所有台运动被校正。事实上，重复的试验表明，fnd定位的观察到的sd比预测的sem更精确，如由如下证明：应用点校正后的低不确定性比率(通过sd/sem计算)(0.71+0.07，pc；n＝26个fnd；图6g)，而交互相关和基准校正的精度比预期低2-3倍(3.23+2.14，cc；2.20+2.07，fd；n＝26个fnd；图6g)。
多个定位的分布
接下来我们试图从单个发光源表征多个定位的分布。先前的研究表明，这样的分布反映了由于图像采集期间荧光强度的随机波动导致的定位精度的随机变化。为了测试这一点，分析了在如下情况下的来自点校正应用的fnd的定位分布：不确定性值随机变化(变化；n＝997个定位；图9a；平均σ＝4.0nm)或受限制于精度值4±0.01nm(受限制；n＝997个定位；图9c)。我们观察到它们各自的sd值(3.3nm，3.5nm、变化相对于3.3nm、3.4nm、受限制[x、y轴])或它们的净分布范围(22.7nm、变化相对于24.3nm受限制，图9b、图9d)几乎没有差异；这表明精度的变化不是定位分布的主要部分。
由于单个定位的精度值是其预测sem的度量，因此询问同一发光源的多个定位分布是否遵循正态分布。事实上，来自fnd的定位分布紧密符合高斯分布，因为71.2％的分布落在1σ内，96.1％在2σ内，99.7％在3σ内(图9e、图9f)，并且高斯分布拟合由anderson-darling检验证实(h＝0；图9g)。基于此，测试了单个定位的预期sem值是否与多个定位的观测到的sd相关。为此，使用点校正来定位和校正不同荧光强度的fnd，并且基于其预期的精度值对每个定位位置进行分类。如图7a所示，观察到的定位sd与它们的预期的sem强烈相关(r2＝0.97)。用分离的alexa-647结合的抗体也观察到这种相关性(r2＝0.94，图7b)。另外，来自分离的alexa-647标记的抗体的多个定位导致类似于fnd的高斯分布，从而表明平均值周围的定位的正态分布是smlm的一般函数(图7c、图d)。
由于多个定位的分布中心代表了发光体的最佳近似位置，并且由于每个定位的分布平均值的可能距离是通过sem(σ)计算的，我们提出统计定义来区分术语的‘定位精度’和‘定位准确性’。‘定位精度’将被定义为根据汤普森方程计算的每个单独峰(σ)的定位精度，并且‘定位准确性’将被定义为距每个定位的分布平均值的可能距离。因此，为了以95.5％的置信度获得‘定位准确性’，对于单个定位(例如，荧光分子95.5％可能位于围绕10nm精度的单个定位峰的40nm宽区域中)，‘定位精度’需要乘以4(2*2σ)。由于从同一发光体的多个定位导出时‘定位准确性’可以明显更好(见讨论)，因此本文的‘定位精度’的范围将定义为σ，并且‘定位准确性’定义为为4σ。
抗体大小受限的准确性
单分子的准确定位一直是smlm的一个目标。已经采用各种统计方法来分析smlm图像，但是它们一直受限于总体的平均值估计，而对个体分子结构几乎没有深入的了解。尽管一些smlm研究已经使用相关em或对准平均来实现分子水平分析，但它们限于具有已知分子模式的结构(sochacki，shtengel等人，2014)。鉴于缺乏单分子成像和分析的合适框架，破译如t细胞微团簇的异构结构的纳米尺度组织已经具有挑战性。
除了台运动校正之外，准确定位单个分子的主要障碍是定位精度不足。为了找到单分子水平准确性所需的最小精度，fnd以提高水平的精度定位，并使用台运动校正的三种方法进行校正。得到的fnd定位分布覆盖了9个抗体，其在3×3n网格中按比例绘制(12nm大小的抗体间隔12nm)以在dstorm成像期间模拟密集标记的样品。
