本发明涉及土壤中有机磷酸酯的测定技术领域，具体是涉及一种同时测定土壤样品中12种OPEs残留的方法。
背景技术：
近年来，由于多溴联苯醚(PBDEs)类阻燃剂的生物毒性和环境风险，世界各国已经逐步限制和禁止多溴联苯醚的生产和应用。有机磷酸酯(organophosphate esters，OPEs)作为溴代阻燃剂的主要替代品，已经广泛用于塑料、纺织品、电子设备和家居用品中，而且产量和用量均大幅增加。由于OPEs主要以简单的物理方式添加到产品中，因此在其生产、使用、处置过程中不可避免的经由各种途径进入环境中，目前在农田土壤中已有检出。与PBDEs相比，OPEs总体亲脂性更弱，其生物富集性相对较弱，但环境风险不比PBDEs小。生物毒理学研究表明，OPEs具有神经毒性、致癌性、内分泌干扰效应，对人体健康造成潜在威胁。因此，OPEs作为一种新型污染物，其环境污染问题已经引起全球学者的关注。
目前，OPEs的检测方法主要有气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、气相色谱-其它联用技术(GC-NPD、GC-EI-MS等、液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)等，涉及样本包括室内灰尘、空气、水样、沉积物、土壤、生物等。由于土壤中残留的OPEs多以痕量水平存在，且种类繁多，此外，土壤成分较复杂，对OPEs检测会有较大干扰。
针对以上现状，本发明人拟利用高效液相色谱-串联质谱检测法并结合液液萃取和固相萃取的前处理方法，建立一种土壤中痕量的12种OPEs残留定量分析方法，可以基本满足快速筛查和检测要求。液相色谱-质谱联用法因具有高灵敏度和高选择性，抗干扰能力强，可以成为OPEs残留定性定量分析的有效工具。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有的检测方法存在一定的局限性，灵敏度不够高，抗干扰能力差等问题，提供一种同时测定土壤样品中12种OPEs残留的方法，该方法检出限低，稳定性好，基本能够满足土壤中12种OPEs残留的检测要求。
本发明的技术方案是：
一种同时测定土壤样品中12种OPEs残留的方法，包括以下步骤：
S1：配制混合标准溶液：
a.配制单标准储备液(10mg/L)：准确称取12种OPEs各0.01g，用甲醇溶解定容于10mL容量瓶中，配成质量浓度为1000mg/L的标准储备液；分别取100μL(1000mg/L)标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制质量浓度为10mg/L的标准储备液，储存于4℃冰箱中；
b.配制混合标准储备液(200μg/L)：准确吸取200μL各单标准储备液(10mg/L)于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制质量浓度为200μg/L的混合标准储备液，于4℃下保存；
c.用甲醇作为溶剂，将上述混合标准储备液(200μg/L)按比例稀释后配成质量浓度分别为0.2、1、2、5、10、20、50、100μg/L的混合标准溶液，于4℃下保存；
S2：绘制标准曲线：
用甲醇配制质量浓度分别为0.2,1,2,5,10,20,50和100μg/L的12种OPEs混合标准溶液，以峰面积(y)对目标物的质量浓度(x)绘制标准曲线；
S3：样品采集：
在采样点采集土壤样品，去除杂物，置于不锈钢盒中，冷冻干燥，研磨过60目筛，-20℃保存待测；
S4：样品前处理：
将上述土壤样品经冷冻干燥研磨过60目筛后，分别称取5g土壤样品于100mL离心管中，加入30mL有机溶剂作为萃取剂，超声萃取30min后，以8000r/min离心5min，将上清液置于鸡心瓶，重复上述步骤1次，合并上清液，旋转蒸发至10mL以下，用超纯水稀释到100mL，经0.45μm玻璃纤维滤膜过滤，以4mL/min的流速通过Oasis HLB小柱。上样前，依次用5mL乙酸乙酯、5mL甲醇、5mL超纯水活化小柱。上样后，用5mL去离子水淋洗，弃去淋洗液，负压抽干10min，再用5mL乙酸乙酯洗脱2次，且保持洗脱流速为1mL/min。收集的洗脱液经旋转蒸发至干，用甲醇定容至1mL，待HPLC-MS/MS分析；
S5：高效液相色谱质谱联用仪MRM监测离子模式分析：
