本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种能够验证酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白质检测技术。
背景技术：
定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行鉴定，并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定，是当前生命科学研究的重要内容。近年来，由于质谱技术和生物信息学的进步，定量蛋白质组学在分析蛋白质组或亚蛋白质组方面已取得了令人瞩目的成就。
在种种成熟的蛋白质定量分析技术中，最普遍的技术是基于三重四极杆质谱(triplequadrupole)，在选择反应监控模式(selectedreactionmonitoring，srm)下对蛋白质中特异肽进行检测。在完全酶解的情况下，特异肽的摩尔浓度与对应蛋白质的摩尔浓度相同，故可以通过其与蛋白质分子量计算获得蛋白质的质量浓度。如公开号为cn103616454a的专利文献公开了一种定量检测人β-酪蛋白含量的方法以及试剂盒，该方法中利用人β-酪蛋白酶解后所获得的特异多肽序列，设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标物的序列，并基于内标法对人β-酪蛋白进行定量检测。
在过去的10年间，虽然产生了许多方法提高特异肽的检测准确度，主要包括各种同位素内标标记策略，但是一直缺乏一种简单有效的方法，用于验证蛋白质是否完全酶解、目标特异肽是否完全从蛋白质中释放出来。如果不对蛋白质酶解效果进行有效的验证，对于后续所有的提高特异肽检测准确度的研究也就无从说起。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种能够验证酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白质检测技术，可以对特异肽是否已完全从待测蛋白质样品酶解得到，进行有效的验证，以获得准确的特异肽的浓度。
本发明的技术方案为：一种能够验证酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白质检测技术，包括：
(1)采用酶对待测蛋白质样品进行酶解，得到酶解物；
(2)对所述酶解物中验证肽和特异肽进行检测，并根据检测结果验证待测蛋白质样品的酶解效果；
(3)若通过酶解效果验证，表示特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，则用所获得的特异肽浓度乘以待测蛋白质样品的分子量获得蛋白质的质量浓度；
(4)若未通过酶解效果验证，表示特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到，则将酶解物再次进行酶解优化处理；
所述验证肽中至少含有一个或一个以上在待测蛋白质中最后被所述酶所酶解的位点；或，所述验证肽为所述特异肽向n端或者c端延长至一个或一个以上酶解位点的多肽。
本发明通过检测酶解物中的验证肽来判断蛋白质是否被完全酶解、所有特异肽是否从蛋白质中完全释放出来。本发明中对于验证肽的选择来说，可以选择含有最难以被酶解(酶解时间最长)的酶解位点的多肽作为验证肽，若含有最难以酶解位点的多肽已经酶解完全，那么则特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到。
一般来说，为每个蛋白质只需选择一条多肽作为特异肽。在此情况下，所以无需追求蛋白质彻底水解，只要保证所选择的特异肽完全释放出来即可。因此本发明在此情况下，本发明还可以选择特异肽向n端或者c端延长至一个或一个以上酶解位点的多肽作为验证肽。
本发明中验证肽的选择有多种，作为优选，所述验证肽为所述特异肽向特异肽的n端延长至下一个酶解位点的多肽。对于位于蛋白质c端的特异肽，可以选择向n端延伸至下一个酶解位点的多肽作为验证肽。
作为优选，所述验证肽为所述特异肽向特异肽的c端延长至下一个酶解位点的多肽。对于位于蛋白质n端的特异肽，可以选择向c端延伸至下一个酶解位点的多肽作为验证肽。
作为优选，步骤(2)中，所述验证肽和特异肽采用液相色谱-质谱联用技术同时检测。本发明中对验证肽进行检测时，可以采用与特异肽相同的检测方法，其中预处理方法和仪器通用参数与特异肽完全一致，仅增加验证肽专属的srm参数。因此本发明可以在不增加实验操作和成本的前提下，仅通过参数的设置即实施成本发明，从而本发明具有很高的便利性和实用性。
