本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种poct定量检测系统。
背景技术：
目前以胶体金和荧光层析为代表的定量poct系统在临床应用上越来越广泛。但是目前这一系统存在较大的问题就是检测不稳定，精密度比电化发光和临床生化产品的检测有很大差距，因此只能作为参考指标用于病情初筛，而不能直接用于诊断。精密度差的一个重要原因是检测时没有独立的内标物。
以荧光定标poct为例说明目前提高精密度的方法。荧光定量poct在处理液中包含荧光物质的抗体，当样本中的被测物与标记了荧光微球的抗体反应后，在检测t线区域被捕获，没有接合被测物的标记了荧光微球的抗体在检测c线区域被捕获，然后通过计算t线区域的荧光信号和c线区域的荧光信号比值来作为输出。如果带有标记荧光微球的抗体全部被t线和c线捕获时，输出的信号没有误差，然而这只是理想情况。实际情况是标记了荧光微球的抗体不能完全释放，而且每个测试，释放的比例也不尽相同，所以输出就会与真实值存在偏差，这一偏差便是目前这一产品测量不稳定的关键因素。
有人使用某些毒品的抗体作为独立的内标物来解决这一问题，主要基于正常人体内不含毒品抗体或抗原。因此这一方法对于无吸毒经历的人群，可取得了较好效果。但是当患者有吸毒史，便会影响检测。因此毒品的抗体作为独立的内标物存在一定的缺陷。另一个问题是，现有纸层析poct产品，完全采用免疫反应，反应时间较长，一般为10～15分钟，这么漫长的检测时间会错失医生诊断挽救生命的时间。并且现有技术中使用抗体作为内标物，荧光检测试剂上有大量荧光物质残留，从而使得检测精度低。
技术实现要素：
因此，本发明针对现有技术中没有独立内标物的纸层析技术，或采用以毒品的抗体作为独立内标物的改进技术检测中出现的不足(前者在检测中由于载体释放不完全导致重现性差，后者由于中患者隐瞒有吸毒史，导致检测偏差)，以及检测试剂上有大量荧光物质残留的技术问题，设计了用单链核酸作为独立内标物的poct检测系统。本系统解决了上述问题，一方面使产品的重现性即精度提高，而且提高了有吸毒史的患者检测的准确性，另一方面也可以使检测过程时间缩短，为医生快速诊断提供保障。
本发明的poct定量检测系统，其包括：测试试剂，该测试试剂包含标记有第一抗体的载体和标记有单链寡聚核苷酸a作为内标物的载体；至少一第一检测试剂，所述第一检测试剂包含第二抗体；和至少一第二检测试剂，所述第二检测试剂包含与单链寡聚核苷酸a序列互补的单链寡聚核苷酸a'；其中所述第一抗体与第二抗体分别可与样本中的抗原发生反应。
本发明采用核酸作为poct定量检测系统的内标物，其基本原理为碱基互补配对原则，即在dna的分子结构中，由于碱基之间的氢键具有固定的数目和dna两条链之间的距离保持不变，使得碱基配对必须遵循一定的规律，这就是adenine(a，腺嘌呤)一定与thymine(t，胸腺嘧啶)，在rna中与uracil(u，尿嘧啶)配对，guanine(g，鸟嘌呤)一定与cytosine(c，胞嘧啶)配对，反之亦然。而且这种配对相对于免疫反应，具有更高的专一性，因此可以解决使用传统方法作为内标物的非特异性，提高检测的准确性。
其中，所述poct定量检测系统包括样本流入区和样本检测区；所述样本检测区依次固定有所述第一检测试剂和所述第二检测试剂。
所述样本流入区为滴入子区，滴入有测试试剂和具有抗原的样本的混合液。或者，所述样本流入区具有滴入子区和释放子区，所述滴入子区供含有抗原的样本滴入；所述释放子区固定有所述测试试剂。
所述第一抗体通过物理吸附或化学交联的方法固定到载体上；所述单链寡聚核苷酸a通过物理吸附或化学交联的方法固定到载体上。
所述载体为荧光胶球、磁珠、量子点、荧光素或纳米金颗粒，优选荧光胶球。
所述单链寡聚核苷酸a为人工合成或天然的不同于人基因序列的5～5000个碱基。
所述样本检测区依次包含固定有所述第一检测试剂的第一检测区和固定有所述第二检测试剂的第二检测区，所述第一检测区为1～48个，优选2个；所述第二检测区为1～10个，优选1个。
