促甲状腺激素受体抗体的检测方法与流程

本发明涉及测量体内血液特性的检测方法，具体是促甲状腺激素受体抗体的检测方法。

背景技术：

促甲状腺激素受体抗体(TRAb)又称膜受体抗体，是直接作用于甲状腺细胞膜上的TSH受体的抗体，属免疫球蛋白IgG，根据其作用可分为以下3类:①甲状腺刺激性抗体(TSAb)，又称甲状腺刺激免疫球蛋白(TSI)，与甲状腺滤泡膜上的TSH受体结合，刺激甲状腺肿大，增强其功能活性，是导致Graves病的主要病因。②甲状腺功能抑制性抗体(TFIAb):又称甲状腺功能抑制性免疫球蛋白(TFII)，与TSH受体结合后，可抑制甲状腺功能，引起甲低。③甲状腺生长刺激免疫球蛋白(TGI):可刺激甲状腺肿大，但不影响其功能。(1)TRAb对Graves病的诊断、治疗和预后的估计均具有重要的意义。Graves病患者TRAb阳性率可达95％以上，故可作为Graves病的诊断依据。应用抗甲状腺药物治疗时，随着病情的缓解，TRAb的活性可明显下降，当血中甲状腺激素水平正常后，若TRAb逐渐下降，以至转阴，则停药后复发的可能性小；若治疗后TRAb持续阳性，则说明治疗效果欠佳，停药后复发的可能性大。(2)TRAb在甲减和自身免疫性甲状腺炎患者也可出现阳性，有助于以上疾病的病因学诊断。

抗甲状腺受体抗体的检测方法很多，包括放射免疫分析法，酶联免疫吸附试验，罗氏公司开发的电化学发光法等方法，本发明开发了一种免疫荧光法检测促甲状腺激素受体抗体的检测方法。

技术实现要素：

本发明为了解决已知技术中促甲状腺激素受体抗体的检测方法存在漏检的缺陷，而提供一种准确性高，快速，简便的应用免疫荧光检测促甲状腺激素受体抗体的方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的试剂盒内装有检测用的阴性对照血清，阳性对照血清，浓缩磷酸缓冲液，封片剂，FITC标记的羊抗人球蛋白等试剂及生物薄片，生物薄片为取自大鼠甲状腺细胞制成，包被在载片的反应区内；测定方法为：在反应区内加待测血清，经孵育、漂洗、甩干后，加入FITC标记的羊抗人球蛋白，经孵育、漂洗、甩干后，在荧光显微镜下，甲状腺细胞膜上形成FITC标记的羊抗人球蛋白荧光复合物，并产生黄绿色荧光，本发明方法在灵敏度、特异性等指标均高于现有的方法。

发明内容

一.盒体

本发明的试剂盒为六面体形状，由盒盖与盒底组成，特征在于盒底内在靠近长边的任意一条边设置有放置试剂瓶的瓶架；瓶架上设有多个放置试剂瓶的孔；盒底的中间设有一个将盒底分成放置试剂与放置生物载片两部分的挡片，包括方形盒体(1)及与其一侧边弯折连体的盒盖(2)，其特征在于：盒体(1)内设置试剂架(3)，试剂架上有4个相同孔径的插孔(4)，插孔内放有FITC标记的羊抗人球蛋白(9)，阴性对照血清(10)，阳性对照血清(11)，封片剂(12)，盒底的中间设有一个将盒底分成放置缓冲液试剂(8)与放置生物薄片(5)两部分的纸质挡片(6)，生物载片(5)外面塑料包装(7)。

