一种金银花配方颗粒的特征图谱的检测方法及质量控制方法与流程

本发明涉及金银花配方颗粒检测领域，具体而言，涉及一种金银花配方颗粒的特征图谱的检测方法及质量控制方法。

背景技术：

金银花自古以来就以它的药用价值广泛而著名。其功效主要是清热解毒，主治温病发热、热毒血痢、痈疽疔毒等。现代研究证明，金银花含有绿原酸、木犀草素苷等药理活性成分，对溶血性链球菌、金黄葡萄球菌等多种致病菌及上呼吸道感染致病病毒等有较强的抑制力，另外还可增强免疫力、抗早孕、护肝、抗肿瘤、消炎、解热、止血(凝血)、抑制肠道吸收胆固醇等，其临床用途非常广泛，可与其它药物配伍用于治疗呼吸道感染、菌痢、急性泌尿系统感染、高血压等40余种病症。

为了更深入的研究金银花，一般采用气相色谱分析或气相色谱质谱联用方法对金银花的化学成分进行研究，建立特征图谱，但所获得的特征图谱出峰密集，色谱峰的分离度较小，色谱峰之间容易重叠，从而不能准确地确定金银花化学成分。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种金银花配方颗粒的特征图谱的检测方法，其建立了金银花配方颗粒的液相特征图谱，能够系统地反应金银花配方颗粒化学成分的全貌，并且共有峰相对保留时间稳定，可用于金银花配方颗粒的质量控制。

本发明的另一目的在于提供一种金银花配方颗粒的质量控制方法，其能够准确检测金银花配方颗粒的化学成分，有效表征其相对含量，从而能够全面评价金银花配方颗粒的质量。

本发明的实施例是这样实现的：

一种金银花配方颗粒的特征图谱的检测方法，取绿原酸并用体积百分比为45－55％的甲醇溶液配制对照品溶液；取金银花配方颗粒并用体积百分比为45－55％的甲醇溶液配制成溶液，经超声波提取，得到供试品溶液；以及对对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱分析，色谱条件包括：以磷酸水溶液和乙腈作为流动相分别对对照品溶液和供试品溶液进行梯度洗脱，并且在梯度洗脱的过程中控制磷酸水溶液的体积，使得磷酸水溶液占流动相总量的体积百分比大于乙腈。

进一步地，在本发明的较佳实施中，上述色谱条件还包括：用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，检测波长为310－340nm，色谱柱的温度为20－30℃。

进一步地，在本发明的较佳实施中，上述检测波长为327nm，色谱柱的温度为30℃。

进一步地，在本发明的较佳实施中，在进行上述梯度洗脱时：

初始时刻，即t＝0min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为85－95％，乙腈占流动相总量的百分比为5－15％；

t＝15min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为70－80％，乙腈占流动相总量的百分比为20－30％；

t＝40min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为70－80％，乙腈占流动相总量的百分比为20－30％；

t＝45min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为85－95％，乙腈占流动相总量的百分比为5－15％；

t＝60min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为85－95％，乙腈占流动相总量的百分比为5－15％。

进一步地，在本发明的较佳实施中，在进行上述梯度洗脱时：

t＝0min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为90％，乙腈占流动相总量的百分比为10％；

t＝15min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为75％，乙腈占流动相总量的百分比为25％；

t＝40min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为75％，乙腈占流动相总量的百分比为25％；

t＝45min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为90％，乙腈占流动相总量的百分比为10％；

t＝60min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为90％，乙腈占流动相总量的百分比为10％。