由于定位分布范围(>20nm)大于抗体大小(顶行，图7e、图7f)，因此在平均精度为5.4nm下，所有校正方法均不允许单独可视化抗体。在3.3nm处，应用点校正的fnd定位开始显示单独可视化的抗体位置，因为95.5％的定位分布在抗体大小内(2.5nm、2.5nm、[x，y]sd、点校正、中间行、图7e、图7f)。在1.0nm处，应用基准校正和点校正的定位都显示抗体的离散可视化，但是应用交互相关的定位没有显示(底行，图7e)。此外，测量了应用点校正定位(0.5nm、0.5nm、[x，y]sd；底行，图7e、f)的分布中的亚纳米sd，与采用基于反馈回路的台漂移消除实现的精度水平相匹配。这些结果显示了两件事。首先，交互相关不能实现足够的定位准确性以区分抗体位置，而基准校正只能在非常高的精度水平下进行。其次，为了以抗体大小受限的准确性进行dstorm成像，定位分布的范围(即定位准确性)需要小于抗体大小。因此，选择使用点校正进行台运动校正，并将3nm作为dstorm定位的峰的最低精度。
为了达到抗体大小受限的准确性，试图在dstorm成像期间优化alexa-647标记的抗体的定位精度。根据汤姆森方程，较小σ(即像素大小)、较低的背景噪声或较高的光子发射可以导致精度的提高(thompson，larson等人，2002)。使用不同的放大率设置对同一fnd进行定位显示，添加1.5倍放大率可降低σ值，并将精度提高0.5nm(图10)。
复用dstorm
尽管已知分子模式的细胞结构(例如微管、网格蛋白包被的核、核孔复合物)已经使用超分辨率显微镜技术进行了优化表征，但异质复合物如t细胞微团簇由于定位精度和复用的限制而难以研究。特别是后者，由于缺乏高性能smlm荧光报道物以及荧光报道物之间的色差和光谱交叠而受到阻碍。为了克服这些问题，开发了一种称为复用抗体大小受限的dstorm(madstorm)的新技术。
在准备madstorm成像时，所有抗体都需要直接与alexa-647缀合。一旦将alexa-647结合的抗体与固定的细胞样品结合并使用抗体大小受限的dstorm成像(图11a)，则使用剥离缓冲剂将它们解结合(图11b)。对于任何仍然结合的抗体，在没有氧清除溶液的情况下，通过暴露于647激光对其荧光进行光漂白(图11b)。细胞样品被一套新的alexa-647结合的抗体结合，成像，解结合和光漂白(图11c、图11d)。这些步骤可以无限循环，从而允许可能无限数量的分子目标以抗体大小受限的准确性进行dstorm成像。
免疫突触的复用超分辨率视图
图4显示了如上校正的jurkatt细胞中三种t细胞受体微复合物形成蛋白质(lat、slp76和pzeta)的连续成像的显微照片。
使用nikoneclipseti倒置显微镜、647nmaotf调制的lunb固态激光器(125mw)、100xsrapochromattirf物镜(1.49na)、andorixonultra897emccd相机(512×512、16μm像素)来获取tirf共焦图像。使用imagej软件上的thunderstorm插件(版本1.2)进行tirf共焦图像的dstorm定位。使用在matlab软件(r2014b)上编写的定制代码进行dstorm定位数据的点校正。
针对每种蛋白质的alexafluor-647标记的抗体依次进行结合，成像并从细胞中漂洗掉。同时对fnd进行成像以消除成像每个标记的抗体期间和之间的漂移。在200ms曝光下，每个抗体成像10000帧，总成像持续时间为2000秒(～33分钟)。每个标记的抗体进行洗涤和抗体染色需要～30分钟的额外时间段。每个蛋白质的成像总共需要约70分钟。在该复用图像中，平均定位精度为3.61nm，并且平均对准精度为2.07nm。因此，经过超过～3小时的成像和重复洗涤引起的机械扰动，漂移减少到～2nm。
