溶液的搅拌方法
【专利摘要】本发明提供一种促进被固定化于分析用芯片的选择结合性物质与被检物质的选择性结合反应，特别是能够以短时间进行被检物质的分析的手段。本发明为在分析用芯片的凹部注入包含被检物质的溶液时，在凹部的空间以残留该空间的一部分的方式注入，施加1×g以上的离心加速度使分析用芯片回转旋转，将被检物质溶液进行搅拌的方法。
【专利说明】溶液的搅拌方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及包含被检物质的溶液的搅拌方法，对使包含被检物质的溶液与被固定化于基板上的与被检物质选择性结合的物质(本说明书中称为“选择结合性物质”。)接触来进行反应时的溶液进行搅拌的方法。
【背景技术】
[0002]分析用芯片具有固定化有作为与被检物质选择性结合的物质的选择结合性物质(核酸、蛋白质、脂质、糖等)的基板，使该基板上的选择结合性物质与被检物质通常在溶液中进行杂交反应，由其反应结果来用于分析被检物质中包含的物质的存在有无、状态或量等。作为该基板，一般使用玻璃制、金属制、树脂制的基板。
[0003]作为分析用芯片的一方式，以例如数十?数万这样的大量基因表达的同时测定作为目的，有在基板上高密度地配置DNA、蛋白质、糖链等分子的被称为微阵列的方式。通过使用微阵列，从而能够基于核酸/核酸间杂交反应进行核酸的检测、定量，基于蛋白质/蛋白质间、糖链/糖链间或糖链/蛋白质间的特异性反应进行蛋白质、糖链的检测、定量，可以进行例如各种疾病动物模型、细胞生物学现象中的体系并且穷尽基因表达解析。具体而言，能够使基因的功能，即基因编码的蛋白质清楚，并且特定蛋白质表达的时期、作用的场所。通过利用微阵列来解析生物的细胞或组织水平的基因表达的变化，与生理学的、细胞生物学的、生物化学的事实现象数据组合来构建基因表达图谱数据库，从而能够探索疾病基因、治疗相关基因的检索、治疗方法。
[0004]在分析用芯片中，DNA微阵列(DNA芯片)基于核酸/核酸间杂交反应来用于核酸的检测、定量等。作为DNA芯片，例如，使用在玻璃制的平面基板上，高密度地排列固定化有大量的DNA片段的DNA芯片。DNA芯片通过例如，使研究对象细胞的表达基因等用荧光色素等标记了的样品在平面基板上进行杂交，使互相互补的核酸(DNA或RNA)彼此结合，用高析像度检测装置(扫描仪)高速地读取该处的荧光的方法；基于电化学反应来检测电流值等的应答的方法，从而用于检测样品中的各基因或测定其量。此外，DNA芯片不仅在利用表达基因的检测、定量进行基因表达解析，而且在基因的单碱基置换(SNP)的检测等应用领域中也大受:期待。
[0005]此外，分析用芯片不仅作为DNA等核酸，而且作为蛋白质、糖类等的检查、解析手段也被利用。特别是，在蛋白质分析用芯片中，抗体、抗原、酶底物等蛋白质被固定化于基板上。
[0006]在专利文献I中，记载了使具有凹凸结构的分析用芯片旋转，使分析用芯片中的微粒或气泡移动来搅拌包含被检物质的溶液的方法，公开了使微粒或气泡以不使微粒或气泡接触固定化有选择结合性物质的面的方式移动，即使是微量的被检物质，也以良好的S/N比获得强荧光信号的方法。
[0007]在专利文献2中，公开了使具有凹凸结构的分析用芯片在大致水平方向上旋转，进行被检物质与选择结合性物质的选择性反应时，可以通过使用微粒将被检物质溶液进行搅拌，从而简便并且稳定地进行的方法。
[0008]在专利文献3中，公开了通过使装入有试样溶液和微粒的容器旋转，使微粒在重力方向上落下，从而将容器内的试样溶液进行搅拌的杂交方法和装置。
[0009]在专利文献4中，公开了通过在配置有微阵列的专用的杂交用室中，以残留空间的一部分的方式注入杂交溶液，使室旋转，从而室内溶液的空间的位置变化，将溶液进行搅拌的杂交方法。
[0010]在专利文献5中，公开了一边使设置于转台的微阵列公转一边使其自身也旋转，从而将试样溶液进行搅拌的自转公转方式的杂交装置。
[0011]现有技术文献
[0012]专利文献
[0013]专利文献1:国际公开第2005/090997号
[0014]专利文献2:日本特开2007-285828号公报
[0015]专利文献3:日本特开2003-339375号公报
[0016]专利文献4:日本特许第4473007号公报
[0017]专利文献5:美国专利第6309875号
【发明内容】
[0018]发明所要解决的课题
[0019]在专利文献I所记载的溶液的搅拌方法中，以例如3rpm这样的比较低的转速使分析用芯片旋转，但在该情况下杂交反应需要10小时，不是适于被检物质的迅速的检测的方法。此外，在专利文献2所记载的被检物质溶液的搅拌方法中，由于杂交反应需要16小时，因此与专利文献I的方法同样，也不是可以适用于被检物质的迅速的检测的方法。此外，专利文献3所公开的方法中，虽然以杂交的时间缩短作为效果而博得好评，但实际上杂交反应需要6小时，适用于要求迅速的诊断的分析是困难的。进一步，专利文献4所公开的杂交方法通过使室旋转，与静置下进行反应的情况下相比，CV值改善了，但信号强度几乎没有变化，不是使反应的进行加速的方法。专利文献5所记载的装置为能够用少量的检体溶液进行微阵列的搅拌的装置，但对于杂交所需要的时间、其时间缩短没有提及，是否可以适应于迅速诊断不清楚。