进一步地，在本发明的较佳实施中，上述流动相的流速为0.8－1.2ml/min，优选地，流动相的流速为1.0ml/min。

进一步地，在本发明的较佳实施中，上述磷酸水溶液中磷酸的体积比为0.25－0.35％，优选地，磷酸水溶液中磷酸的体积比为0.3％。

进一步地，在本发明的较佳实施中，上述超声波提取的提取时间为30－35min，优选地，超声波提取的提取时间为30min。

进一步地，在本发明的较佳实施中，上述检测方法还包括：在配制供试品溶液时，将经超声波提取后的溶液放冷，再称定重量，并用甲醇溶液补足减失的重量。

一种金银花配方颗粒的质量控制方法，该质量控制方法包括上述金银花配方颗粒的特征图谱的检测方法。

本发明实施例的有益效果是：

本发明实施例的金银花配方颗粒的特征图谱的检测方法，以体积百分比为45－55％的甲醇溶液为提取液，以磷酸水溶液和乙腈作为流动相分别对对照品溶液和供试品溶液进行梯度洗脱，来分析金银花的化学成分，建立了金银花配方颗粒的特征图谱，系统地反映了金银花配方颗粒化学成分的全貌，并且按照本发明实施例的检测方法获得共有峰相对保留时间较为稳定，可为评价或控制金银花配方颗粒的质量提供依据。并且，本发明实施例的特征图谱色谱峰的分离度好，色谱峰之间明显分离，能够准确地得到金银花中主要化学成分的色谱峰，检测方法具有良好的稳定性和重复性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的高效液相特征图谱；

图2为对照品溶液的高效液相特征图谱；

图3为对比例1－1的高效液相特征图谱；

图4为对比例1－2的高效液相特征图谱；

图5为对比例1－3的高效液相特征图谱；

图6为对比例2－1的高效液相特征图谱；

图7为对比例2－2的高效液相特征图谱；

图8为对比例2－3的高效液相特征图谱；

图9为对比例2－4的高效液相特征图谱；

图10为对比例2－5的高效液相特征图谱；

图11为本发明实施例6的高效液相特征图谱；

图12为本发明实施例7的高效液相特征图谱；

图13为对比例3－1的高效液相特征图谱；

图14为对比例3－2的高效液相特征图谱；

图15为本发明实施例8的高效液相特征图谱；

图16为本发明实施例9的高效液相特征图谱；

图17为本发明实施例10的高效液相特征图谱；

图18为本发明实施例11的高效液相特征图谱；

图19为对比例4－1的高效液相特征图谱；

图20为对比例4－2的高效液相特征图谱；

图21为十批供试品金银花配方颗粒的高效液相特征图谱；

图22为本发明实施例建立的金银花配方颗粒的标准图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。在本发明实施例未特别说明时，色谱峰和特征峰具有相同的意义，两者可以互为代替。

本发明实施例采用的材料、试剂和仪器见表1。

表1实验仪器与试药统计表

本发明实施例的金银花配方颗粒的特征图谱的检测方法包括以下步骤：

步骤1.1：配制对照品溶液

取绿原酸并用体积百分比为45－55％的甲醇溶液配制对照品溶液。具体地，取绿原酸适量，精密称定，置棕色量瓶中，加45－55％的甲醇溶液配制成每1ml含40μg的溶液，即得(10℃以下保存)。

优选地，甲醇溶液中甲醇占溶液总量的重量百分比为50％。

步骤1.2：配制供试品溶液

取金银花配方颗粒并用体积百分比为45－55％的甲醇溶液配制成溶液，经超声波提取，得到供试品溶液。在配制供试品溶液时，将经超声波提取后的溶液放冷，再称定重量，并用甲醇溶液补足减失的重量。

具体地，取金银花配方颗粒适量(可选自上述型号中的一种或者多种进行重复试验)，研细，精密称取粉末0.1g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入45－55％的甲醇溶液10ml，称定重量，超声处理(功率240w，频率45khz)30－35min，放冷，再称定重量，用45－55％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

优选地，甲醇溶液中甲醇占溶液总量的重量百分比为50％。

优选地，超声波提取的提取时间为30min。

需要说明的是，在配制对照品溶液和供试品溶液时，采用相同的甲醇溶液进行配制。

步骤1.3：高效液相色谱分析

对对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱分析。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

色谱条件为：以磷酸水溶液和乙腈作为流动相分别对对照品溶液和供试品溶液进行梯度洗脱，并且在梯度洗脱的过程中控制磷酸水溶液的体积，使得磷酸水溶液占流动相总量的体积百分比大于乙腈。

优选地，色谱条件还包括：用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，检测波长为310－340nm，色谱柱的温度为20－30℃(以下简称柱温)。

