本发明涉及中药质量检测领域，具体涉及含有黄芪和莪术药材的复方药物制剂中的黄芪甲苷和牻牛儿酮的含量检测方法。
背景技术：
黄莪胶囊是浙江康恩贝制药股份有限公司、浙江现代中药与天然药物研究院有限公司联合中国中医研究院广安门医院研制的现代中药复方制剂，其组方由黄芪、桃仁、莪术、大黄、土茯苓、薏苡仁、益母草、夏枯草、肉桂、北豆根、桔梗、川牛膝共12味中药组成，具有益气活血、清热利湿功能，主治前列腺增生气虚血瘀、湿热阻滞证。黄莪胶囊已于2011年获国家新药证书，并经SFDA批准上市。
黄莪胶囊是依据中医理论和临床实践配制而成的治疗前列腺增生药物，其组方多 达十二味中药材，制备工艺复杂。中国专利ZL200510060631.3公开了黄莪胶囊治疗前列腺增生症的相关研究结果及其制备方法，其制备方法是取肉桂、大黄、薏苡仁、桃仁碎成细粉；莪术饮片提挥发油；黄芪水提醇沉；桃仁、薏苡仁、土茯苓、北豆根、夏枯草、益母草、桔梗、川牛膝的饮片、莪术药渣，水提滤液与黄芪乙醇液合并浓缩制干膏，粉碎，过筛，加入莪术挥发油及肉桂等药物的细粉，配以药用辅料制成胶囊。黄芪是黄莪胶囊组方的君药，益气、推动血行，可消散血瘀，是黄莪胶囊的主要药效成分之一，文献“HPLC-ELSD测定黄莪通闭胶囊中黄芪甲苷的含量”和药品注册标准都采用HPLC-ELSD法测定了黄莪胶囊中黄芪甲苷的含量，虽然后者还采用薄层色谱法鉴别莪术、大黄、熊果酸和桂皮醛，但这些已公开资料都仅对黄芪甲苷进行定量分析，缺乏对其他组分的测定分析，有可能导致其它组分含量的不稳定甚至缺乏，这将使黄莪胶囊的质量难以得到全面控制。
尤其是，中药材莪术在黄莪胶囊组方中为臣药，具有行气活血功效，但其主要的有效成分是一种易挥发性油，其在制备和储藏过程中都容易因为挥发而含量损失；而且，莪术油的生物利用度较低。因此，如何有效减少莪术油在生产、储存过程中的挥发、提高其生物利用度,达到安全有效、质量可控的目标，是黄莪胶囊在技术研究中要重点解决的问题。研究人员在黄莪胶囊制备过程中采用β-环糊精包结莪术油的办法解决了这个难题。而有关研究也表明，莪术油包结率的高低影响着黄莪胶囊治疗前列腺增生症的疗效。但是莪术油的成分较为复杂且含量较低，国内外常用牻牛儿酮、莪术醇、莪术二酮等为莪术油质量的检测指标；而牻牛儿酮的含量最为丰富且最稳定，因此，以牻牛儿酮为莪术油的质量检测指标是一种较受推荐的方法。所以，为了保证黄莪胶囊组方中各味药材的协同作用，为了保证黄莪胶囊质量的稳定性和疗效的有效性，在黄莪胶囊的质量控制方法中，不仅要检测黄芪甲苷的含量，而且有必要同时测定其牻牛儿酮的含量。
黄芪甲苷通常作为评价黄芪药材质量优劣的标准，目前含有黄芪甲苷的中药有黄 芪药材和含有黄芪的胶囊、颗粒、散剂等中药复方制剂。而黄芪甲苷为环阿尔廷型三萜皂苷类化合物，易溶于甲醇、乙醇、丙酮，难溶于氯仿、乙酸乙酯等弱酸性有机溶剂。其早期的含量测定主要使用薄层扫描法，如张怡等(中国医药杂志2004.1(5):185-186)采用双波长-薄层色谱法测定康胃泰胶囊中黄芪甲苷的含量，样品平均回收率为98.27%；但该方法重复性较差。随着应用研究的不断深入，逐渐发展出采用HPLC法分离测定黄芪甲苷的含量，该方法也先后经历HPLC-UV法和HPLC-ELSD法的演变，ELSD法具有灵敏度高、适用性广的优点，尤其适用于在近紫外区无紫外吸收或紫外吸收较弱的物质，如黄芪甲苷等。李毅等(时珍国医国药2011.22(3):768-769)先采用石油醚溶解活血散结合剂（组方为当归、黄芪、莪术、川芎、昆布等药材），水层多步正丁醇提取，然后用氨试液洗涤，再将正丁醇溶液于水浴中蒸干，最后加甲醇溶解得供试品溶液，用shim-pack C18-ODS(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以乙腈-水（32∶68）流动相测定活血散结合剂中黄芪甲苷的含量，结果表明HPLC-ELSD法操作简便，重复性好，灵敏度高，专属性强。
