检测溶液中酪氨酸浓度的方法与流程

本发明涉及酪氨酸浓度检测领域。更具体地说，本发明涉及一种检测溶液中酪氨酸浓度的方法。

背景技术：

酪氨酸(tyrosine,tyr)属于芳香族氧基酸,在体内可由苯丙氨酸经化而来,是人体重要的半必需氨基酸。酪氨酸的代谢斎乱可导致多种遗传性疾病的发生,如酪氨酸血症、尿黑酸症等,而且与肝肾疾病、神经系统变性性疾病、恶性肿瘤等有一定的相关性。酪氨酸是人体不可缺少的一种氨基酸,它是合成神经递质儿茶酚胺的前体,缺乏酪氨酸人体就会出现生长异常,智能低下等现象,因此国内外已普遍开始重视食品中酪氨酸含量的添加。研究发现,酪氨酸及其代谢产物的含量在健康人和遗传性疾病、肝肾疾病以及恶性肿瘤等疾病患者体液中有明显差异。因此,探索酷氨酸及其代谢产物含量的分析新技术并应用于实际样品测定,对某些疾病的诊断、治疗和监测具有十分重要的临床意义。目前，测定酪氨酸的方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、质谱法、核磁共振波谱法和毛细管电泳法等,这些技术虽然应用比较广泛，但使用的仪器昂贵、试剂消耗量大且分析时间较长，不能满足现场快速检测的需求。酪氨酸具有电化学活性,容易被氧化,因此可用电化学方法进行检测。大多数电分析方法具有省时、成本低、选择性好、灵敏度高、响应快、仪器简单等优点。

氨基化还原氧化石墨烯作为一种新型碳材料，引起多个研究领域的广泛关注。与传统的石墨烯相比，氨基化还原氧化石墨烯量子点具有十分优越的物理化学性质，如：较大的比表面积、生物相容性好、电子传递性能好、良好的热稳定性等。这些优越的电学性质使氨基化石墨烯广泛应用于生化分析检测领域，发挥了巨大的应用潜力。但氨基化的石墨烯不容易固定于电极表面，则在修饰电极方面，需要引入具有更好固定氨基化还原氧化石墨烯于电极表面物质的研究。

金纳米棒材料具有比表面积大、光学性能优异、生物兼容性良好、导电性强等特性，能有效提高电子传输速率。金纳米棒棒(aunrs)作为一种一维金纳米棒材料，由于其长径、短径、长径比及分布范围可调，使它具有了不同于普通金纳米棒粒子的光学和电化学性质。通过调节金纳米棒的长径比来调控aunrs的局域表面等离子共振吸收峰，可实现从可见光区调节到近红外区，不但提高对周围的介电常数的敏感度，同时也在生物传感领域的信号放大效果增强。这些优越的电学性质使金纳米棒棒广泛应用于生化分析检测领域，发挥了巨大的应用潜力。

而壳聚糖(cs)是甲壳素脱去部分乙酰基后的产物，是一种重要的天然高分子材料。利用壳聚糖分子中氨基易于质子化的特性,制备复合膜材料。

针对以上问题，我们研究了一种氨基化还原氧化石墨烯/金纳米棒棒/壳聚糖电极检测酪氨酸的新方法，该方法操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行混合样品溶液中酪氨酸的高灵敏识别。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行混合样品溶液中酪氨酸的高灵敏识别。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种检测溶液中酪氨酸浓度的方法，包括以下步骤：

s1、制备氨基化还原氧化石墨烯/金纳米棒/壳聚糖修饰玻碳电极；

s2、以s1制备的氨基化还原氧化石墨烯/金纳米棒/壳聚糖修饰玻碳电极作为工作电极组成三电极体系，在pbs缓冲溶液中加入酪氨酸制成不同浓度酪氨酸的pbs缓冲溶液，将三电极体系浸入其中，测出不同浓度酪氨酸的pbs缓冲溶液的差分脉冲伏安曲线，然后建立酪氨酸浓度与电流强度峰值的差值的关系式，即可根据测量未知浓度的酪氨酸的pbs缓冲溶液的电流强度峰值推导计算出待检测溶液中酪氨酸的浓度。