更优选地，检测波长优选为327nm，色谱柱的温度优选为30℃。

优选地，在进行上述梯度洗脱时：

初始时刻，即t＝0min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为85－95％，乙腈占流动相总量的百分比为5－15％；

t＝15min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为70－80％，乙腈占流动相总量的百分比为20－30％；

t＝40min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为70－80％，乙腈占流动相总量的百分比为20－30％；

t＝45min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为85－95％，乙腈占流动相总量的百分比为5－15％；

t＝60min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为85－95％，乙腈占流动相总量的百分比为5－15％。

更优选地，在进行上述梯度洗脱时：

t＝0min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为90％，乙腈占流动相总量的百分比为10％；

t＝15min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为75％，乙腈占流动相总量的百分比为25％；

t＝40min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为75％，乙腈占流动相总量的百分比为25％；

t＝45min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为90％，乙腈占流动相总量的百分比为10％；

t＝60min时，磷酸水溶液占流动相总量的百分比为90％，乙腈占流动相总量的百分比为10％。

优选地，流动相的流速为0.8－1.2ml/min。更优选地，流动相的流速为1.0ml/min。

优选地，磷酸水溶液中磷酸的体积比为0.25－0.35％。更优选地，磷酸水溶液中磷酸的体积比为0.3％。

经过上述步骤后，将对照品溶液的特征图谱与供试品溶液的特征图谱进行比对，指认出供试品溶液的特征图谱中代表绿原酸的色谱峰，并对其他色谱峰进行编号，从而建立起了金银花配方颗粒的特征图谱。按照本发明实施例的检测方法建立的金银花配方颗粒的特征图谱系统地反映了金银花配方颗粒化学成分的全貌，并且共有峰相对保留时间稳定、色谱峰的分离度好。

本发明实施例的金银花配方颗粒的质量控制方法，其包括本发明实施例的金银花配方颗粒的特征图谱的检测方法。具体地：

步骤2.1：按照本发明实施的检测方法建立金银花配方颗粒的标准图谱。

步骤2.2：建立待检测颗粒样品的特征图谱。具体地：将待检测的颗粒样品按照本发明实施例的检测方法进行检测，获得液相特征图谱。

步骤2.3：将颗粒样品的特征图谱与标准图谱进行对比，通过图谱中的色谱峰出峰时间、峰数量、峰值等参数来评价或控制颗粒样品的质量。

下面结合实施例对本发明进一步说明。

实施例1

本实施例的特征图谱是按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定的。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相a：0.3％磷酸水溶液(v/v，体积比)，流动相b：乙腈，按下表2进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长为327nm，柱温30℃。

表2

供试品溶液的制备：取金银花配方颗粒样品(批号s151010－1)适量，研细，精密称取粉末0.1g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率240w，频率45khz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

取上述供试品溶液10μl注入液相色谱仪中测定，即得。

根据本实施例提供的检测方法，获得的供试品溶液的特征图谱如图1所示，对照品溶液的特征图谱如图2所示。结合图2，指认出图1中代表绿原酸的色峰，并编号为s峰(或者峰2)，同时分别对其他色谱峰进行编号。如图1所示，供试品溶液的特征图谱包括6个特征峰，以峰2对应的峰为s峰，各特征峰与s峰的相对保留时间为：峰1：0.73，峰2：1.00，峰3：1.06，峰4：2.05，峰5：2.17，峰6：2.31。

实施例2－3

实施例2－3与实施例1基本相同，区别在于，作为提取溶媒的甲醇溶液的浓度发生变化，实施例2为45％的甲醇溶液，实施例3为55％的甲醇溶液。

实施例4－5

实施例4－5与实施例1基本相同，区别在于，超声波提取时间不同，实施例4为33min，实施例5为35min。

实施例6－7

实施例6－7与实施例1基本相同，区别在于，柱温不同，实施例6为20℃，实施例7为25℃。

实施例8－11

实施例8－9与实施例1基本相同，区别在于，检测波长不同，实施例8为330nm，实施例9为340nm，实施例10为310nm、实施例11为320nm。

实施例12

本实施例的特征图谱是按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定的。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相a：0.25％磷酸水溶液(v/v，体积比)，流动相b：乙腈，按下表3进行梯度洗脱，流速0.8ml/min，检测波长为330nm，柱温25℃。

