土壤曲霉菌菌丝球的制备方法及其应用与流程

本发明涉及微生物学领域，具体涉及土壤曲霉菌菌丝球的制备方法和应用。

背景技术：

重金属废水(如含镉、铅、砷、铬)是一类对环境污染最严重和人类危害最大的工业废水之一。大多数金属离子及其化合物易于被水中悬浮颗粒所吸附而沉淀于水底的沉积层中，长期污染水体。某些重金属及其化合物能在鱼类及其他水生生物体内以及农作物组织内富集、累积并参与生物圈循环。

目前，处理废水中重金属离子，工业上一般采用化学沉淀法、离子交换法、电解法、膜分离法、吸附法等；化学沉淀法设备简单、操作方便、处理效果好，目前，对高浓度、大流量废水的处理应用较普遍，但对化学试剂的消耗量大、费用高、易造成二次污染；离子交换法具有占地面积小、管理方便、离子去除率高，而且处理得当可使再生液作为资源回收，不会对环境造成二次污染，但是一次性投资大，运行费用高，树脂易受污染或氧化失效，再生频繁，再生问题也存在一定的困难；电解法工艺成熟，具有去除率高，无二次污染，所沉淀的重金属可回收利用，对废水水质变化适应性较强，反应时间短，但处理大量废水时能耗大，电极金属耗量大，处理废水量少；膜分离法净化了水质，又富集回收了重金属，起到双重功效，但由于技术难度大、处理成本高等，阻碍了该法的工业化；吸附法是一种比较有效的处理重金属污染的方法，该法有良好的处理效果，但其经济 运行成本高，难以大规模应用；因此寻找高效，低成本的吸附材料是当前吸附法处理重金属污染的一大技术难题。

菌丝球是由霉菌或放线菌在培养过程中自动聚集形成的具有一定机械强度和大小的球状颗粒物，它们是由菌丝缠绕而成，易于吸附其他颗粒物质。

菌丝球具有诸多优点：(1)吸附性能，当与细菌混合培养时，细菌可吸附在菌丝球上，使细菌不容易流失，从而增强细菌某些降解性能；(2)生物沉降性，当环境静置时，菌丝球则会沉降在最底部，易于与水体分离；(3)菌丝球表面有很多空隙，传质扩散阻力小；(4)成球和生长条件宽泛，生产成本低廉；(5)具有一定的机械强度，

技术实现要素：

本发明的目的包括：

提供一种能形成菌丝球的曲霉菌菌种的筛选方法；

提供一种曲霉菌属霉菌菌丝球的制备方法；

提供一种利用土壤曲霉菌菌丝球去污水中重金属的方法，等。

本发明提供了一种土壤曲霉菌菌丝球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取曲霉菌接种于PDA培养基试管斜面，纯化培养；用无菌生理盐水冲洗试管，加入无菌水稀释，制备孢子菌悬液；以血球计数板进行计数，孢子菌悬液浓度为1.0×10⁵～1.0×10⁷个/mL；

(2)取步骤(1)制备的孢子菌悬液，转移接种于液体培养基中，25～40℃培养2～6天，得霉菌菌丝球；

所述液体培养基的装液量为50～125ml，PH为5～9；

所述转移接种是指，以体积比8～12％的接种量，将步骤(2)制备的孢子菌悬液接种于液体培养基。

进一步的，步骤(1)所述的PDA培养基配方中含有0.1～1ml乳酸；

步骤(2)所述的孢子菌悬液浓度为1×10⁶～2×10⁶个/mL；

步骤(2)所述的转移接种为，以体积比10％的接种量，将步骤(1)制备的孢子菌悬液接种于液体培养基；

步骤(2)所述的所述液体培养基的装液量为100ml，PH为7；培养时间为4天。

具体的，本发明公开了一种土壤曲霉菌菌丝球的制备方法，包括以下步骤：

(1)取曲霉菌接种于PDA培养基试管斜面，纯化培养；用无菌生理盐水冲洗试管，加入无菌水稀释，制备孢子菌悬液；以血球计数板进行计数，孢子菌悬液浓度为1.0×10⁶～1.2×10⁶个/mL；

(2)、取步骤(1)制备的孢子菌悬液，以体积比10％的接种量，转移接种于液体培养基，在pH值为7、30℃～37.5℃、转速150～170/分钟的条件下振荡培养4天；所述液体培养基的装液量为100ml。