在随后的超分辨率试验中，对于每个抗体1.5小时的总图像收集时间的20000帧已经使用每帧200ms的数据收集。迄今为止，已经进行了与29个不同蛋白质对应的29个单独抗体的复用成像。这涉及10天内的43.5小时的成像。在这10天中获得的这29个dstorm图像中，平均对准误差为2.0nm，这比以前的多色dstorm图像(通常20-40nm对准误差)(这通常用2-3种颜色进行以缩短持续时间(<1小时))提高了10倍以上。在没有fnd基准标记和由于fnd的光学特性(稳定性和寿命)而可以实施的追踪过程的情况下，不可能获得这些结果。
本文公开的组合物和方法至少包括以下实施方式。
实施方式1.一种基准标记组合物，其包含基底和固定在基底的表面上的荧光纳米金刚石，其中，基底和所固定的荧光纳米金刚石至少部分地顶涂覆有惰性顶部涂层。
实施方式2.根据实施方式1的基准标记组合物，其中，荧光纳米金刚石用聚合物固定在基底上。
实施方式3.根据实施方式2的基准标记组合物，其中，聚合物是带电聚合物或透明聚合物。
实施方式4.根据实施方式3的基准标记组合物，其中，带电聚合物是聚赖氨酸或聚精氨酸。
实施方式5.一种基准标记组合物，其包含基底、固定在基底的表面上的透明聚合物以及嵌入在透明聚合物中的荧光纳米金刚石。
实施方式6.根据实施方式5的基准标记组合物，还包含惰性顶部涂层。
实施方式7.根据实施方式1至6中任一项的基准标记组合物，其中，基底是玻璃。
实施方式8.根据实施方式1至7中任一项的基准标记组合物，其中，表面基本平坦。
实施方式9.根据实施方式1至8中任一项的基准标记组合物，其中，基底上的荧光纳米金刚石的密度在每100μm2约10至约500之间。
实施方式10.根据实施方式1至9中任一项的基准标记组合物，其中，荧光纳米金刚石的平均最大尺寸为约5nm至约100nm。
实施方式11.根据实施方式2至10中任一项的基准标记组合物，其中，聚合物在基底的表面上是图案化的。
实施方式12.根据实施方式2至11中任一项的基准标记组合物，其中，至少两个荧光纳米金刚石被固定在聚合物中，使得至少两个荧光纳米金刚石与基底的表面之间的距离不相同。
实施方式13.根据实施方式1至12中任一项的基准标记组合物，其中，荧光纳米金刚石是多色荧光纳米金刚石。
实施方式14.一种制造基准标记组合物的方法，包括：将荧光纳米金刚石固定在基底的表面上；以及用惰性顶部涂层涂覆所固定的荧光纳米金刚石和表面。
实施方式15.根据实施方式14的方法，其中，将荧光纳米金刚石固定在基底的表面上包括将包含荧光纳米金刚石和聚合物的水溶液的组合物施加到基底的表面。
实施方式16.根据实施方式14的方法，其中，将荧光纳米金刚石固定在基底的表面上包括：用聚合物溶液涂覆表面；以及将荧光纳米金刚石分散到聚合物涂层上。
实施方式17.根据实施方式16的方法，其中，在分散荧光纳米金刚石之前或之后被图案化聚合物涂层。
实施方式18.根据实施方式14至17中任一项的方法，其中，基底是玻璃。
实施方式19.根据实施方式15至18中任一项的方法，其中，聚合物是带电聚合物或透明聚合物。
实施方式20.根据实施方式14至19中任一项的方法，其中，将荧光纳米金刚石固定在基底的表面上包括：用与荧光纳米金刚石反应的官能团或官能化荧光纳米金刚石的官能团对基底的表面进行官能化；可选地对官能化的表面进行图案化；以及将包含荧光纳米金刚石或官能化荧光纳米金刚石的溶液应用于官能化表面。
实施方式21.根据实施方式14的方法，其中，将荧光纳米金刚石固定在基底的表面上包括：将包含透明聚合物的预形成形状固定在基底的表面上，其中，荧光纳米金刚石被包含在对象内或对象的表面上。
实施方式22.根据实施方式2至3和5至12中任一项的组合物，或根据实施方式15至19和21中任一项的方法，其中，聚合物是透明聚二甲基硅氧烷。