优选的是，制备氨基化还原氧化石墨烯/金纳米棒/壳聚糖修饰玻碳电极的方法为：

a、将十六烷基三甲基溴化铵与去离子水混合搅拌均匀，再加入氯金酸溶液搅拌，加入nabh4冰水溶液搅拌，静置后得晶种溶液备用；

b、将十六烷基三甲基溴化铵、油酸钠和水混合搅拌均匀，冷却后加入agno3溶液搅拌，加入氯金酸溶液搅拌，直至溶液由亮黄色变为澄清为止，然后依次加入浓盐酸溶液搅拌，加入抗坏血酸溶液搅拌，以及加入晶种溶液搅拌，静置得混合液a备用；

c、取氨基化还原氧化石墨烯置于超纯水中超声，然后滴定于玻碳电极表面进行修饰，得氨基化还原氧化石墨烯修饰玻碳电极；

d、将混合液a与壳聚糖溶液混合，超声处理后，离心处理取沉淀，将沉淀分散于水中并超声处理后得微溶液，取该微溶液滴定于氨基化还原氧化石墨烯修饰玻碳电极表面，得氨基化还原氧化石墨烯/金纳米棒/壳聚糖修饰玻碳电极。

优选的是，s2中三电极体系中的辅助电极是铂丝电极，参比电极是ag/agcl电极。

优选的是，s2中不同浓度酪氨酸的pbs缓冲溶液中酪氨酸浓度依次为0mol/l、1.0×10^-5mol/l、1.5×10^-5mol/l、2.0×10^-5mol/l、2.5×10^-5mol/l、3×10^-5mol/l、4×10^-5mol/l、5×10^-5mol/l、7×10^-5mol/l、1.0×10^-4mol/l、1.5×10^-4mol/l。

优选的是，s2中pbs缓冲溶液的浓度均为0.1mol/l、ph值均为7.4。

优选的是，s2中建立酪氨酸浓度与电流强度峰值的差值的的关系式方法为：利用差分脉冲伏安法，分别测量并记录多份不同浓度的酪氨酸的pbs缓冲溶液的差分脉冲伏安曲线，得到每份含酪氨酸的pbs缓冲溶液的电流强度峰值；其中，以得到的每份含酪氨酸的pbs缓冲溶液的电流强度峰值与不含酪氨酸的pbs缓冲溶液的电流强度峰值的差值作为纵坐标、以每份酪氨酸的浓度为横坐标作标准曲线图，拟合建立酪氨酸浓度与电流强度峰值的差值的线性关系表达式。

优选的是，氨基化还原氧化石墨烯与超纯水中的质量比为1:200，混合液a与质量分数为0.5％的壳聚糖溶液的体积比为1:1。

优选的是，氯金酸溶液浓度均为0.01mol/l，agno3溶液的浓度为5.0mmol/l，抗坏血酸溶液的浓度为0.1mmol/l，浓盐酸溶液为质量分数为37.5％的hcl溶液，壳聚糖溶液为质量分数为0.5％。

优选的是，玻碳电极在进行氨基化还原氧化石墨烯修饰前需进行活化处理：将玻碳电极先浸泡于10℃的质量分数为8％的马来酸溶液中，微波处理3min，取出后用去离水超声清洗3次，然后将清洗干净的玻碳电极浸泡于500ml质量分数为15％的乙醇溶液中，并向乙醇溶液中导入臭氧，导入量为500ml/min，然后取出于通风状态下进行紫外照射20min，照射期间保持温度为28℃，再用超纯水清洗3次，即可完成活化。

优选的是，氨基化还原氧化石墨烯置于超纯水中超声时，向超纯水中加入了占超纯水质量0.1％的姜黄素。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、本发明制备的氨基化还原氧化石墨烯/金纳米棒/壳聚糖修饰玻碳电极具有电子传递速率快、稳定性好、制备简单、操作方便的优点，采用本发明制备的氨基化还原氧化石墨烯/金纳米棒/壳聚糖修饰玻碳电极进行酪氨酸的检测，检测过程简单方便、灵敏度高、检测限低，可实现实际样品中酪氨酸的快速检测；