《中国药典》2010版以牻牛儿酮为指标，采用薄层色谱法鉴别莪术药材；且莪术药 材的含量测定规定莪术挥发油的含量不得少于1.5%（mg/g）。牻牛儿酮作为莪术药材质量评价指标已得到普遍认可，其为倍半萜类化合物，其能溶于甲醇、乙醇、石油醚等有机溶剂中，不溶于水。莪术等含有牻牛儿酮的药材和注射剂、胶囊等复方制剂中牻牛儿酮含量测定早期曾经采用比色法，但精密度、重复性和适用性存在局限，后来多采用HPLC法和GC法，HPLC法是牻牛儿酮含量测定最常使用的检测方法。梁小洁等(贵州师范大学学报：自然科学版2011.29(1):92-94)直接用甲醇溶解保妇康泡沫剂制得供试品溶液，用SpherisorbC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以乙腈-甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶25∶25）为流动相测定牻牛儿酮的含量。结果表明，HPLC法测定牻牛儿酮含量操作简单，重复性好。
已有上百种同时含有黄芪和莪术的中药复方制剂被批准上市，但目前对这类复方 制剂的质量控制大部分仍采用以黄芪甲苷为单一的质量控制指标，也尚未见一次性同时测定黄芪甲苷和牻牛儿酮含量的报道。这是由于在提取黄芪甲苷时，多采用水溶解后多步醇提碱洗，这是公认的提取黄芪甲苷的方法，但是牻牛儿酮不溶于水，采用该传统提取方法无法同时提取黄芪甲苷和牻牛儿酮，高效液相色谱难以测到黄莪胶囊中的牻牛儿酮。因此，同时提取黄芪甲苷和牻牛儿酮是采用高效液相色谱法检测黄莪胶囊质量的前提，也是目前研究的难点。
技术实现要素：
：本发明的目的在于提供一种同时测定含有黄芪和莪术药材的复方药物制剂中的黄芪甲苷和牻牛儿酮含量的高效液相色谱测定方法。该方法可同时测定此类复方药物制剂中黄芪甲苷和牻牛儿酮的含量，具有良好的精密度、重现性和可靠性，可用于包括已上市的黄莪胶囊在内的含有黄芪和莪术的复方药物制剂的质量控制。
本发明运用循证医学研究方法对黄莪胶囊治疗前列腺增生症的中医理论进行分 析，结果发现，黄芪益气、推动血行，可消散血瘀，莪术行气活血，两者是黄莪胶囊的主要药效成分；有关临床研究证实，缺乏黄芪和莪术的黄莪胶囊在治疗前列腺增生症上效果微弱，黄芪和莪术是黄莪胶囊组方中相当重要的组分。国内外相关研究分别将黄芪甲苷、牻牛儿酮作为黄芪和莪术的质量检测指标，但是黄芪甲苷传统的水提醇沉法无法同时提取牻牛儿酮，因此目前采用高效液相色谱法一次性同时检测黄芪甲苷和牻牛儿酮含量仍有一定的困难。本发明针对黄芪甲苷和牻牛儿酮不同的化学性质，首先对黄莪胶囊进行前处理，然后直接进样检测黄芪甲苷和牻牛儿酮的含量。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案包括：
含有黄芪和莪术药材的复方黄莪胶囊制剂的测定方法，
（1）供试品溶液的制备：取黄莪胶囊制剂，倾出内容物，混匀，精密称定10g置250ml容量瓶中，精密加甲醇100ml，摇匀称定重量；超声处理（功率150W，频率50Hz）30min，放置24h，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀；静置12h，转速2000r/min离心5min，吸取上清液，过45μm滤纸，收集滤液；
滤液直接过中性硅胶氧化铝柱，用甲醇洗脱，洗脱液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备：取黄芪甲苷和牻牛儿酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含黄芪甲苷0.5mg、牻牛儿酮0.10mg的溶液，即得对照品溶液；
（2）高效液相色谱条件：采用Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；以乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱：0-20min，30%A→40%A；20-30min,40%A→60%A；
30-50min，60%A→70%A，流速为1.0ml/min，柱温25～40℃；AllerchELSD2000型蒸发光散射检测器，检测参数：漂移管温度101℃，氮气流速2.7L/min；检测波长为200～215nm；