a.高效液相色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(150mm×2.1mm,3.5um)；流动相：0.2％(V/V)甲酸(A)和甲醇(B)；流速为0.3mL/min；柱温：30℃；进样体积：5uL；梯度洗脱程序：0～8min时，流动相为甲酸30％、甲醇70％；8～8.1min时，流动相为甲酸5％、甲醇95％；8.1～16min时，流动相为甲酸5％、甲醇95％；16～20min时，流动相为甲酸30％、甲醇70％；
b.质谱条件：选择电喷雾离子(ESI)源正离子模式扫描，采用半自动进样方式，以5μL/min的流速将500μg/L的标准储备液分别注入离子源；监测模式为多反应离子监测(MRM)；选取对应的母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析，得到碎片离子信息；
S6：外标法定量：通过高效液相色谱质谱联用仪MRM监测离子模式分析后，根据绘制的色谱图计算出样品溶液的峰面积，并通过步骤S2所述的标准曲线计算出样品溶液中的12种OPEs的浓度，目标物在1～100μg/L范围内呈良好的线性关系，以信噪比S/N＝3计算仪器方法检出限(LOD)，S/N＝10作为仪器方法定量限(LOQ)。同时对100μg/L的标准溶液连续测定3天，每天测定3次，计算日内和日间精密度；结果见表1。
表1：12种OPEs的线性方程、相关系数、日内和日间精密度、检出限和定量限
进一步地，在上述方案中，所述12种OPEs包括磷酸三甲酯(Trimethyl phosphate,TMP)、磷酸三乙酯(Triethyl phosphate,TEP)、磷酸三正丁酯(Tri-n-butyl phosphate,TnBP)、磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(Tributoxyethyl phosphate,TBEP)、磷酸三(2-氯异丙基)酯(Tri(chloropropyl)phosphate,TCPP)、磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(Tri(dichloropropyl)phosphate,TDCP)、磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate,TPhP)、磷酸三甲苯酯(Tricresyl phosphate,TCrP)、磷酸三(2-氯乙基)酯(Tri(2-chloroethyl)phosphate,TCEP)、磷酸三(2-乙基己基)酯(Tri(2-ethylhexyl)phosphate,TEHP)、磷酸三(2,3-二溴丙基)酯(tris(2,3-Dibromopropyl)phosphate,TDBPP)、2-乙基己基二苯基磷酸酯(2-Ethylhexyl diphenyl phosphate,EHDPP)。
进一步地，在上述方案中，所述萃取剂为乙腈。
进一步地，在上述方案中，所述质谱分析过程中，离子源温度：500℃，离子喷雾电压：5500V；气帘气(curtain gas,CUR)压力为206851.8Pa；喷雾气(ion source gas 1,GS1)压力为241327.1Pa；辅助加热气(ion source gas 2,GS2)压力为275802.4Pa。得到碎片离子信息后，接着对目标化合物二级质谱的CE、DP、EP、CXP等质谱参数进行优化，质谱多反应监测参数见表2。
表2：12种OPEs的参数及其LC-MS检测参数
*表示定量离子
本发明的有益效果是：本发明利用高效液相色谱-质谱联用技术结合液液萃取和固相萃取同时检测土壤样品中12种磷酸酯类化合物残留的方法，土壤样品经液液萃取和固相萃取，用高效液相色谱-质谱联用仪MRM监测离子模式分析，外标法定量，本发明的方法对于大部分OPEs来说，检出限低，稳定性好，检测灵敏度高，用于土壤样品中OPEs的快速筛查，基本能够满足土壤样品中12种OPEs残留的检测要求。
附图说明
图1是不同流动相下12种OPEs混合标准溶液(100μg/L)的总离子色谱图；
其中，1a：乙腈-水溶液；1b：甲醇-水溶液；1c：甲醇-0.2％甲酸水溶液；其中，1：磷酸三甲酯；2：磷酸三乙酯；3：磷酸三(2-氯乙基)酯；4：磷酸三(氯丙基)酯；5：磷酸三(二氯丙基)酯；6：三-(2,3-二溴丙基)磷酸酯；7：磷酸三苯酯；8：磷酸三正丁酯；9：磷酸三丁氧基乙酯；10：磷酸2-乙基己基二苯酯；11：磷酸三甲苯酯；12：磷酸三(2-乙基己基)酯。
