本发明属于化学分析
技术领域：
，涉及一种干血斑中维生素D含量的检测方法。
背景技术：
：维生素D[VitaminD(VD)]是一种脂溶性维生素，主要包括植物源的维生素D2和阳光照射合成的维生素D3，二者的生物活性具有差异，需要同时监控。25-羟基维生素D是维生素D在人体内的主要存储形式，是临床检测评价维生素D营养状况的最佳指标(BunchDR,MillerAY,WangS.Developmentandvalidationofaliquidchromatography-tandemmassspectrometryassayforserum25-hydroxyvitaminD2/D3usingaturbulentflowonlineextractiontechnology.[J].ClinicalChemistry&LaboratoryMedicine,2009,47(12):1565-72.)。维生素D可以帮助人体利用钙磷，强健骨骼(MüllerDN,KleinewietfeldM,KvakanH.VitaminDreview.[J].JournalofRenin-Angiotensin-AldosteroneSystem,2011,12(2):125-8.)。人体内维生素D水平若长期处于异常水平，会导致各种疾病。维生素D缺乏可能导致儿童佝偻病，也是继发性甲状旁腺机能亢进症的常见病因，还与糖尿病、癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病等有关(HolickMF.VitaminDdeficiency.[J].NewEnglandJournalofMedicine,2007,357(3):266-81.)。而维生素D过量，可能引起高血钙和高尿钙(GallagherJC,SmithLM,YalamanchiliV.IncidenceofhypercalciuriaandhypercalcemiaduringvitaminDandcalciumsupplementationinolderwomen.[J].Menopause-theJournaloftheNorthAmericanMenopauseSociety,2014,21(11):1173-80.)。因此，对于机体内维生素D水平的检测非常有必要。发现维生素D两个世纪以来，传统维生素D的检测方法主要包括酶联免疫法、放射免疫法、免疫化学发光法、竞争蛋白结合法、高效液相色谱(HPLC)法，它们主要存在以下问题：(1)免疫法和竞争蛋白结合法会受到生物样本中高亲和力结合蛋白的基质干扰，存在准确度低、特异性差的问题，同时无法区分维生素D2和维生素D3；(2)HPLC法前处理复杂、分析时间长，通量低。LC-MS/MS法具有选择性强、灵敏度高、检测时间短的特点，利用LC-MS/MS法检测血清中的25-羟基维生素D已经成为了行业金标准，将这种方法称为血清法，该方法目前是行业领域内应用最广泛的维生素D检测方法(RothHJ,Schmidt-GaykH,WeberH,etal.Accuracyandclinicalimplicationsofseven25-hydroxyvitaminDmethodscomparedwithliquidchromatography-tandemmassspectrometryasareference[J].AnnalsofClinicalBiochemistry,2008,45(Pt2):153-9.)。血清法检测维生素D的含量需要的血液样本量大为2-3mL；对于新生儿来说，一个3公斤的正常宝宝全身的含血量大概为220mL，假设抽血量为3mL，那么就意味着宝宝的失血量为1.4％，可能威胁到宝宝的正常发育成长。为了预防疾病而让宝宝处于危险中，这无疑本末倒置。除了需血量大之外，血清法运输保存都有严格的要求，采血也需要专业的医护人员，对于偏远地区的人来说检测非常不方便。因此，急需有一种新的方法来补充血清法的不足。干血斑法用血量少，适合新生儿检测，只需要在足跟或指尖采几滴血即可。这种方法不需要专业的医护人员来采血，只要按照说明书上的示范操作即可在家完成血斑的制作，而且保存持久、运输方便，因此即使地处偏远地区，也可享受到知名大医院的精准检测，只需要将样本快递到该医院即可，方便快捷。基于这些优点，干血斑法非常适宜作为血清法的补充，投入临床检测。因此，在本领域中，开发一种干血斑中维生素D的检测方法迫在眉睫。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种干血斑中维生素D含量的检测方法。