本发明中采用液相色谱-质谱联用技术对验证肽进行检测时，为了降低检测误差，本发明需要合理设置验证肽的检测参数，由于仪器品牌型号、状态、信号的表达方式的差异，相同浓度的验证肽在不同设备上所产生的信号也不同。所以验证肽的阈值无法是一个绝对值，而是是一个相对值，作为优选，所述验证肽的信号强度阈值设置为所述特异肽信号强度的1％。若验证肽的信号强度小于所述验证肽的信号强度阈值时，则特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，反之，特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到。
作为优选，所述验证肽的信噪比低于3。若验证肽的信号强度小于所述验证肽的信噪比时，则特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，反之，特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明中若酶解产物中含有所述验证肽时，则特异肽未完全从待测蛋白质样品中酶解得到，待测蛋白质样品还需再次进行酶解，可以再一次进行酶解优化处理，并重复对验证肽和特异肽的检测过程，直至酶解产物中不含有所述验证肽；反之，若酶解产物中未含有所述验证肽时，则特异肽完全从待测蛋白质样品中酶解得到，因此本发明可以通过对验证肽的检验来验证蛋白质的酶解效果，从而可以对于待测蛋白质是否酶解完全释放得到所对应的特异肽进行鉴定，以获得准确的特异肽的浓度，进而准确的换算出待测蛋白质的含量。
具体实施方式
实施例1(验证肽的筛选方法)
取1mgβ乳球蛋白，溶于1ml水中。取100μl上述溶液，于2ml塑料离心管中，依次加入10μl二硫苏糖醇溶液(100mmol/l)和865μl碳酸氢铵溶液(500mm)，混合均匀后在70℃水浴锅中孵育30min；加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均匀后在室温环境中避光静置30min；加入胰蛋白酶溶液10μl，于37℃水浴锅中反应10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、180、240min；样品在完成反应后迅速加入5μl甲酸溶液，通过0.22μm滤膜过滤。上述样品首先在高分辨质谱进行多肽的筛选，其高效液相色谱参数如下：
高效液相色谱仪：thermoscientificeasy-nlc1000；
色谱柱：easy-spraycolumn(c18，2μm，
上样量：2μl；
流动相：a相：含0.1％甲酸、2％乙腈的水溶液；b相：含0.1％甲酸的乙腈溶液；
液相色谱梯度：b相在2分钟内从3上升至8％，在80分钟内从8％上升至20％，在10分钟内从20％上升至30％，在5分钟内从30％上升至70％，在3分钟内从70％上升至90％，在90％维持20分钟。
流速：250nl/min；
质谱参数如下：
质谱仪：thermoscientificqexactive；
喷雾电压：2kv；
毛细管温度：250℃；
s-lens：55％；
碰撞能量：27％hcd；
分辨率设置：一级70000@m/z200，二级17500@m/z200；
母离子扫描范围：m/z300-1800；
子离子扫描范围：从m/z100开始；
data-dependentms/ms：top20；
多肽筛查软件设置如下：
蛋白质一级序列数据库：p02754(采集自uniprotkb)；
蛋白酶：胰蛋白酶；
最大漏切位点：1；
固定修饰：c烷基化；
可变修饰：m氧化；
通过上述方法所测得包含1个漏切位点的多肽可视作候选验证肽，通过观察其峰面积来考察其酶解状况，随着酶解时间的增加，验证肽首先从蛋白质中释放出来，然后进一步酶解成不含有漏切位点的多肽，所以验证肽的信号强度呈现先上升后下降的趋势。在这些验证肽所需的完全酶解时间，即他们的信号低于阈值所需的时间见表1，其中，多肽(序列为seqidno.3)所需要的酶解时间为90min，最难以酶解，因此可将多肽(序列为seqidno.3)作为验证肽使用。
表1β乳球蛋白酶解得到的包含1个漏切位点的多肽完全酶解的时间
实施例2(应用实施例1验证肽来检测样品中β乳球蛋白质的含量)
样品预处理方式：称取10g样品于100ml容量瓶中，用水稀释并定容至刻度。取上述溶液10μl于2ml塑料离心管中，依次加入10μl同位素特异肽溶液、10μl二硫苏糖醇溶液(100mmol/l)和945μl碳酸氢铵溶液(500mm)，混合均匀后在70℃水浴锅中孵育30min；加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均匀后在室温环境中避光静置30min；加入胰蛋白酶溶液10μl，于37℃水浴锅中反应90min；加入5μl甲酸溶液，通过0.22μm滤膜过滤，进样分析。