具体实施方式
以在江苏省某农田设置的25个采样点所采集的土壤样品为例，进行同时测定土壤样品中以下12种OPEs残留，12种OPEs包括包括磷酸三甲酯(Trimethyl phosphate,TMP)、磷酸三乙酯(Triethyl phosphate,TEP)、磷酸三正丁酯(Tri-n-butyl phosphate,TnBP)、磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(Tributoxyethyl phosphate,TBEP)、磷酸三(2-氯异丙基)酯(Tri(chloropropyl)phosphate,TCPP)、磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(Tri(dichloropropyl)phosphate,TDCP)、磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate,TPhP)、磷酸三甲苯酯(Tricresyl phosphate,TCrP)、磷酸三(2-氯乙基)酯(Tri(2-chloroethyl)phosphate,TCEP)、磷酸三(2-乙基己基)酯(Tri(2-ethylhexyl)phosphate,TEHP)、磷酸三(2,3-二溴丙基)酯(tris(2,3-Dibromopropyl)phosphate,TDBPP)、2-乙基己基二苯基磷酸酯(2-Ethylhexyl diphenyl phosphate,EHDPP)；测定方法包括以下步骤：
一种同时测定土壤样品中12种OPEs残留的方法，包括以下步骤：
S1：配制混合标准溶液：
a.配制单标准储备液(10mg/L)：准确称取12种OPEs各0.01g，用甲醇溶解定容于10mL容量瓶中，配成质量浓度为1000mg/L的标准储备液；分别取100μL(1000mg/L)标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制质量浓度为10mg/L的标准储备液，储存于4℃冰箱中；
b.配制混合标准储备液(200μg/L)：准确吸取200μL各单标准储备液(10mg/L)于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制质量浓度为200μg/L的混合标准储备液，于4℃下保存；
c.用甲醇作为溶剂，将上述混合标准储备液(200μg/L)按比例稀释后配成质量浓度分别为0.2、1、2、5、10、20、50、100μg/L的混合标准溶液，于4℃下保存；
S2：绘制标准曲线：
用甲醇配制质量浓度分别为0.2,1,2,5,10,20,50和100μg/L的12种OPEs混合标准溶液，以峰面积(y)对目标物的质量浓度(x)绘制标准曲线；
S3：样品采集：
在采样点采集土壤样品，去除杂物，置于不锈钢盒中，冷冻干燥，研磨过60目筛，-20℃保存待测；
S4：样品前处理：
将上述土壤样品经冷冻干燥研磨过60目筛后，分别称取5g土壤样品于100mL离心管中，加入30mL有机溶剂作为萃取剂，超声萃取30min后，以8000r/min离心5min，将上清液置于鸡心瓶，重复上述步骤1次，合并上清液，旋转蒸发至10mL以下，用超纯水稀释到100mL，经0.45μm玻璃纤维滤膜过滤，以4mL/min的流速通过Oasis HLB小柱。上样前，依次用5mL乙酸乙酯、5mL甲醇、5mL超纯水活化小柱。上样后，用5mL去离子水淋洗，弃去淋洗液，负压抽干10min，再用5mL乙酸乙酯洗脱2次，且保持洗脱流速为1mL/min。收集的洗脱液经旋转蒸发至干，用甲醇定容至1mL，待HPLC-MS/MS分析；
S5：高效液相色谱质谱联用仪MRM监测离子模式分析：
a.高效液相色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(150mm×2.1mm,3.5um)；流动相：0.2％(V/V)甲酸(A)和甲醇(B)；流速为0.3mL/min；柱温：30℃；进样体积：5uL；梯度洗脱程序：0～8min时，流动相为甲酸30％、甲醇70％；8～8.1min时，流动相为甲酸5％、甲醇95％；8.1～16min时，流动相为甲酸5％、甲醇95％；16～20min时，流动相为甲酸30％、甲醇70％；