为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：一方面，本发明提供一种干血斑中维生素D含量的前处理方法，所述方法包括以下步骤：(1)取干血斑样本，放入离心管中，加入超纯水和乙腈内标液，温浴超声，而后进行涡旋，离心，将得到的上清液转移至96孔板中，氮气吹干；(2)利用衍生剂进行衍生，采用乙醇终止衍生反应，将衍生后的溶液转移到离心管中，氮气吹干，加入40％乙腈水溶液进行复溶，即得进样液；(3)采用高效液相色谱串联质谱同时检测步骤(2)得到的进样液中25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的含量。在本发明中，通过在干血斑样本中加入超纯水加强对血斑的浸润性，保证提取率，缩短提取时间，利用含内标的乙腈溶液作为沉淀剂沉淀蛋白，同时乙腈作为有机溶剂完成25羟基维生素D(25OHD)的提取。本发明使用干血斑法检测维生素D，用血量少，适合新生儿检测，不需要专业的医护人员来采血，样本保存持久、运输方便，非常适宜作为血清法的补充，更加准确便捷地服务大众。优选地，针对直径为3.5mm的干血斑样本，步骤(1)所述超纯水的加入量为40-60μL，例如40μL、43μL、45μL、48μL、50μL、53μL、55μL、58μL或60μL，优选50μL。优选地，步骤(1)所述乙腈内标液与超纯水的体积比为(6-4):1，例如6:1、5.8:1、5.5:1、5.3:1、5:1、4.8:1、4.5:1、4.3:1或4:1，优选5:1。优选地，步骤(1)所述乙腈内标液中含有60ng/mL的25羟基维生素D2内标(25OHD2-d3)和60ng/mL的25羟基维生素D3内标(25OHD3-d3)。优选地，步骤(1)所述温浴的温度为50-70℃，例如50℃、53℃、55℃、58℃、60℃、63℃、65℃、68℃或70℃，优选60℃。优选地，步骤(1)所述温浴的时间为30-60min，例如30min、33min、35min、38min、40min、43min、45min、48min、50min、53min、55min、58min或60min，优选30min。优选地，步骤(1)所述超声的时间为1-3min，例如1min、1.5min、2min、2.5min或3min，优选1min。优选地，步骤(1)所述涡旋的时间为20-60s，例如20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s或60s，优选30s。优选地，步骤(1)所述离心的转速为10000-15000rpm，例如10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm或15000rpm，优选12000rpm。优选地，步骤(1)所述离心的时间为5-8min，例如5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min或8min,优选5min。优选地，步骤(2)所述衍生剂为4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)的乙酸乙酯溶液。优选地，所述4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮的乙酸乙酯溶液的浓度为0.05-0.2mg/mL，例如0.05mg/mL、0.07mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.12mg/mL、0.15mg/mL、0.18mg/mL或0.2mg/mL，优选0.1mg/mL。优选地，步骤(2)所述衍生剂的加入量为50μL。优选地，步骤(2)所述乙醇的加入量为40μL。优选地，步骤(3)所述高效液相色谱串联质谱检测时的色谱条件如下：采用梯度洗脱程序，0.1％甲酸乙腈作为流动相A，0.1％甲酸水溶液作为流动相B。优选地，步骤(3)所述高效液相色谱串联质谱检测时的质谱采用MRM模式检测，应用ESI正离子模式。优选地，所述MRM模式检测的参数如下：气帘气(CUR)，25psi；碰撞气(CAD)，8psi；离子喷雾电压(IS)，5300V；加热温度(TEM)，500℃；离子源喷雾气(GS1)，35psi；离子源辅助加热气(GS2)，45psi；入口电压(EP)，10V。优选地，所述干血斑样本包括干血斑校准曲线样本和待检测的干血斑样本。优选地，所述干血斑校准曲线样本的制备为：向全血中加入系列25羟基维生素D2和25羟基维生素D3标准品溶液，稀释10倍，使二者的终浓度均为5、10、25、50、100ng/mL，分别取50μL各浓度的血液和对应未加标全血，滴加至滤纸上，干燥即得。优选地，待检测的干血斑样本的制备为：取全血，滴加至滤纸上，干燥形成待检测的干血斑样本。