本发明涉及一种高产普鲁兰多糖的菌株以及利用该菌株发酵生产普鲁兰多糖的方法。
背景技术：
普鲁兰多糖作为一种由微生物合成的胞外聚合物，具有易溶于水、安全无毒害、可食用、可降解性，是一种多功能绿色高分子材料。其结构是由葡萄糖按α-1，4糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以α-l，6糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成。这种独特的单体连接方式使其具有其他多糖所不具备的材料特性：优异的可塑性、成膜与成纤维能力、隔气隔氧能力，因此可作为保色、保香、保鲜、抗氧化的可降解包装材料，在医药、食品、化妆品、环保等领域具有广泛的用途。特别是在药用辅料领域，普鲁兰多糖制成的空心胶囊具有优异的隔氧能力，易溶解，不与药物发生交联等独特优势，可使易被氧化的药物保持长期稳定，是一种新型的植物胶囊原料。
目前普鲁兰多糖的生产菌株主要是酵母类真菌出芽短梗霉，普鲁兰多糖由出芽短梗霉在其细胞壁上合成并分泌到培养液中。普鲁兰多糖可由谷氨酸废液、淀粉水解物、蔗糖或其他糖类直接发酵生产，分子量2万至100万。
生物法合成普鲁兰多糖可以利用可再生的生物资源发酵生产，成本低廉，合成条件温和，产物的分子量相对较高，因此生物法合成具有很大优势，但其开发和应用受到了高成本，低效率的制约。如果能够提高普鲁兰多糖的产量，降低其生产成本，其应用领域将会得到进一步开发。由于出芽短梗霉在合成普鲁兰多糖过程中同时产生黑色素，黑色素会吸附到普鲁兰多糖分子上，不易分离，给普鲁兰多糖下游处理过程造成困难并增加分离步骤和成本。因此通过筛选、诱变获得高产且无黑色素的出芽短梗霉菌种用于生产普鲁兰多糖，将会减少其的分离提取成本。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种产生普鲁兰多糖的菌株及利用该菌株发酵生产普鲁兰多糖的方法。
本发明的产生普鲁兰多糖的菌株，是从植物叶片表面筛选得到的不产生黑色素的菌株，分类命名为出芽短梗霉，拉丁文学名为Aureobasidium pullulans HL-1,该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.10772。保藏日期：2015.4.28，保藏单位地址：中国科学院微生物研究所。
本发明所述的菌株其形态特征为：菌落表面粘稠，最初为白色，逐渐变为黑色，边缘有菌丝伸入琼脂内部，没有气生菌丝。可产生椭圆形酵母样芽生孢子，厚壁孢子，肿胀孢子和菌丝。
通过将该菌株的rDNA的ITS序列和其他真菌的比对，结果证实本发明的菌株为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。
所述产生普鲁兰多糖的菌株用甘露醇为唯一碳源的培养基筛选植物叶片样本中的微生物，培养2-4天后，分离得到本菌种。
一种使用产生普鲁兰多糖的菌株生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于：通过发酵法制备，所使用的菌株为如权利要求1所述的产生普鲁兰多糖的菌株。
一种利用产生普鲁兰多糖的菌株生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
1)取24～28℃培养48～60h的出芽短梗霉HL-1斜面菌种一环，接种到30～60ml液体种子培养基中，转速为160～220rpm，25～30℃培养48～60h得到种子液；
上述的种子培养基为：50～120g/l碳源，2.5～5g/l氮源，0.5～1.5g/l NaCl，2～5g/lKH2PO4，0.1～0.5g/lMgSO4·7H2O；
2)将制备好的种子液按0.5％～2％比例接种到30～60ml发酵培养基中，转速为160～220rpm，25～30℃，培养60～120h；或者将制备好的种子液接种到发酵罐，发酵培养基装液量为发酵罐容积的40-70％,接种量0.5％～2％，温度25～30℃，通气量0.2～0.4m3/h，转速200～400rpm，发酵时间60～120h；
上述的发酵培养基为：50～160g/l碳源，0.5～3g/l氮源，0.5～1.5g/l NaCl，2～5g/lKH2PO4，0.1～1g/lMgSO4·7H2O；
3)将步骤2)得到的发酵液离心除去菌体，过滤的上清液中加入2倍体积的甲醇，轻轻搅动后，放置1h，离心去上清，沉淀物用80％甲醇洗涤，冷冻干燥后得到普鲁兰多糖。
上述培养基中的碳源可以为葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、半乳糖、甘油、可溶性淀粉或麦芽糖。培养基中的氮源可以为硝酸铵、硝酸钠、硫酸铵、酵母膏、尿素或蛋白胨。