第二、从差分脉冲伏安曲线中可得知待检测溶液对应的电流强度随酪氨酸的浓度的增加而增强，且电流强度与酪氨酸浓度有良好的线性关系，因此，氨基化还原氧化石墨烯/金纳米棒/壳聚糖修饰玻碳电极可以作为检测酪氨酸的电极，快速并定量检测溶液中酪氨酸的含量，对酪氨酸的检测限可达到4.7×10^-7mol/l；

第三、将玻碳电极先浸泡于马来酸溶液中，再浸泡于乙醇溶液中，并向乙醇溶液中导入臭氧，然后于通风状态下进行紫外照射，大大提高了电极的电化学信号强度，过电位小、电子传输速度快，灵敏度高，促进电子转移、增加电流响应，经过1000次循环使用后仍具有好的电化学稳定性；氨基化还原氧化石墨置于超纯水中超声时加入了姜黄素，使得修饰玻碳电极时电极的稳定性更佳、再现性能更高。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为不同浓度酪氨酸的pbs缓冲溶液的差分脉冲伏安曲线图；

图2为酪氨酸浓度的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

<实施例>

如图1～2所示，一种检测溶液中酪氨酸浓度的方法，包括以下步骤：

s1、制备氨基化还原氧化石墨烯/金纳米棒/壳聚糖修饰玻碳电极：

a、将7.0g十六烷基三甲基溴化铵与18ml去离子水混合搅拌均匀，再加入0.5ml0.01mol/l的氯金酸溶液搅拌5min，加入0.8ml质量体积分数为0.455g/l的nabh4冰水溶液搅拌2min，静置30min后得晶种溶液备用；

b、将7.0g十六烷基三甲基溴化铵、1.234g油酸钠溶于50℃的480ml水中并搅拌30分钟，冷却后在30℃水浴条件下，加入14.4ml5.0mmol/l加入agno3溶液搅拌，然后静置15分钟；加入25.0ml0.01mol/l的氯金酸溶液搅拌，充分搅拌30分钟以上直至溶液由亮黄色变为澄清为止，然后依次加入1.5ml质量分数为37.5％的浓盐酸溶液浓盐酸溶液搅拌15分钟；然后将0.8ml0.1mmol/l的抗坏血酸溶液加入并搅拌1分钟，最后取0.4ml晶种溶液加入，继续搅拌1分钟后放置过夜，静置得混合液a备用；

c、取5mg氨基化还原氧化石墨烯置于1ml超纯水中超声30min，取5μl滴定于玻碳电极表面，然后在室温下晾干，得氨基化还原氧化石墨烯修饰玻碳电极；

d、取1ml混合液a与1ml质量分数为0.5％的壳聚糖溶液混合，超声混匀，在转速为5000rpm下离心10min，离心2次，取沉淀，将沉淀分散于水中并超声处理后得微溶液，取5μl微溶液滴定于所述氨基化还原氧化石墨烯修饰玻碳电极表面，然后在室温下中晾干，得氨基化还原氧化石墨烯/金纳米棒/壳聚糖修饰玻碳电极。

s2、以s1制备的氨基化还原氧化石墨烯/金纳米棒/壳聚糖修饰玻碳电极作为工作电极组成三电极体系，在pbs缓冲溶液中加入酪氨酸制成不同浓度酪氨酸的pbs缓冲溶液，将三电极体系浸入其中，测出不同浓度酪氨酸的pbs缓冲溶液的差分脉冲伏安曲线，然后建立酪氨酸浓度与电流强度峰值的差值的关系式，即可根据测量未知浓度的酪氨酸的pbs缓冲溶液的电流强度峰值推导计算出待检测溶液中酪氨酸的浓度；