b.质谱条件：选择电喷雾离子(ESI)源正离子模式扫描，采用半自动进样方式，以5μL/min的流速将500μg/L的标准储备液分别注入离子源；监测模式为多反应离子监测(MRM)；离子源温度：500℃，离子喷雾电压：5500V；气帘气(curtain gas,CUR)压力为206851.8Pa；喷雾气(ion source gas 1,GS1)压力为241327.1Pa；辅助加热气(ion source gas 2,GS2)压力为275802.4Pa。选取对应的母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析，得到碎片离子信息；接着对目标化合物二级质谱的CE、DP、EP、CXP等质谱参数进行优化，质谱多反应监测参数见表2。
表2：12种OPEs的参数及其LC-MS检测参数
*表示定量离子
S6：外标法定量：通过高效液相色谱质谱联用仪MRM监测离子模式分析后，根据绘制的色谱图计算出样品溶液的峰面积，并通过步骤S2所述的标准曲线计算出样品溶液中的12种OPEs的浓度，目标物在0.2～100μg/L范围内呈良好的线性关系，以信噪比S/N＝3计算仪器方法检出限(LOD)，S/N＝10作为仪器方法定量限(LOQ)。同时对100μg/L的标准溶液连续测定3天，每天测定3次，计算日内和日间精密度；结果见表1。
表1：12种OPEs的线性方程、相关系数、日内和日间精密度、检出限和定量限
实验验证：
1.流动相的选择：一般情况下，酸性条件下可提高化合物[M+H]+的正离子响应，本实验采用ESI+模式，分别用乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、甲醇-0.2％甲酸水溶液作为流动相，对12种OPEs(100μg/L)的分离效果进行比较，其总离子流色谱图见图1。结果发现以甲醇-水为流动相时目标物峰的质谱响应和分离度更好(见图1b)，而添加甲酸对目标物的分离影响不大(见图1c)，但是可以提高部分目标物的响应，因此选择甲醇-0.2％甲酸水溶液为流动相。
2.提取溶剂的选择：5种有机溶剂(正己烷-甲醇(2:1，V/V)、甲醇-乙腈(1:4，V/V)、甲醇、乙腈和正己烷-乙酸乙酯(2:5，V/V))提取方法对TMP回收率均低于55％，这可能是由于TMP较好的水溶性及易挥发所致；TCEP回收率也相对较差，其范围为24.14％～58.60％，可能是由于复杂的沉积物基质对TCEP的基质抑制效应。此外，5种有机溶剂只有乙腈作为萃取剂时，TCPP、TCrP能达到较好回收率，分别为72.82％、119.5％，而其余4种萃取溶剂对其回收率均低于5％。相比而言，乙腈作提取溶剂时的萃取效果较好。因此，后续实验选择乙腈作为最佳的萃取溶剂。
3.回收率与精密度：
以目标物极低的土壤作为对照组，且将其浓度作为空白控制的基线值。分别添加低(5μg/kg)、中(10μg/kg)、高(50μg/kg)3个不同浓度的目标物，每个浓度设置3个平行样，检测结果扣除替代样品的基线值。土壤样品中12种OPEs的平均加标回收率为31.24％～116.63％。实验结果见表3。
表3：土壤样品中12种OPEs的回收率与精密度
4.对农田设置的25个采样点的土壤样品中12种目标化合物的检测分析，结果见表4。
表4：12种OPEs在农田土壤中的暴露浓度(μg/kg)
5.nda:未检出；b单一OPE总浓度占所有OPEs总浓度的百分比。
6.结论：本发明建立的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时测定农田土壤中12种OPEs残留的分析方法。总的来说，对于文中大部分OPEs，该方法检出限低，稳定性好，但对于磷酸三甲酯(TMP)因其较好的水溶性及易挥发，导致其在土壤中的回收率偏低，对于磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)来说，可能是由于沉积物复杂的基质产生的抑制效应，导致回收率偏低。但用于农田土壤中OPEs的快速筛查，本方法基本能够满足农田土壤中12种OPEs残留的检测要求。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。