本发明还公开了一种利用土壤曲霉菌菌丝球处理含重金属废水的方法，包括以下步骤：

(1)取曲霉菌接种于PDA培养基试管斜面，纯化培养；用无菌生理盐水冲洗试管，加入无菌水稀释，制备孢子菌悬液；以血球计数板进行计数，孢子菌悬液浓度为1.0×10⁶～1.2×10⁶个/mL；

(2)取步骤(1)制备的孢子菌悬液，转移接种于液体培养基中，25～40℃ 培养2～6天；

所述液体培养基的装液量为50～125ml，PH为5～9；

所述转移接种是指，以体积比8～12％的接种量，将步骤(2)制备的孢子菌悬液接种于液体培养基；

(3)将步骤(2)制备的菌丝球投入含重金属的废水中，在25～40℃、PH为3～9的条件下吸附。

进一步的，步骤(3)所述重金属为铅和/或镉。

具体的，本发明公开了一种利用土壤曲霉菌菌丝球处理含重金属废水的方法，包括以下步骤：

(1)取曲霉菌接种于PDA培养基试管斜面，纯化培养；用无菌生理盐水冲洗试管，加入无菌水稀释，制备孢子菌悬液；以血球计数板进行计数，孢子菌悬液浓度为1.0×10⁶～1.2×10⁶个/mL；所述PDA培养基的配方中含1ml乳酸；

(2)、取步骤(1)制备的孢子菌悬液，以体积比10％的接种量，转移接种于液体培养基，在pH值为7、30℃～37.5℃、转速150～170/分钟的条件下振荡或搅拌培养4天；所述液体培养基的装液量为100ml；

(3)、以为2.0克/升的菌体投料量，将步骤(3)制备的菌丝球投入含铅和/或镉的废水，在30℃、PH为5、转速为160转/分钟的条件下振荡或搅拌吸附；所述含铅和/或镉的废水，含20～120毫克/升的铅和/或镉离子。

更进一步的，步骤(3)所述含铅和/或镉的废水，含80毫克/升的铅离子和/或20mg毫克/升的镉离子；

优选的，步骤(3)所述废水为含铅废水，废水中含80毫克/升的铅离子。

本发明所述的曲霉菌为可形成菌丝球的曲霉菌，所述曲霉菌菌丝球是由能形成菌丝球的曲霉菌菌种或菌株制备得到。可形成菌丝球的曲霉菌可以是本领域已知的可形成菌丝球的曲霉菌菌种或菌株，也可使用本领域的常规方法筛选能形成菌丝球的曲霉菌株菌种或菌株，还可参考本发明公开的筛选方法筛选能形成菌丝球的曲霉菌株。

筛选霉菌能否形成菌丝球的方法步骤包括：将土壤样品制备为土壤悬液；采用稀释倍数法接种于培养基进行培养，选取其中的霉菌接种于培养基单独培养；将培养后的霉菌制备为孢子悬液；将孢子悬液接种至液体培养基培养，观察形成菌丝球的情况，选择其中能够形成菌丝球的霉菌菌株。筛选能形成菌丝球的霉菌的方法，适用于筛选能形成菌丝球的曲霉菌。曲霉菌的鉴定可参照《真菌鉴定手册》(魏景超，上海科学技术出版社出版，统一书号13119-718)进行。

具体的，本发明以上的方法步骤，均可以参照使用以下方法分离、筛选能形成菌丝球的曲霉菌：

a、土壤霉菌的分离纯化：将获得的土样制备成悬液，采用稀释倍数法接种于PDA培养基中，并向各平板中加入1mL乳酸，鉴定其中的曲霉菌，将所得的曲霉菌接种于试管斜面，于37.5℃生化培养箱中培养三天，培养结束后冷藏保存备用；

b、孢子悬液的制备：用无菌生理盐水冲洗曲霉菌试管，随后加入无菌水稀释，并用血球计数板进行计数，将孢子悬液浓度控制为1.2×106个/mL；

c、能形成菌丝球菌种的筛选：将孢子悬液按10％的接种量转移接种至100mL马丁培养基中，随后置于30℃、160r/min摇床中振荡培养3d，观察成球情况，能形成菌丝球的菌株即为本发明所述的能形成菌丝球的曲霉菌。