表3

供试品溶液的制备：取金银花配方颗粒样品(批号s151010－1)适量，研细，精密称取粉末0.1g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入45％甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率240w，频率45khz)33分钟，放冷，再称定重量，用45％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

取上述供试品溶液10μl注入液相色谱仪中测定，即得。

实施例13

本实施例的特征图谱是按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定的。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相a：0.35％磷酸水溶液(v/v，体积比)，流动相b：乙腈，按下表4进行梯度洗脱，流速1.2ml/min，检测波长为340nm，柱温35℃。

表4

供试品溶液的制备：取金银花配方颗粒样品(批号s151010－1)适量，研细，精密称取粉末0.1g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入55％甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率240w，频率45khz)35分钟，放冷，再称定重量，用55％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

取上述供试品溶液10μl注入液相色谱仪中测定，即得。

实施例14

本实施例的特征图谱是按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定的。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相a：0.3％磷酸水溶液(v/v，体积比)，流动相b：乙腈，按下表5进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长为327nm，柱温30℃。

表5

供试品溶液的制备：取金银花配方颗粒样品(批号s151010－1)适量，研细，精密称取粉末0.1g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率240w，频率45khz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

取上述供试品溶液10μl注入液相色谱仪中测定，即得。

试验例1提取溶媒的优化设计

本试验例的目的是在于研究提取溶酶对色谱峰分离度的影响，以优化出最佳的提取溶媒。

按照实施例1的检测方法对实施例1、实施例2、实施例3、对比例1－1、对比例1－2、对比例1－3进行特征图谱的测定。试验条件及检测结果见表6。本试验例提供了对比例1－1、对比例1－2、对比例1－3的特征图谱(也即是本发明所指的高效液相特征图谱)，分别如图3、图4、图5所示。表6中所指百分比为体积百分比。

表6

从图1、图3至图5以及表6可以看出，选取浓度为45－55％的甲醇溶液作为提取溶媒，其获得的色谱峰的分离度比由纯的甲醇、纯的乙醇以及75％的乙醇溶液作为提取溶媒都要好，其中50％的甲醇溶液其分离度最佳。而对比例1－1、对比例1－2、对比例1－3的特征图谱色峰分离差，有其他峰值出现。

试验例2提取时间的优化设计

本试验例的目的是在于研究提取时间对金银花配方颗粒在提取溶酶中溶解程度的影响，以优化出最佳的提取时间。

按照实施例1的检测方法对实施例1、实施例4、实施例5、对比例2－1、对比例2－2、对比例2－3、对比例2－4和对比例2－5进行特征图谱的测定。试验条件及检测结果见表7。本试验例还提供了对比例2－1、对比例2－2、对比例2－3、对比例2－4和对比例2－5的特征图谱，分别如图6、图7、图8、图9和图10所示。

表7

从图1、图6至10以及表7可以看出，当提取时间为15min(对比例2－1)或者20min(对比例2－2)时，将检测图谱与标准谱图进行比对，其色谱峰没有全部显现。图6所表示的对比例2－1，其只有3个特征峰，与图1所表示的实施例1相比，其缺乏特征峰4、5、6。图7所表示的对比例2－2，特征峰大部分显现，与图1所表示的实施例1相比，其缺乏特征峰5。说明当提取时间低于30min时，在超声波提取时，金银花颗粒的主要成分没有全部提取出来。而当提取时间增加至30min时，金银花颗粒的主要成分开始全部显现，并且色谱峰分离明显，当提取时间继续增加至40min、50min或60min时，图谱上的色谱峰不再增加，色谱峰值稳定，分离明显。本发明实施例将提取时间为30－35min，其能够足以将金银花配方颗粒中主要成分全部提取出的同时还可以避免因提取时间过长而降低检测效率。

试验例3柱温的优化设计

本试验例的目的是在于研究柱温对色谱峰的影响，以优化出最佳的色谱柱温度(简称柱温)。

按照实施例1的检测方法对实施例1、实施例6、实施例7、对比例3－1和对比例3－2进行特征图谱的测定。试验条件及检测结果见表8。图11和图12分别为实施例6、实施例7的特征图谱。图13和图14分别为对比例3－1和对比例3－2的特征图谱。