在实际制备过程中，用采血针在指尖或足跟处将皮肤刺破，将血液涂到采血滤纸上，室温干燥过夜，放入含有干燥剂的密封袋中-20℃保存，得到待检测的干血斑样本。采用干血斑法检测维生素D，一个样本只需要370μL有机溶剂即可完成检测而目前已知的文献中检测维生素D的体系中有机溶剂的使用量都大于600μL。前处理方法中提取方式为温浴30min加超声1min，只需31min即可完成维生素D的提取，经过优化，整个前处理过程保持在90min左右，简单快速。相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明利用超纯水对干血斑样本进行浸润，保证提取率的同时缩短提取时间。本发明利用ESI离子源，开发了全新的液质检测方法，大大缩短了25羟基维生素D的检测时间，仅需要3分钟，提高了检测效率。同时，本发明整个检测过程使用的有机溶剂少，环保节能，适合大规模用于临床开展，商业化价值高。附图说明图1为实施例1中干血斑法前处理时间流程图；图2为采用高效液相色谱串联质谱检测时25羟基维生素D(25OHD2、25OHD3)及其内标(25OHD2-d3、25OHD3-d3)衍生物的色谱图；图3为本发明中干血斑法与血清法的相关性曲线图。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。在本发明的实施例中涉及到的仪器设备和试剂如下：ABSCIEXTripLeQuad5500液质联用仪，购自ABSCIEX公司；C18色谱柱(5μm,50×2.1mm)，购自岛津公司。试剂与耗材：内标：25OHD2-d3(6,19,19)、25OHD3-d3(6,19,19)，购自Sigma；标准品：25OHD2、25OHD3，购自Sigma；Whatman903滤纸，购自Whatman；甲酸为HPLC级，购自Sigma；乙腈、乙醇均为HPLC级，购自DIKMA；水(MiLLi-Q超纯水，MiLLipore)；PTAD：4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5二酮，购自Sigma。实施例1I、干血斑样本制作：(1)干血斑校准曲线样本制作：向全血中加入系列25羟基维生素D2和25羟基维生素D3标准品溶液，稀释10倍，使两种25OHD的添加终浓度均为5、10、25、50、100ng/mL，分别取50μL各浓度的血液和对应未加标全血，滴加至滤纸上，干燥即得，-20℃保存。(2)待测干血斑样本准备：用采血针在指尖或足跟处将皮肤刺破，将血液涂到采血滤纸上，室温干燥过夜，放入含有干燥剂的密封袋中-20℃保存。(3)质控干血斑的制备：分别向1mL全血中，加入18μL、35μL的1μg/mL的25OHD2和25OHD3混标，使两种25OHD的添加终浓度均为17.7ng/mL(Q1)、33.8ng/mL(Q2)，取50μL，滴加至滤纸上，干燥即得，-20℃保存。(4)全血的制备：预先测定一批血样，混合25OHD2和25OHD3含量低的全血即得。(5)日内、日间精密度和添加回收率实验的干血斑样本制备：制备方法同干血斑校准曲线样本的制备方法，使加入的25OHD2和25OHD3浓度均为5、12.5、25、100ng/mL。II、干血斑样本的前处理(1)用BSD700打孔机在干血斑上取一个3.5mm微圆盘滤纸样品；将上述微圆盘滤纸样品放入1.5mL的PCR管中，加入50μL的超纯水，随后加入250μL的乙腈内标液[含有60ng/mL的25OHD2-d3(6,19,19)和60ng/mL的25OHD3-d3(6,19,19)]，60℃温浴30min后超声1min，涡旋30s，12,000rpm离心5min，将200μL上清转移到96孔板中，90℃氮气吹干。(2)加入50μL含有0.1mg/mLPTAD的乙酸乙酯，室温30min，加入40μL乙醇分解过剩的反应试剂，将全部溶液转入到500μL的离心管中，氮气吹干，在上述试管中加入75μL的40％乙腈/水，涡旋30s，12,000rpm离心2min。样本前处理过程的时间流程如图1所示。III、采用高效液相色谱串联质谱检测取如上步骤(2)处理得到的50μL上清液进行检测，采用ABSCIEXTripLeQuad5500液质联用仪(ABSCIEX)，岛津C18色谱柱(5μm，50×2.1mm)，液相条件如下：采用梯度洗脱程序，0.1％甲酸乙腈作为流动相A，0.1％甲酸水溶液作为流动相B，流速0.5mL/min。梯度洗脱程序见表1。在这样的液相条件下，25OHD3及其内标在1.49min出峰，25OHD2及其内标在1.52min出峰，如图2所示。表1梯度洗脱程序时间(min)A(％)B(％)035650.2535650.598229822.1356533565质谱采用MRM模式检测，应用ESI正离子模式，MRM部分参数见表2。