本发明的有益效果：
1.本发明提供了一种自行筛选的出芽短梗霉菌株(编号为CGMCC No.10772)，可以高效的发酵产生普鲁兰多糖。
2.本发明所提供的菌株不产生黑色素，发酵液为淡黄色，有利于简化后期处理工艺。
3.本发明所提供的方法简单易行，所用的原料简单，普鲁兰多糖产量高，转化率达到59％，为商业化，大规模生产提供了适合的方法。
4.本发明所得的普鲁兰多糖产品为无色透明，产品无毒害，具有良好的水溶性和生物可降解性，可以广泛应用与医药，化妆品或食品行业。
具体实施方式
实施例1：
1)取26℃培养48h的出芽短梗霉HL-1斜面菌种一环，接种到液体种子培养基，装液量为500ml三角瓶中60ml培养基，转速为220rpm，25℃培养48h得到种子液。
2)将制备好的种子液按10％比例接种到发酵培养基中，装液量500ml三角摇瓶中60ml培养基，转速为220rpm，28℃，培养60h；
上述的种子培养基为：50g/l蔗糖，5g/l酵母膏，1g/l氯化钠,5g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4·7H2O；
上述的发酵培养基：74g/l葡萄糖，2g/l硝酸钠，1g/l氯化钠,5g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4·7H2O。
3)将步骤2)得到的发酵液离心除去菌体，过滤的上清液中加入2倍体积的甲醇，轻轻搅动后，放置1h，离心去上清，沉淀物用80％甲醇洗涤2次，冷冻干燥后得到普鲁兰多糖。产物干燥后测定，产量可达到23.87g/l。
实施例2：
1)取25℃培养48h的出芽短梗霉HL-1斜面菌种一环，接种于液体种子培养基，装液量为500ml三角瓶中50ml培养基，转速为220rpm，26℃培养55h得到种子液。
2)将制备好的种子液按10％比例接种到发酵培养基中，装液量500ml三角摇瓶中60ml培养基，转速为220rpm，27℃，培养60h；
上述的种子培养基为：50g/l蔗糖，5g/l酵母膏，1g/l氯化钠,5g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4·7H2O；
上述的发酵培养基：100g/l蔗糖，2g/l硝酸钠，1g/l氯化钠,5g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4·7H2O。
3)将步骤2)得到的发酵液离心除去菌体，过滤的上清液中加入2倍体积的甲醇，轻轻搅动后，放置1h，离心去上清，沉淀物用80％甲醇洗涤2次，冷冻干燥后得到普鲁兰多糖。产物干燥后测定，产量可达到42.47g/l。
实施例3：
1)同实施例1。
2)同实施例1，区别在于：发酵培养基：70g/l葡萄糖，1.5g/l NaNO3，0.5g/l氯化钠,4g/l KH2PO4，0.1g/l MgSO4·7H2O。
3)同实施例1。
产物干燥后测定，产量可达到59.03g/l。
实施例4：
1)同实施例1。
2)同实施例1，区别在于：发酵培养基：160g/l蔗糖，3g/l硝酸钠，0.5g/l氯化钠,5g/l KH2PO4，0.9g/l MgSO4·7H2O。
3)同实施例1。
产物干燥后测定，产量可达到72.8g/l。
实施例5：
1)同实施例1。
2)将制备好的种子液接种到15L发酵罐，发酵培养基装液量为8L,接种量1％，温度28℃，通气量0.4m3/h，转速400rpm，发酵时间37h；
上述的发酵培养基：70g/l蔗糖，2g/l硝酸铵，0.5g/l氯化钠,5g/l KH2PO4，0.1g/l MgSO4·7H2O；
3)将步骤2)得到的发酵液离心去除菌体，过滤的上清液中加入2倍体积的甲醇，轻轻搅动后，放置1h，2离心去上清，沉淀物用80％甲醇洗涤，冷冻干燥后得到普鲁兰多糖。产物干燥后测定，产量可达到22.4g/l。
实施例6：
1)同实施例1。
2)将制备好的种子液接种到15L发酵罐，发酵培养基装液量为8L,接种量1％，温度28℃，通气量0.4m3/h，转速400rpm；
上述的发酵培养基：70g/l蔗糖，2g/l硝酸铵，0.5g/l氯化钠,5g/l KH2PO4，0.1g/l MgSO4·7H2O；
发酵时间33h时，开始向发酵罐内流加浓度为300g/l蔗糖溶液，保持发酵罐内蔗糖含量始终大于10g/l，发酵120小时结束；
3)将步骤2)得到的发酵液离心去除菌体，过滤的上清液中加入2倍体积的甲醇，轻轻搅动后，放置1h，2离心去上清，沉淀物用80％甲醇洗涤，冷冻干燥后得到普鲁兰多糖。产物干燥后测定，产量可达到70.8g/l，转化率为59％。