表8

从图1、图11－图14以及表8可以看出，当柱温在20－30℃范围内时，色谱峰分离度好，整体峰型呈正太分布，当柱温超过该范围，例如35℃、40℃时，色谱峰为非正太分布，色谱峰有重合，分离度差。

试验例4检测波长的优化设计

本试验例的目的是在于研究检测波长对色谱峰的影响，以优化出最佳的检测波长。

按照实施例1的检测方法对实施例1、实施例8、实施例9、实施例10、实施例11、对比例4－1和对比例4－2进行特征图谱的测定。试验条件及检测结果见表9，图1、图15、图16、图17和图18分别为实施例1、实施例8、实施例9、实施例10、实施例11的特征图谱。同时，本实施例还提供了对比例4－1和对比例4－2的特征图谱，见图19和图20。

表9

如图19、图20以及表9所示，在370nm或385nm检测的色谱峰多但是各色谱峰分离度较差，含有的杂质较多，主要色谱峰峰面积较小；而如图1、以及图15－图18所示，在310－340nm下的色谱峰分数较多，主要成分全部显现，且各峰之间的分离度较好，信息量大，各峰之间分离度较好，主要色谱峰面积大。

试验例5本发明实施例的检测方法的精密度试验

以实施例1为例，对其进行色谱分析，每次进样体积为10μl，记录60min内的特征图谱，检测结果见表10和表11。

表10特征峰相对保留时间比值

表11特征峰相对峰面积比值

如表10和表11所记录的结果，所得各特征峰的相对保留时间rsd均小于0.3％，特征峰的相对峰面积rsd均小于2.0％，说明本发明实施例的检测方法精密度好。

试验例6本发明实施例的检测方法的重复性试验

以实施例1为例，称取6份金银花配方颗粒按照实施例1提供的检测方法进行色谱分析，进样体积10μl，记录60min内的特征图谱，检测结果见表12和表13。

表12特征峰相对保留时间比值

表13特征峰相对峰面积比值

如表12和表13所记录的结果，所得各特征峰的相对保留时间rsd均小于0.3％，特征峰的相对峰面积rsd均小于2.0％，说明本实发明实施例的检测方法重复性好。

试验例7本发明实施例的检测方法的稳定性试验

以实施例1为例，称取同一批金银花配方颗粒(例如批号s151010－1)按照实施例1提供的检测方法进行色谱分析，分别于0，4，8，12，24h五个时间节点进样并测定，记录60min内的特征图谱，检测结果见表14和表15。

表14特征峰相对保留时间

表15特征峰相对峰面积比值

从表14和表15可以看出，相对应的色谱峰相对保留时间rsd均小于0.3％，特征峰的相对峰面积rsd均小于2.0％，结果表明供试品溶液在24h内稳定。

金银花配方颗粒特征图谱的建立

按照实施例1所提供的检测方法，取10批金银花配方颗粒(s151010－1、s151010－2、s151010－3、s151013－1、s151013－2、s151013－3、s151016－1、s151016－2、s151016－3、s151016－4)的供试品溶液，进样，记录60min特征图谱，检测结果见表16，10批金银花配方颗粒的特征图谱如21所示。

表16特征峰相对保留时间

如表16和图21所示，10批配方颗粒有6个共有峰，分别在5.8、8.0、8.4、16.4、17.4、18.4min左右出峰。共有峰保留时间及相对保留时间均具有较好的重复性。这6个共有峰出峰时间较为稳定，可作为金银花配方颗粒的特征峰。

由此，建立起金银花配方颗粒的特征图谱如图22所示，以其作为标准图谱，对后续待检测颗粒进行质量检测及控制。

综上所述，本发明的金银花配方颗粒的特征图谱的检测方法，其建立的特征图谱系统地反映了金银花配方颗粒的化学成分全貌，共有峰相对保留时间较为稳定，并且该检测方法精密度高、重复性好、稳定性好，可为评价或控制金银花配方颗粒的质量提供依据。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。