有益效果

利用菌丝球收获的方法节约了大型耗能设备，降低了成本，而且在污水处理过程中避免使用化学絮凝剂，减少了对环境的危害。制备方法简单、成本较低，通过此方法可以制备出对重金属吸附效果较好的菌丝球。

附图说明

图1为土壤分离霉菌菌种曲霉属Aspergillus.sp.Z1菌落照片。

图2为曲霉属Aspergillus.sp.Z1菌丝球照片。

图3为曲霉属Aspergillus.sp.Z1扫描电镜图片。

图4为土壤分离霉菌菌种曲霉属Aspergillus.sp.Z2菌落照片。

图5为曲霉属Aspergillus.sp.Z2菌丝球照片。

图6为曲霉属Aspergillus.sp.Z2扫描电镜图片。

图7为土壤分离霉菌菌种曲霉属Aspergillus.sp.Z3菌落照片。

图8为曲霉属Aspergillus.sp.Z3菌丝球照片。

图9为曲霉属Aspergillus.sp.Z3扫描电镜图片。

图10为土壤分离霉菌菌种曲霉属Aspergillus.sp.Z4菌落照片。

图11为曲霉属Aspergillus.sp.Z4菌丝球照片。

图12为曲霉属Aspergillus.sp.Z4扫描电镜图片。

图13为曲霉属Aspergillus.sp.Z1菌丝直径分布图。

图14为曲霉属Aspergillus.sp.Z2菌丝直径分布图。

图15为曲霉属Aspergillus.sp.Z3菌丝直径分布图。

图16为曲霉属Aspergillus.sp.Z4菌丝直径分布图。

图17 Pb²⁺初始浓度对吸附效果的影响。

图18初始pH对吸附效果的影响。

图19温度对吸附效果的影响。

图20 吸附前与吸附后扫描电镜图片

其中，图20a为吸附前扫描电镜图片；

图20b为吸附后扫描电镜图片。

具体实施方式

具体实施方式：

下面对本发明具体实施方案做进一步说明。

主要试剂：葡萄糖、琼脂粉、蛋白胨、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氢氧化钠、硝酸、硝酸铅，上述药品均购于成都科龙化工。其中琼脂粉与蛋白胨为生化试剂，其余试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。

主要仪器:PHS-320酸度计(成都世纪方舟科技有限公司)、SHZ-82水浴振荡箱(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)、BSA224S-CW电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、DHG-9240B鼓风干燥箱(上海申贤恒温设备厂)、YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器(上海三申医疗器械有限公司)、KXH-25A生化培养箱(成都科析仪器成套公司)、SW-CJ-2F超净试验台(苏州净化设备有限公司)、B203LED生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)。

检测方法：检测方法均使用火焰原子吸收分光光度法。

平板培养基(分离培养基，即PDA培养基)的制备：将200g马铃薯， 20g葡萄糖，15g琼脂，1g磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、0.5g七水合硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)加水至1000mL，混匀，于121℃下高压灭菌20min，制成固体培养基，pH自然。可选加入1ml乳酸。

液体培养基(菌丝球制备培养基，即马丁培养基)的制备：将蔗糖20g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1g，氯化铵(NH₄CL)5g，七水合硫酸镁(MgSO4·7H₂O)0.5g，氯化钙(CaCl₂)5g，加水至1000mL，混匀，于121℃下高压灭菌20min，制成液体培养基，pH自然。

实验菌种从成都理工大学土壤中分离。霉菌分离培养基选择PDA培养基。菌丝球制备培养基选择马丁培养基。

实施例一、黑曲霉菌菌株的分离培养

从成都理工大学土壤，地下10～15cm的湿润土壤中取土样，加入无菌水，制备土壤悬液，在无菌的条件下将土壤悬液在平板培养基中分离培养；接着在无菌的条件下，用接种环选取其中的霉菌，接种于在平板培养基，分离所得。

土壤悬液的制备方法：本发明分离霉菌时将所得1g土壤置于9mL蒸馏水中制成土壤悬液，并放入5～10颗玻璃珠，使土样分散均匀；随后取1mL于试管中，加入9mL蒸馏水，制成稀释10²倍悬液；以此类推，直至稀释至10⁵倍。

倒平板对比：在无菌条件下，采用每个稀释倍数的悬液采用2个平板培养的方法，其中一个平板只加入固体培养基，而另一个培养基中除了加入固体培养基后还要加入1mL乳酸，形成对照；通过对比发现，加入乳酸的平板比没加的出现的霉菌种类要多，这说明乳酸可以促进霉菌的生长。