其中，s2中三电极体系中的辅助电极是铂丝电极，参比电极是ag/agcl电极；s2中不同浓度酪氨酸的pbs缓冲溶液中酪氨酸浓度依次为0mol/l、1.0×10^-5mol/l、1.5×10^-5mol/l、2.0×10^-5mol/l、2.5×10^-5mol/l、3×10^-5mol/l、4×10^-5mol/l、5×10^-5mol/l、7×10^-5mol/l、1.0×10^-4mol/l、1.5×10^-4mol/l；s2中pbs缓冲溶液的浓度均为0.1mol/l、ph值均为7.4；

利用差分脉冲伏安法，分别测量并记录多份不同浓度的酪氨酸的pbs缓冲溶液的差分脉冲伏安曲线，得到每份含酪氨酸的pbs缓冲溶液的电流强度峰值；其中，以得到的每份含酪氨酸的pbs缓冲溶液的电流强度峰值与不含酪氨酸的pbs缓冲溶液的电流强度峰值的差值作为纵坐标、以每份酪氨酸的浓度为横坐标作标准曲线图，拟合建立酪氨酸浓度与电流强度峰值的差值的线性关系表达式；其中，差分脉冲伏安法具体参数设置为：设定初始电位为0.4v，终止电位为1.0v，然后设置如下脉冲参数：电位增量为0.004v，方波频率为50hz，方波幅度为0.05v，等待时间为2s；如图1为差分脉冲伏安曲线，自上而下依次为酪氨酸浓度0mol/l、1.0×10^-5mol/l、1.5×10^-5mol/l、2.0×10^-5mol/l、2.5×10^-5mol/l、3×10^-5mol/l、4×10^-5mol/l、5×10^-5mol/l、7×10^-5mol/l、1.0×10^-4mol/l、1.5×10^-4mol/l的不同浓度酪氨酸的pbs缓冲溶液的差分脉冲伏安曲线，用酪氨酸浓度为1.0×10^-5mol/l、1.5×10^-5mol/l、2.0×10^-5mol/l、2.5×10^-5mol/l、3×10^-5mol/l、4×10^-5mol/l、5×10^-5mol/l、7×10^-5mol/l、1.0×10^-4mol/l、1.5×10^-4mol/l的不同浓度酪氨酸的pbs缓冲溶液的电流强度峰值分别减去0mol/l的酪氨酸的pbs缓冲溶液的电流强度峰值，得到10个电流强度峰值的差值，从图1可知待测溶液对应的电流强度峰值随酪氨酸的浓度的增加而增强；图2为酪氨酸的标准曲线图，图中纵轴为电流强度峰值的差值，单位为μa，横轴为酪氨酸的浓度，单位为μm，电流强度峰值的差值与酪氨酸浓度有良好的线性关系：y＝-0.3433-0.01401x，r²＝0.9964；取某未知浓度的酪氨酸溶液，加入ph值为7.4的0.1mol/l的pbs缓冲溶液中，然后对未知酪氨酸浓度的pbs缓冲溶液进行差分脉冲伏安法测定，得到其电流强度峰值，再减去0mol/l的酪氨酸的pbs缓冲溶液的电流强度峰值，得到电流强度峰值的差值，然后带入关系式中，计算后即可推导出未知浓度的酪氨酸溶液中酪氨酸的浓度。

在另一种技术方案中，玻碳电极在进行氨基化还原氧化石墨烯修饰前需进行活化处理：将玻碳电极先浸泡于10℃的质量分数为8％的马来酸溶液中，微波处理3min，取出后用去离水超声清洗3次，然后将清洗干净的玻碳电极浸泡于500ml质量分数为15％的乙醇溶液中，并向乙醇溶液中导入臭氧，导入量为500ml/min，然后取出于通风状态下进行紫外照射20min，照射期间保持温度为28℃，再用超纯水清洗3次，即可完成活化；

在另一种技术方案中，氨基化还原氧化石墨烯置于超纯水中超声时，向超纯水中加入了占超纯水质量0.1％的姜黄素。

<对比例>

一种已经公开的高效液相色谱/紫外法测定血标本液中酪氨酸的浓度的方法，检测限为1.0×10^-6mol/l。

而实施例的检测限可达到4.7×10^-7mol/l，同时，相比于对比例1的方法，实施例的方法操作起来更为简便、快捷，受到外界环境的影响更小。这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。