（3）检测方法，按照《中国药典》2010年版1部附录ⅥD高效液相色谱法测定黄莪胶囊中黄芪甲苷和牻牛儿酮的含量：精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，计算，即得。
本发明所要解决的技术问题在于：
（1）采用甲醇溶解黄莪胶囊粉末代替传统的水溶解，解决了无法采用黄芪甲苷传统的提取方法同时提取黄芪甲苷和牻牛儿酮的问题，使得采用高效液相色谱法同时测定黄莪胶囊中黄芪甲苷和牻牛儿酮这两种主要成分的含量成为可能。
（2）采用甲醇过滤后直接过中性硅胶氧化铝柱代替多次醇提碱洗，不但有效去除了供试品溶液中的磷脂、色素等杂质，而且减少了提取中黄芪甲苷和牻牛儿酮的含量损失，提高了含量测定的准确度。
（3）采用HPLC-ELSD法一次性同时测定了黄莪胶囊中黄芪甲苷和牻牛儿酮的含 量，并对其测定波长进行了研究，发现黄芪甲苷和牻牛儿酮在208nm处吸收良好。
通过本发明黄莪胶囊质量检测方法，可以一次性同时有效地测定黄莪复方制剂中 黄芪甲苷和牻牛儿酮的含量，提高了黄莪胶囊质量测定的准确性和产品的稳定性，有利于提高工业化生产的质量控制。
具体实施方式
本发明结合具体实施例进一步说明如下。
实施例1
1、仪器：
Agilent 1100高效液色谱仪；Allerch ELSD-2000蒸发光散射检测器；中性氧化铝柱4g/12ml；KQ-250DB数控超声波清洗器；METTLER AE240电子天平。
2、试药：
采用黄莪胶囊（浙江康恩贝制药股份有限公司，批号：091207）；不含黄芪和莪术的黄莪胶囊（浙江康恩贝制药股份有限公司，批号:100824）；黄芪甲苷（中国食品药品检定研究院，批号：110781-200613，含量测定用）；牻牛儿酮（中国食品药品检定研究院，批号：111665-200902，98.8%，含量测定用）；甲醇和乙腈（色谱纯）；其他试剂都为分析纯。
3、色谱条件：
Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；以乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0-20min，30%A→40%A；20-30min，40%A→60%A；30-50min，60%A→70%A），流速为1.0ml/min，柱温30℃；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度101℃，氮气流速2.7L/min；检测波长为208nm。
4、试验方法：
4.1对照品溶液的制备
取黄芪甲苷和牻牛儿酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含黄芪甲苷0.5mg、牻牛儿酮0.10mg的溶液，即得对照品溶液。
4.2供试品溶液的制备
取黄莪胶囊制剂，倾出内容物，混匀，精密称定10g置250ml容量瓶中，精密加甲醇100ml，摇匀称定重量；超声处理（功率150W，频率50Hz）30min，放置24h，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀；再静置12h，转速2000r/min离心5min，吸取上清液过45μm滤纸，收集滤液；滤液过中性硅胶氧化铝柱，用甲醇洗脱；将洗脱液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
4.3不含黄芪和莪术的黄莪胶囊的阴性溶液的制备
取不含黄芪和莪术的黄莪胶囊，按4.2供试品溶液的制备方法制备阴性溶液。
4.4含量测定方法
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分析（其中，A为黄芪甲苷，B为牻牛儿酮）。
5、结果表明：
阴性溶液对测定基本无干扰，供试品溶液中黄芪甲苷、牻牛儿酮与杂质峰分离良好，不干扰测定。
综上，本发明所建立的高效液相色谱法（HPLC-ELSD）同时测定含黄芪和莪术药材的复方药物制剂黄莪胶囊中黄芪甲苷和牻牛儿酮的含量，（该方法）具有操作简便、精密度好、重复性高的特点，可更全面、更有效地控制含黄芪和莪术药材的复方药物制剂黄莪胶囊质量。