所述样本检测区之后还具有吸水区，所述poct定量检测系统还包括一底板，所述滴入子区、释放子区、样本检测区和吸水区依次设在所述底板上。
所述第一抗体为1～40个；所述第二抗体为1～40个。所述1～40个第一抗体，可与样本中的1～40个不同抗原反应；所述1～40个第二抗体也可与样本中的1～40个不同抗原发生反应，但是第一抗体与第二抗体是与样本中1～40个抗原中的同一抗原发生反应。
所述poct定量检测系统可用传统的纸层析方式：即该poct定量检测系统包括一底板，所述滴入子区、释放子区、样本检测区和吸水区依次设在所述底板上。poct定量检测系统也可以为微管反应：即该poct定量检测系统包括一组管路，预先将第一检测试剂和第二检测试剂固定到管路中，当测试试剂与样本混合后，滴入样本流入区，然后在第一检测试剂和第二检测试剂固定处发生反应。
本发明的积极进步效果在于：与目前的方法相比，在方法上较目前存在巨大优势，一是相对与毒品的抗体采购容易，成本低廉。人的全基因测序已经完成，因此完全可以设计出与人基因不同的序列，因此在检测人体液时，不会受到干扰。当使用核酸作为内标物时，由于核酸的反应比蛋白更灵敏，因此反应较快，因此相同条件下，使用核酸作为内标物，可以缩短检测时间。而且检测试剂上荧光物质残留大大减少。另外当样本中存在需要检测的多个指标抗原的时候，可以共用一个内标物，可以实现一个样本检测后，输出多个结果，可以节约成本。而且针对不同的多指标抗原，检测系统更具有普适性，并且内标物的结合特异性更强。
附图说明
图1为poct定量检测系统。
具体实施方式
如图1所示，为本发明的poct定量检测系统，下面具有一底板90，底板90上依次包括样本流入区10，样本流入区10又包括滴入区12如采用普通聚酯纤维材质、释放子区14如采用玻璃纤维材质、检测区20如采用硝酸纤维素膜材质，包括第一检测区22和第二检测区24，和吸水区30如采用普通的吸水纸。释放子区14预先处理有通过物理吸附或化学交联等方法固定有第一抗体的载体和通过物理吸附或化学交联等方法固定有单链寡聚核苷酸a的载体，第一抗体可与样本中的抗原发生反应结合。单链寡聚核苷酸a可为人工合成或天然的不同于人基因序列的5～5000个碱基。载体可为荧光胶球、磁珠、量子点、荧光素或纳米金颗粒，优选荧光胶球。第一检测区22例如2个，22a和22b，针对单指标抗原的样本，22a和22b处可喷涂相同第二抗体的第一检测试剂；针对双指标抗原的样本，22a和22b处可喷涂含有两种不同第二抗体的第一检测试剂。该处喷涂的第二抗体可与样本中的抗原发生反应结合，从而捕获样本中的抗原；和第二检测区24，例如1个，预先处理有含有与单链寡聚核苷酸a序列互补的单链寡聚核苷酸a'的第二检测试剂，从而可捕获单链寡聚核苷酸。最终，检测在固定第一检测试剂处的载体信号和固定第二检测试剂处的载体信号以形成对照结果输出。
实施例1单t线单指标肌钙蛋白荧光层析试剂检测系统
材料：羧基荧光胶球，直径300nm，货号fc02f，购自bangslaboratories,inc.。
12bp氨基化单链dnag-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-精氨酸和12bp单链dnac-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
肌钙蛋白抗体，货号分别4t21cc和4t21，购自hytest。
方法：
1、按照bangslaboratories,inc.技术指导technote205文件中的相关说明，将10mg4t21cc抗体接到1mlfc02f上，然后用100mmol/ltris缓冲液稀释10倍，编号latex1a备用。