实施方式23.一种基准标记组合物，其包含标记复合物，其包含荧光纳米金刚石和用于非荧光成像方法的造影剂。
实施方式24.根据实施方式23的基准标记组合物，其中，非荧光成像方法是磁共振成像、计算机断层成像、x射线成像或电子显微术。
实施方式25.根据实施方式23或24的基准标记组合物，其中，标记复合物包含被封装在脂质体中的荧光纳米金刚石，并且脂质体还包封造影剂。
实施方式26.根据实施方式25的基准标记组合物，其中，造影剂是含锇部分。
实施方式27.根据实施方式26的基准标记组合物，其中，含锇部分是四氧化锇。
实施方式28.根据实施方式23的基准标记组合物，其中，标记复合物包含与含钆部分、含镝部分或高电子密度材料结合的荧光纳米金刚石。
实施方式29.根据实施方式28的基准标记组合物，其中，高电子密度材料包括金、铀或钨。
实施方式30.根据实施方式23至29中任一项的基准标记组合物，其中，荧光纳米金刚石被封装在二氧化硅中。
实施方式31.一种成像方法，其包括使样品与根据实施方式1至12或23至30中任一项的基准标记组合物接触；获取样品中的目标和荧光纳米金刚石的多个荧光图像；以及通过在所有图像中对准荧光纳米金刚石的位置来校正每个图像中的目标位置。
实施方式32.根据实施方式31的成像方法，其中，方法包括第二成像方法。
实施方式33.根据实施方式32的成像方法，其中，第二成像方法是磁共振成像、计算机断层成像、x射线成像或电子显微术。
实施方式34.根据实施方式32的成像方法，其中，荧光纳米金刚石被包封在脂质体中，其中，脂质体还包封含锇部分。
实施方式35.根据实施方式34的成像方法，其中，含锇部分是四氧化锇。
实施方式36.根据实施方式32的成像方法，其中，荧光纳米金刚石与含钆部分、含镝部分或高电子密度材料结合。
实施方式37.根据实施方式36的成像方法，其中，高电子密度材料包括金、铀或钨。
实施方式38.根据实施方式31至37中任一项的成像方法，该成像方法是三维成像方法。
实施方式39.一种成像方法，包括：使包含荧光纳米金刚石的基准标记组合物与样品接触；获取多个荧光图像，每个图像包括样品中的目标和荧光纳米金刚石；以及通过在所有图像中对准荧光纳米金刚石的位置来校正每个图像中的目标位置。
实施方式40.根据实施方式39的成像方法，其中，使荧光纳米金刚石(fnd)与样品接触包括将fnd上的官能团与样品结合。
实施方式41.根据实施方式39或40的成像方法，其中，方法包括第二成像方法。
实施方式42.根据实施方式41的成像方法，其中，第二成像方法是磁共振成像、计算机断层成像、x射线成像或电子显微术。
实施方式43.根据实施方式39至42中任一项的成像方法，其中，荧光纳米金刚石被包封在脂质体中，其中，脂质体还包封含锇部分。
实施方式44.根据实施方式43的成像方法，其中，含锇部分是四氧化锇。
实施方式45.根据实施方式39至44中任一项的成像方法，其中，荧光纳米金刚石与含钆部分、含镝部分或高电子密度材料结合。
实施方式46.根据实施方式45的成像方法，其中，高电子密度材料包括金、铀或钨。
实施方式47.根据实施方式39至46中任一项的成像方法，该成像方法是三维成像方法。
实施方式48.根据实施方式39至47中任一项的成像方法，其中，荧光纳米金刚石被包封在二氧化硅中。
实施方式49.根据实施方式31至48中任一项的成像方法，其中，样品是溶液、悬浮液、细胞、组织、细胞膜、细胞器或生物体。
实施方式50.一种超分辨率成像校正方法，包括：通过在每个图像中的每个荧光纳米金刚石的点扩散函数的高斯拟合来确定n个图像中的多个的每个图像中的m个荧光纳米金刚石中的每一个的位置坐标，其中，m≥4且n>1；位移每个图像以对准所有图像中的第一荧光纳米金刚石的坐标；对于除了第一荧光纳米金刚石外的每个荧光纳米金刚石，计算所有n个位移图像上的荧光纳米金刚石的位置分布的中心；以及位移每个图像，使得除了第一荧光纳米金刚石外的所有荧光纳米金刚石在所有图像上的位置变化最小化。