分离纯化霉菌：在无菌的条件下，培养3天后，用接种环选取其中的霉菌， 接种于在平板培养基，并在37℃生化培养箱中进行3～4次纯化培养。

摆斜面进行储存：在无菌条件下，将纯化后的菌种转移至试管斜面培养基中进行储存。

从土壤中共分离出数种霉菌，分别接种于马丁液体培养基，并在摇床中培养3d后进行形态、性能等筛选，通过是否形成菌丝球为标准，最终筛选出四株霉菌，四株霉菌菌种在PDA平板上的菌落呈现出不同的形态。。

本发明分离的第一种曲霉属Aspergillus.sp.Z1(附图1)，在平板培养基上颜色为黑色，质地疏松，点状分布；其形成的菌丝球(附图2)数量较多、个体较大，且较均匀，直径在2.2-2.5mm之间；通过扫描电镜(附图3)可以看出菌丝球内部菌丝互相缠绕形成空隙，便于传质与吸附；从电镜图片中随机选取100个菌丝测其直径，做成菌丝直径分布图(附图13)。镜检下的菌体，可以发现该菌株顶部为球形顶囊，类似″蒲公英″。根据《真菌鉴定手册》(魏景超，上海科学技术出版社出版，统一书号13119-718)进行鉴定，该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)，并命名为黑曲霉Z1。

本发明分离的第二种曲霉属Aspergillus.sp.Z2(附图4),在平板培养基上呈现菌落为圆形，颜色为灰黑色，镜检下可以看到发达的菌丝；曲霉Z1经过三天后形成的菌丝球(附图5)数量最少、个体最大，直径在2.4-2.8mm之间；通过扫描电镜(附图6)可以看出菌丝球内部菌丝互相缠绕形成空隙，便于传质与吸附；从电镜图片中随机选取100个菌丝测其直径，做成菌丝直径分布图(附图14)。

本发明分离的第三种曲霉属Aspergillus.sp.Z3(附图7),在平板培养基上颜色为墨绿色，质地疏松，表面呈粉状；其形成的菌丝球(附图8)数量较少、 个体最小，直径在1.5-1.8mm之间；通过扫描电镜(附图9)可以看出菌丝球内部菌丝互相缠绕形成空隙，便于传质与吸附；从电镜图片中随机选取100个菌丝测其直径，做成菌丝直径分布图(附图15)。

本发明分离的第四种曲霉属Aspergillus.sp.Z4(附图10),在平板培养基上颜色为灰白色，质地疏松、柔软；其形成的菌丝球(附图11)数量最多、个体较大其分布均匀、可以圆滑，直径在2.4-2.6mm之间；通过扫描电镜(附图12)可以看出菌丝球内部菌丝互相缠绕形成空隙，便于传质与吸附；从电镜图片中随机选取100个菌丝测其直径，做成菌丝直径分布图(附图16)。

实施例二 霉菌的液体培养和菌丝球制备筛选试验

取黑曲霉菌株Aspergillus.sp.Z1进行液体培养：在无菌条件下，将分离所得的试管中的霉菌加入20mL无菌水，用灭菌后的接种环将其轻轻刮下于锥形瓶中，取10mL于容量为250mL锥形瓶中100mL液体培养基中，进行转移培养。

以下对制备黑曲霉菌株Aspergillus.sp.Z1菌丝球的培养时间、装液量、PH值、孢子接种量进行筛选实验。

1培养时间对菌丝球生长的影响

将接种量为10％、装液量为100mL、pH为7的马丁液体培养基置于30℃、160r/min摇床中振荡培养1～6d，观察并记录菌丝球生长状况，见表1。

表1不同培养时间对菌丝球生长状况的影响

由表1可知，菌丝球随时间增加而不断变化。在1～4d，菌丝球直径与生物量均不断增加，菌丝球生长最快。在5～6d，菌丝球颗粒逐渐变小，生物量下降。

2装液量对菌丝球生长的影响

固定实验的其他条件，改变装液量为25mL、50mL、75mL、100mL、125mL，振荡培养3d后，进行过滤、称重并对Pb²⁺溶液进行静态吸附，实验结果见表2。

表2装液量对菌丝球生长的影响

当装液量为100mL时，菌球的吸附率达到最高；继续增加装液量，吸附率反而减小。

3pH对菌丝球生长状况的影响

固定实验的其他条件，改变培养基pH来观察菌丝球的生长情况。用25％硝酸与0.5mol/L的NaOH调节，pH值为3、5、7、9、11，恒温振荡3d后，观察菌丝球生长状况，结果见表3.