上述特异肽和验证肽的检测通道参数见表2，其中液相色谱条件和质谱条件高效液相色谱分离条件如下：
色谱柱为c18色谱柱，柱温为40℃；流动相a为体积百分比为0.1％的甲酸的乙腈溶液，流动相b为体积百分比为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3ml/min；
其中，梯度洗脱为：
流动相a的体积百分比由3％耗时10min上升至40％，对应地流动相b的体积百分比由97％耗时10min下降至60％，然后改为100％流动相a冲洗2min，最后改为流动相a体积百分比3％和流动相b体积百分比97％保留3min；
进样分析质谱条件：
毛细管电压：3.5kv；锥孔电压：35kv；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气流量：900l/min；锥孔反吹气流量：30l/hr；碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5v；高端分辨率1：15.0v；离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8v；高端分辨率2：15.0v；离子能量2：1.0；离子源温度：150℃；提取器电压：3.0v；入口透镜电压：0.5v；出口电压：0.5v；碰撞梯度：1.0。
特异肽标准曲线预处理方式：将合成的特异肽用水稀释，配制成系列标准曲线溶液，取10μl标准曲线溶液，依次加入10μl混合同位素特异肽溶液、10μl二硫苏糖醇溶液(100mmol/l)和845μl碳酸氢铵溶液(500mm)，混合均匀后在70℃水浴锅中孵育30min；加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均匀后在室温环境中避光静置30min，加入5μl甲酸溶液，通过0.22μm滤膜过滤，进样分析，分析参数同上。
样品计算方式：蛋白质质量浓度＝特异肽的摩尔浓度×蛋白质的分子量
表2特异肽和验证肽的检测通道参数
同位素特异肽与特异肽的序列相同，区别仅在于，同位素特异肽与特异肽上中的某些元素互为同位素。结果显示，在90min的酶解时间之后，验证肽无法被测得，说明该样品已经完全酶解，该样品中β乳球蛋白的含量为1.94g/100g；当酶解时间延长至180min，测得的β乳球蛋白没有显著性增加，说明通过验证肽可以有效判断蛋白质是否完全酶解。
实施例3(验证肽的筛选方法)
对于部分蛋白质来说，难以完全酶解，所以难以通过如实施例1所述的验证肽进行验证。本实施例确定特异肽之后，以特异肽为基础，向特异肽的n端或者c端延伸到下一个酶解位点的多肽作为验证肽，当验证肽信号值低于阈值时，可以认为对应的特异肽已经完全从蛋白质中释放出来了。
对于位于蛋白质n端的特异肽，可以选择向c端延伸至下一个酶解位点的多肽作为验证肽。对于位于蛋白质c端的特异肽，可以选择向n端延伸至下一个酶解位点的多肽作为验证肽。
验证肽的筛选中仪器参数与实施例1相同。具体例子：
牛κ酪蛋白的特异肽为seqidno.14，其向n端延伸的验证肽序列为seqidno.15，向c端延伸的验证肽序列为seqidno.16，两条验证肽完全酶解时间均为60min，所以只需选择其中一条用于验证，无需同时监控两条验证肽。(见表3)牛β酪蛋白的特异肽为seqidno.17，由于它位于蛋白质的c端，所以候选验证肽只有一条，为：seqidno.18。(见表4)
表3牛κ酪蛋白特异肽、同位素特异肽和验证肽的检测通道参数
表4牛β酪蛋白特异肽、同位素特异肽和验证肽的检测通道参数
实施例4
本实施例以可可奶为基质验证本发明准确性，操作方法如下：
样品预处理方式：称取10g可可粉于100ml容量瓶中，加入1mg/mlβ酪蛋白100μl，用水溶解并定容至刻度。取上述溶液10μl于2ml塑料离心管中，依次加入10μl同位素特异肽溶液、10μl二硫苏糖醇溶液(100mmol/l)和945μl碳酸氢铵溶液(500mm)，混合均匀后在70℃水浴锅中孵育30min；加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均匀后在室温环境中避光静置30min；加入胰蛋白酶溶液10μl，于37℃水浴锅中反应60min和180min；加入5μl甲酸溶液，通过0.22μm滤膜过滤，进样分析。
后续预处理和检测与实施例2相同，srm参数见表4。
结果显示，样品酶解时间为60min时，样品中验证肽的信号值高于阈值，说明该样品未完全酶解，回收率仅为63.8％，原因是可可粉中含有的基质会影响胰蛋白酶活力，导致其酶解时间增加。在没有完全酶解验证方法的情况下，无法对这种酶活力降低的情况进行准确预期。而将酶解时间增加到180min后，验证肽的信号值显著下降，低于阈值，此时回收率为98.1％，符合本发明的预期。