其余参数如下：气帘气(CUR)，25psi；碰撞气(CAD)，8psi；离子喷雾电压(IS)，5300V；加热温度(TEM)，500℃；离子源喷雾气(GS1)，35psi；离子源辅助加热气(GS2)，45psi；入口电压(EP)，10V。表2MRM参数目标物Q1Q3DwellDP(V)CE(eV)25OHD2570.4298.2100402625OHD3558.4298.2100402225OHD2-d3573.4301.2100502525OHD3-d6564.4301.21003525实施例2该实施例与实施例1的区别仅在于，在干血斑样本的前处理中，步骤(1)中转移到96孔板中的上清为250μL，步骤(2)中加入50μL含有0.1mg/mLPTAD的乙酸乙酯，室温60min；在采用高效液相色谱串联质谱检时，取步骤(2)采用50μL的40％乙腈水溶液复溶，25μL上样检测，乙腈和水中添加的甲酸缓冲剂的比例为0.2％，除此之外，其余条件均与实施例1相同。实施例3在本实施例中为了对实施例1的干血斑检测方法进行准确度评估，进行了加标回收率试验，具体方法如下：按照干血斑前处理方式处理已知25OHD2和25OHD3加标浓度均为12.5、25、100ng/mL的干血斑样本，每个浓度重复六个平行，每个平行检测一针，即可完成加标回收率试验(加标回收率应满足80％-120％)，表3为两种25OHD三个浓度的平均回收率。表3添加回收率结果实施例4在本实施例中为了对实施例1的干血斑检测方法进行精密度评估，进行了日内精密度和日间精密度测试，具体方法如下：对于日内、日间精密度实验，按照干血斑前处理方式处理已知25OHD2和25OHD3加标浓度均为5、25、100ng/mL的干血斑样本，每个浓度重复六个平行，每个平行检测一针。日内精密度需在一天内完成，日间精密度需要连续进行六天。所得日内、日间精密度应控制在20％以内。结果见表4。表4日内、日间精密度结果实施例5对实施例1的干血斑检测方法进行LOQ和临床可报告范围的评估，方法如下：按照干血斑前处理方式处理加标浓度为0、5、10、25、50、100ng/mL的校准品干血斑样本，以高效液相色谱串联质谱检测方法检测。检测结果以色谱峰面积为纵坐标，以分析物的浓度为横坐标，绘制校准品曲线，线性权重取1/x，结果见表5。其中相关系数r均大于0.99，线性和临床可报告范围是5-100ng/mL。方法定量限(LOQ)指的是线性范围的最低浓度点，且满足日内、日间精密度均小于20％的浓度。检测结果显示LOQ为5ng/mL。表5校准曲线回归方程和相关系数目标物回归方程相关系数r25OHD2y＝1.82954e-4x+0.001290.9980825OHD3y＝6.87286e-5x+0.003280.99036实施例6对实施例1的干血斑检测方法的临床有效性进行评估，采用目前市场上使用较为普遍、行业认可度高的血清法作为对比，方法如下：为了验证实施例1的干血斑检测方法的临床有效性，前后开展了100人的临床检测，通过与血清法进行临床检测结果的对比计算，判定正常值，给出营养指标的参考区间。临床检测样本年龄范围为18-66岁。血清法：取样品血清75μL加入编号后的1.5mLEP管，加入75μL0.2MZnSO4，涡旋振荡20s；加入150μL含内标的甲醇溶液，涡旋振荡20s后加入375μL正己烷，涡旋振荡1min；13000rpm离心5min。转移上清液至新的0.5mlEP管中，用50℃氮气吹干溶液；用75μL70％甲醇溶液复溶，涡旋振荡30s后，转移70μL至进样瓶，液质检测。为了考察干血斑法的重现性，取血清法检测结果相近的6点，采用干血斑法连续检测两天，对两天的干血斑值求差异度，差异度为两值均值与第1d结果的差值除以两值均值，结果如表6所示，表明检测差异度在6％之内，稳定性高。表6干血斑检测差异度第1天第2天差异度143.043.30.3252.947.1-5.8344.143.0-1.3451.351.1-0.2558.157.1-0.9645.848.02.3取血清法检测结果为20、30、40、50ng/mL附近的点各3个，以干血斑法的总25OHD为横坐标，血清法的总25OHD为纵坐标，绘制相关性曲线，结果见图3，相关系数R2＝0.8439，表明两种方法相关性高，基于血清法检测的可靠性，认为干血斑法检测维生素D可靠有效。对100人的结果进行分析，干血斑法和血清法两种方法的营养指标匹配度为85％。根据血清临床检测结果和其营养指标的正常缺乏值，划分干血斑参考区间，结果见表8。表8干血斑营养参考区间总25OHD含量(ng/mL)描述21-63正常13.5-21缺乏＜13.5严重缺乏申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页1 2 3