表3初始pH对菌丝球生长的影响

当pH为7时，菌球的质量达到最大，对Pb²⁺的吸附率也达到最大。

4孢子接种量对菌丝球生长的影响

固定实验的其他条件，改变孢子接种量来观察菌丝球的生长情况。黑曲霉孢子接种量(1.2×10⁶个/mL)选择1％、2.5％、5％、10％、15％，于水浴恒温振荡箱中振荡培养3d后，进行观察。实验结果见表4。

表4孢子接种量对菌丝球生长的影响

当孢子接种量为10％时，菌体的干重达到最大，吸附率也达到最大。

实验表明：当培养基pH为7、装液量为100mL(150mL锥形瓶)，孢子接种量为10％(菌悬液浓度为1.2×10⁶个/mL)时培养4天，可获得对Pb²⁺吸附效果较好的菌丝球。

实施例三 黑曲霉菌菌丝球对Pb²⁺吸附条件筛选实验

参照实施例二得到的菌丝球最优培养条件培养菌丝球，进行下述Pb²⁺吸附筛选试验。

1Pb²⁺初始浓度对吸附效果的影响

调节Pb²⁺初始浓度为20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L，于160r/min摇床中振荡吸附，实验结果见图17。

Pb²⁺初始浓度对吸附率有一定的影响。这是因为当投加量一定时，菌丝球细胞壁表面的吸附位点也是一定的。随着Pb²⁺初始浓度的增加，菌丝球对Pb²⁺吸附率先增加后下降，当Pb²⁺初始浓度为80mg/L时，菌丝球表面的吸附位点全部被占满，吸附率也最大，为89.5％。之后随Pb²⁺初始浓度的增加，菌丝球已无法进行吸附，吸附率又逐渐下降。

.2pH对吸附的影响

调节pH为2、3、5、7、8、9，对80mg/L Pb²⁺溶液进行吸附，实验结果见图18。

3温度对吸附效果的影响

改变菌丝球的吸附温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，于160r/min摇床中振荡吸附。

菌丝球对Pb²⁺吸附率随着温度的升高而增加，当温度为30℃时，吸附率达到最高为88.7％。

综上，pH、Pb²⁺初始浓度、温度对菌丝球的吸附效果都有一定的影响。当温度为30℃、pH为5、Pb²⁺初始浓度为80mg/L、转速为160r/min、菌体投加量为2.0g/L时，吸附效率达到最高为89.5％。

实施例四 菌丝球的扫描电镜分析。

参照实施例二的最佳培养条件，培养制备黑曲霉菌株Aspergillus.sp.Z1菌丝球；参照实施例三的最优吸附条件，对含铅废水进行吸附。取吸附前、吸附后的菌丝球做扫面电镜分析。

通过扫描电镜(×500)对吸附前后的黑曲霉菌丝球进行分析，如图20所示。如图所示在吸附前(左)，菌丝互相交叉、缠绕，形成网状结构，形如“蜘蛛网”，且具有较大孔隙，有利于对Pb²⁺的吸附。吸附后(右)，可以明显发现，菌丝表面覆盖较多颗粒，变得粗糙。

实施例5可形成菌丝球的曲霉属菌株Aspergillus.sp.对镉(Cd²⁺)的吸附试验

将本发明可形成菌丝球的曲霉属菌株Aspergillus.sp.Z1、Z2、Z3、Z4所接种霉菌的锥形瓶置于摇床中，控制温度为30～35℃、转速为150～170转/分钟、pH为5～7，进行3～5天的恒温振荡培养，从而获得土壤霉菌菌丝球。

配置浓度为20mg/L的Cd²⁺溶液50mL于150mL锥形瓶中，四种霉菌菌丝球的投加量为0.2g(干重)置于160转/分钟、温度为30℃的摇床上恒温振荡吸附，pH保持中性。

经过12小时的吸附，四种菌丝球的吸附率均超过了30％，分别为32.3％，39.6％，34.5％，36.1％。