附图说明

图1是本发明试剂盒的示意图；

图2是本发明载片的示意图。

1.盒体 2.盒盖

3.试剂架 4.插孔

5.生物薄片 6.纸质挡片

7.生物薄片塑料包装 8.缓冲液

9.FITC标记的羊抗人球蛋白 10.阴性对照血清

11.阳性对照血清 12.封片剂

其中生物薄片(5)上5a、5b、5c为测试反应区。

二.试剂盒配备的物品

本发明试剂盒的瓶架3上各放置有1瓶阴性对照血清、阳性对照血清、封片剂、FITC标记的羊抗人球蛋白，盒底左部分放置有两瓶50ml浓缩的磷酸盐(含缓冲磷酸盐10.2克)缓冲液，右部分放置有8张带有包装袋的生物薄片。

三、生物玻片的制作

本发明生物薄片5的材质为聚苯乙烯，其尺寸与一般载片相似，其一面涂有聚赖氨酸涂层,载片上排列着3个方形的反应区5a、5b、5c，反应区在有涂层的一面向载片内部凹陷，形成25μl容积的凹槽，每个反应区的凹槽都包被有大鼠甲状腺细胞冰冻切片，载片外部包有一层不透光的包装袋，冰箱内-15℃以下保存。

具体实施方式

实施例1

1.本发明检测方法取生物薄片放置室温20min后，加入1：100PBS稀释的待检血清，20～37℃1～2h，0.01mol/L PBS洗2min 3次；滴加0.01mol/L PBS1:100稀释的FITC标记的羊抗人球蛋白，20～37℃1～2h，0.01mol/L PBS洗2min 4次；封片剂封片，荧光显微镜10ⅹ40倍视野下观察；FITC在490～495nm激发，在520～530nm发射荧光，在甲状腺细胞膜上如有黄绿色，则为阳性。

2.电化学发光法

2.1仪器：Roche cobas e411电化学发光分析仪

2.2试剂促甲状腺素受体抗体测定试剂盒(电化学发光法)德国罗氏诊断产品有限公司生产，批号为19045901，采用竞争法原理，整个过程27分钟完成。

2.3测定步骤：第一次孵育：50μL血清标本和预处理缓冲液(PT1)以及预处理试剂缓冲液(PT2)一起孵育，PT1和PT2由可溶猪TSH受体(pTSHR)的免疫复合物前体物和生物素化抗猪TSH受体鼠单克隆抗体组成。患者血清中TRAb与TSH受体复合物发生反应。

第二次孵育：在孵育液中加入缓冲液，TRAb进一步与TSH受体反应。

第三次孵育：加入链霉亲和素包被的微粒和钌复合物标记的人甲状腺刺激性单克隆抗体(M22)后，通过对被标记的M22结合的抑制能力测定结合的TRAb。此完整的复合体在生物素和链亲和素相互作用下形成固相。

将反应液吸入检测池中，检测池中的微粒通过电磁作用吸附在电极表面。未结合的物质通过Elecsys系统缓冲液除去。在电极上加以一定的电压，使复合体化学发光，用光电倍增器检测发光的强度。通过检测仪的定标曲线得到最后的检测结果，定标曲线是通过2定标点和不同试剂浓度获得的主曲线生成。

3.为了更好地理解本发明，下面通过用两种检测方法得出的结果来进一步说明本发明在检测促甲状腺素受体抗体方面的积极效果：

3.1研究对象2016年10月至2016年12月在我院甲状腺患者101例,男性56例,女性45例,年龄40～60岁,平均48.5岁,病程4个月至5.7年,平均3.6年。

3.2促甲状腺素受体抗体检测方法：1.本发明检测方法；2.电化学发光法。分别采用此两种方法检测101例甲状腺患者促甲状腺素受体抗体检测，同时应用两种方法测定101例患者促甲状腺素受体抗体。

表1两种方法检测结果比较

表2两种方法检测结果比较(％)

通过表1、表2可看本发明的测试方法在灵敏度,特异性,阳性预测值，阴性预测值等指标与电化学发光法比较各项指标非常接近的，两种方法测定结果阴阳性符合率大于90％，因此，可以应用本方法进行甲状腺素受体抗体检测。