2、按照bangslaboratories,inc技术指导technote302文件中的相关说明，将1mg氨基化单链dnag-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-精氨酸接到0.25mlfc02f上，然后用100mmol/ltris缓冲液稀释2倍，编号latex2a备用。
3、将10mllatex1a和0.5mllatex2a混合，然后使用biodot的xyz3060处理平台，将混合物喷到玻璃纤维上，图1中的位置14。
4、使用biodot的xyz3060处理平台，将10mg/ml的4t21的肌钙蛋白抗体喷到图1的位置22a处，位置22a处为硝酸纤维素材质。位置22b不做喷涂。
5、使用biodot的xyz3060处理平台，将2mg/ml的4t21的单链dnac-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c喷到图1的位置24处。
检测过程：将60μl心脏病患者血清样本10份分别滴到10根上述荧光层析试剂的位置12，等待6分钟。样本中的肌钙蛋白在位置14与步聚1制备的荧光抗体进行反应，形成肌钙蛋白抗原+抗体+荧光球的三聚体和不参加反应的荧光球+单链dna。反应完成后，液体层析到22a位置，三聚体被处理在这里的第二抗体捕获。其余的液体继续向前，流到位置24的时候，荧光球+单链dna上的dna被互补dna捕获。之后通过仪器在波长610nm下测量位置22a和位置24上的载体荧光强度之比作为结果，输出给上位机，上位机根据样本中的肌钙蛋白含量与结果的对应关系，计算出样本中的肌钙蛋白含量。同时以武汉明德生物科技有限责任公司市售的荧光层析试剂为对照组，加上样本后，反应15分钟，检测，结果如表1所示。
结论：上述血清样本滴加在10根上述的单t线单指标肌钙蛋白荧光层析试剂检测系统，所得变异系数为4.2％。而市售武汉明德生物科技有限责任公司的肌钙蛋白i(ctni)检测试剂盒(免疫层析法)为9.2％。说明通过采取单链寡聚核苷酸作为独立内标物后，检测精密度有显著提高。本实施例的检测时间为6分钟，低于市售产品的检测时间为10分钟，因此可以为医生诊断节约时间。同时实施例1的检测试剂盒的硝酸纤维素前端荧光物质残留较少，而对照组的检测试剂盒残留较多。
表1本发明的荧光层析试剂检测出的肌钙蛋白含量
备注：变异系数＝均值/标准偏差*100％
实施例2双t线单指标肌钙蛋白荧光层析试剂检测系统
材料与方法同实施例1，不同之处在于：继续使用biodot的xyz3060处理平台，在位置22b处继续进一步喷涂5mg/ml的4t21的肌钙蛋白抗体。
检测过程：将60μl心脏病人的血清样本滴到位置12，等待6分钟。样本中的肌钙蛋白在位置14与步聚1制备的荧光抗体进行反应，形成肌钙蛋白抗原+抗体+荧光球的三聚体和不参加反应的荧光球+单链dna。反应完成后，液体层析到22a位置，三聚体被处理在这里的抗体捕获。其余的液体继续向前，流到位置22b的时候，位置22a没有捕获的三聚体在这里继续被捕获，其余的液体继续向前，流到位置24的时候，荧光球+单链dna上的dna被互补dna捕获。之后通过仪器在波长610nm下测量位置22a和22b与24的荧光强度，然后将位置22a和22b的信号之和，再与位置24的信号之比作为结果，输出给上位机。同时该样本采用实施例1的检测系统进行检测。
结果显示：采用实施例1的检测系统的检测结果为70μg/l，实施例2的检测值为73μg/l，但系统提示用户进行释放后再检测，检测值为110μg/l。其实原理在于，样本中含有大量的抗原，这些抗原无法全部与第一检测试剂反应，而多余的抗原，直接与第一条t线结合，这样前述的三聚体就无法再与第一条t线结合，而导致第二条t线信号超过第一条t线信号。当仅有一条t线时，则无法结合的三聚体就会流入下游，从而导致检测结果偏低。
实施例3双指标脑钠肽(bnp)和肌钙蛋白荧光层析试剂检测系统
材料：羧基荧光胶球，直径300nm，货号fc02f，购自bangslaboratories,inc.
