一种干血斑中维生素D含量的检测方法与流程

文档序号:12784734阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种干血斑中维生素D含量的检测方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:

(1)取干血斑样本,放入离心管中,加入超纯水和乙腈内标液,温浴超声,而后进行涡旋,离心,将得到的上清液转移至96孔板中,氮气吹干;

(2)利用衍生剂进行衍生,采用乙醇终止衍生反应,将衍生后的溶液转移到离心管中,氮气吹干,加入40%乙腈水溶液进行复溶,即得进样液;

(3)采用高效液相色谱串联质谱同时检测步骤(2)得到进样液中25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的含量。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,针对直径为3.5mm的干血斑样本,步骤(1)所述超纯水的加入量为40-60μL,优选50μL;

优选地,步骤(1)所述乙腈内标液与超纯水的体积比为(6-4):1,优选5:1。

3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述乙腈内标液中含有60ng/mL的25羟基维生素D2内标和60ng/mL的25羟基维生素D3内标。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述温浴的温度为50-70℃,优选60℃;

优选地,步骤(1)所述温浴的时间为30-60min,优选30min;

优选地,步骤(1)所述超声的时间为1-3min;

优选地,步骤(1)所述涡旋的时间为20-60s,优选30s;

优选地,步骤(1)所述离心的转速为10000-15000rpm,优选12000rpm;

优选地,步骤(1)所述离心的时间为5-8min,优选5min。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述衍生剂为4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮的乙酸乙酯溶液;

优选地,所述4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮的乙酸乙酯溶液的浓度为0.05-0.2mg/mL,优选0.1mg/mL;

优选地,步骤(2)所述衍生剂的加入量为50μL;

优选地,步骤(2)所述乙醇的加入量为40μL。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述高效液相色谱串联质谱检测时的色谱条件如下:采用梯度洗脱程序,0.1%甲酸乙腈作为流动相A,0.1%甲酸水溶液作为流动相B。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述高效液相色谱串联质谱检测时的质谱采用MRM模式检测,应用ESI正离子模式;

优选地,所述MRM模式检测的参数如下:气帘气CUR,25psi;碰撞气CAD,8psi;离子喷雾电压5300V;加热温度500℃;离子源喷雾气GS1,35psi;离子源辅助加热气GS2,45psi;入口电压10V。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其特征在于,所述干血斑样本包括干血斑校准曲线样本和待检测的干血斑样本。

9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述干血斑校准曲线样本的制备为:向全血中加入系列25羟基维生素D2和25羟基维生素D3混合标准溶液,稀释10倍,使二者的加入浓度均为5、10、25、50、100ng/mL,分别取50μL各浓度的血液和对应未加标全血,滴加至滤纸上,干燥即得。

10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,待检测的干血斑样本的制备为:取全血,滴加至滤纸上,干燥形成待检测的干血斑样本。

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