实施方式51.根据实施方式50的方法，其中，成像方法是二维方法。
实施方式52.根据实施方式50的方法，其中，成像方法是三维方法。
实施方式53.根据实施方式50至52中任一项的方法，其中，位移是平移、旋转或扩大/收缩中的至少一个。
实施方式54.根据实施方式50至53中任一项的方法，其中，第一荧光纳米金刚石是具有最大强度的荧光纳米金刚石。
实施方式55.根据实施方式50至54中任一项的方法，其中，位移每个图像，使得除第一荧光纳米金刚石外的所有荧光纳米金刚石的位置变化被最小化包括：针对除了第一荧光纳米金刚石外的所有荧光纳米金刚石计算荧光纳米金刚石的位置分布的中心在所有n个位移图像上的平均值；计算除第一荧光纳米金刚石外的所有荧光纳米金刚石在每个图像中的平均位置；以及位移给定图像以最小化针对除了第一荧光纳米金刚石外的所有荧光纳米金刚石的荧光纳米金刚石的位置分布的中心在所有n个位移图像上的平均值与除第一荧光纳米金刚石外的所有荧光纳米金刚石在给定图像中的平均位置之间的差。
通常，本发明可以可替换地包括本文公开的任何适当组件、由其组成或基本上由其组成。本发明可以另外地或可替换地被配制成缺乏或基本不含现有技术组合物中使用的或者另外地对于实现本发明的功能和/或目的不是必需的任何组分、材料、成分、佐剂或物种。涉及相同组分或性质的所有范围的端点是包含性的并且可独立组合(例如“小于或等于25wt％、或5wt％至20wt％”的范围包括“5wt％至25wt％”的范围的端点和全部中间值等)。公开除更广泛的范围之外的更窄范围或更具体的组并不是放弃更广泛范围或更大组。此外，本文的术语“第一”、“第二”等等不表示任何顺序、数量或重要性，而是用于表示一个元件与另一个元件。本文中的术语冠词(“一”和“一个”以及“该”)不表示数量的限制，并且将被解释为覆盖单数和复数两者，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾。“或”意指“和/或”。如本文所使用的后缀“(s)”旨在包括其修饰的术语的单数和复数两者，由此包括该术语中的一个或多个(例如，膜(s)包括一个或多个膜)。整个说明书中对“一些实施方式”、“另一实施方式”、“实施方式”等的引用意味着结合该实施方式描述的特定要素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文描述的至少一些实施方式中，并且可能存在或可能不存在于其他实施方式中。另外，应该理解的是，所描述的元件可以在各种实施方式中以任何合适的方式组合。
与量结合使用的修饰词“约”包括值并且具有由上下文所指示的含义(例如，包括与特定量的测量结果相关联的误差程度)。除非另有说明，否则本文的术语“前”、“后”、“底部”和/或“顶部”仅用于描述的方便而不限于任何一个位置或空间取向。“可选”或“可选地”意味着随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且描述包括事件发生的情况和不发生的情况。除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。“组合物”包括共混物、混合物、合金、反应产物等。
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尽管已经描述了特定实施方式，但是申请人或本领域其他技术人员可以想到目前未预见或可能未预见的替代、修改、变型、改进和实质等同物。因此，所提交的和可能修改的所附权利要求旨在涵盖所有这些替选方案、修改变型、改进和实质等同物。