20bp的氨基化单链dnaa-a-a-a-a-a-a-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-精氨酸和20bp单链dnat-t-t-t-t-t-t-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
两株肌钙蛋白抗体4c2cc和m155cc，货号4t21cc，购自hytest。
bnp单克隆抗体24c5抗体和26e2抗体，货号4bnp2，购自hytest。
方法：按照bangslaboratories,inc.技术指导technote205文件中的相关说明，将4c2cc抗体接到1mlfc02f上，编号latex1c备用。
按照bangslaboratories,inc.技术指导technote205文件中的相关说明，将24c5抗体接到1mlfc02f上，编号latex2c备用。
将latex1c和latex2c等比混合，然后用100mmol/ltris缓冲液稀释5倍，编号为latex3c备用。
按照bangslaboratories,inc技术指导technote302文件中的相关说明，将1mg氨基化单链dnaa-a-a-a-a-a-a-a-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-精氨酸接到0.25mlfc02f上，然后用100mmol/ltris缓冲液稀释2倍，编号latex4c备用。
将latex3c和latex4c按照体积比为10:1进行混合，然后使用biodot的xyz3060处理平台，将混合物喷到位置14。
使用biodot的xyz3060处理平台，将10mg/ml的m155cc肌钙蛋白抗体喷到位置22a处。
使用biodot的xyz3060处理平台，将10mg/ml的26e2bnp抗体喷到位置22b处。
使用biodot的xyz3060处理平台，将2mg/ml的4t21的单链dnat-t-t-t-t-t-t-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c喷到位置24处。
检测过程：将60μl心脏病人血清样本滴到位置12等待6分钟。样本中的肌钙蛋白在位置14与步聚1制备的荧光抗体进行反应，形成肌钙蛋白抗原+抗体+荧光球的三聚体；样本中的bnp在位置14与步聚2制备的荧光抗体进行反应，形成bnp抗原+抗体+荧光球的三聚体；液体中除了有上述两个三聚体外，还包括不参加反应的荧光球+单链dna。反应完成后，液体层析到22a位置，肌钙蛋白三聚体被处理在这里的抗体捕获。其余的液体继续向前，液体层析到22b位置，bnp三聚体被处理在这里的抗体捕获，而剩余的荧光球+单链dna在位置24，被其互补dna捕获。之后在610nm波长下测量位置22的荧光强度为0.12、24的荧光强度为13.98，然后将位置22a与位置24信号之比作为肌钙蛋白结果为0.28微克/升，将位置22b与位置24信号之比作为bnp结果输出给上位机，上位机根据样本中的肌钙蛋白含量与结果的对应关系，便可以根据检测结果反算出样本中的肌钙蛋白含量，再根据样本中的bnp含量与结果的对应关系，便可以根据检测结果反算出样本中的bnp含量，为415.3微克/升。同一样本，重复检测9次，计算得到检测肌钙蛋白i的精密度为5.9％，检测bnp的精密度为7.5％。
实施例4单t线单指标肌钙蛋白荧光层析试剂检测系统
在进行实施例1的检测过程，当发明人拆开检测试剂盒外壳发现实施例1的检测试剂盒的硝酸纤维素前端荧光物质残留较少，而对照组的检测试剂盒残留较多。设计如下实验：
材料：羧基荧光胶球，直径300nm，货号fc02f，购自bangslaboratories,inc.。
肌钙蛋白抗体，货号分别4t21cc和4t21，购自hytest。
方法：
1、按照bangslaboratories,inc.技术指导technote205文件中的相关说明，将10mg4t21cc抗体接到1mlfc02f上，然后用100mmol/ltris缓冲液稀释10倍，编号latex1d备用。
2、将10mllatex1d和0.5ml100mmol/ltris缓冲液混合，然后使用biodot的xyz3060处理平台，将混合物喷到玻璃纤维上，图1中的位置14。
3、使用biodot的xyz3060处理平台，将10mg/ml的4t21的肌钙蛋白抗体喷到图1的位置22a处，该处为硝酸纤维素材质。位置22b不做喷涂。得到对照荧光层析试剂。
检测过程：将60μl心脏病患者血清样本4份分别滴到2个上述对照荧光层析试剂上(对照试剂1a和对照试剂1b)和2个实施例1制备的荧光层析试剂上(实验试剂2a和2b)的位置12，等待6分钟。然后在紫外灯下观察这4个试剂硝酸纤维素前端残留的大小，发现本次制备的试剂残留较多。结果如下：
备注：“+”表示残留强度，“+”越多，表示残留越多。