[0020]这些专利文献I?5所记载的溶液的搅拌方法都是以提高杂交反应的效率来使检测灵敏度提高为目的，但实际上杂交反应需要6小时?20小时，不能说是用于显著地提高使用了分析用芯片的被检物质的检测或定量的速度的技术。因此，在使用分析用芯片进行的被检物质的分析中，在要求数分钟?最多2小时以内这样的短时间的检测或定量的分析，例如流行性感冒等传染病、败血症等的检查、诊断用途中，用于以能够满足其要求那样的速度进行分析的被检物质溶液的搅拌方法迄今为止还不存在。
[0021]本发明为了解决上述课题，其目的在于提供促进被固定化于分析用芯片的选择结合性物质与被检物质的选择性结合反应(杂交反应)的进行，特别是能够以短时间进行被检物质的分析的手段。
[0022]用于解决课题的方法
[0023]为了解决上述课题，本发明人等对于在使用分析用芯片的被检物质的分析中，可以促进被检物质与被固定化了的选择结合性物质的反应的包含被检物质的溶液的搅拌方法进行了深入研究，结果发现，通过在分析用芯片的凹部以残留凹部空间的一部分的方式注入包含被检物质的溶液，施加IXg以上的离心加速度使其回转旋转，将溶液进行搅拌，从而能够以短时间实现稳定的选择性结合反应，从而达成本发明。
[0024]SP，本发明由以下(I)?(7)构成。
[0025](I) 一种溶液的搅拌方法，是被注入到分析用芯片中的包含被检物质的溶液的搅拌方法，该分析用芯片具有注入该包含被检物质的溶液的凹部，在该凹部的全部底面表面或一部分底面表面固定化与该被检物质选择性结合的选择结合性物质，在分析用芯片的凹部的空间以残留该空间的一部分的方式注入该包含被检物质的溶液，对注入有该包含被检物质的溶液的分析用芯片施加IXg以上的离心加速度使其回转旋转。
[0026](2)根据(I)所述的溶液的搅拌方法，使注入有该包含被检物质的溶液的分析用芯片以0.1mm以上20mm以下的旋转半径进行回转旋转。
[0027](3)根据⑴或⑵所述的溶液的搅拌方法，在上述凹部以残留10%以上70%以下的空间的方式注入上述包含被检物质的溶液。
[0028](4)根据(I)?(3)的任一项所述的溶液的搅拌方法，上述分析用芯片具有彼此被壁面隔开了的注入包含被检物质的溶液的多个凹部。
[0029](5)根据⑴?(4)的任一项所述的溶液的搅拌方法，在上述分析用芯片上安装覆盖整个上述凹部的盖，从而将上述包含被检物质的溶液密闭在该凹部内。
[0030](6)根据(I)?(5)的任一项所述的溶液的搅拌方法，注入有上述包含被检物质的溶液的分析用芯片，以上述凹部的底面成为水平或大致水平的方式设置而在水平或大致水平的方向上回转旋转。
[0031](7) 一种被检物质的分析方法，通过(I)?(6)的任一项所述的溶液的搅拌方法使被检物质与被固定化于分析用芯片的选择结合性物质结合，检测与选择结合性物质结合的该被检物质。
[0032]发明的效果
[0033]根据本发明的被检物质溶液的搅拌方法，可以有效地促进被检物质与被固定化于分析用芯片的选择结合性物质的选择性反应，使选择结合性物质与被检物质接近的机会显著地增大。因此，能够使用分析用芯片以短时间检测或定量被检物质溶液所包含的被检物质。
[0034]此外，根据本发明的被检物质溶液的搅拌方法，即使在使用具有多个注入包含被检物质的溶液的凹部的分析用芯片的情况下，也可以在相同条件下搅拌各凹部内的溶液，因此可以在相同条件下进行各凹部中的选择结合性物质与被检物质的反应，可以抑制凹部间的反应偏差的发生。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为显示本发明的分析用芯片的一例的图。(a)凹部为I个的分析用芯片的一例，(b)具有多个凹部的分析用芯片的一例，(c)凹部的截面图。
[0036]图2为显示本发明的分析用芯片的一例的图。(a)凹部为I个的分析用芯片的一例，(b)具有多个凹部的分析用芯片的一例，(c)凹部的截面图。
[0037]图3为显示本发明的分析用芯片的一例的图。(a)凹部为I个的分析用芯片的一例，(b)具有多个凹部的分析用芯片的一例，(C)凹部的截面图。
[0038]图4为显示安装有盖的本发明的分析用芯片的一例的图。(a)凹部为I个的分析用芯片的一例，(b)具有多个凹部的分析用芯片的一例，(C)凹部的截面图。
[0039]图5为显示本发明的分析用芯片的凹部的底面的优选形状的一例的俯视图。(a)六边形，(b)角进行了 R加工的四边形，(c)椭圆形。
[0040]图6为显示在本发明的分析用芯片中注入包含被检物质的溶液时的一方式的分析用芯片的截面图。
[0041]图7为例示本发明的回转旋转的图。
[0042]图8为例示包含公转的旋转方式的图。
[0043]图9为表示实施例1?4、比较例I?3中的反应时间与信号强度的关系的图。
[0044]图10为图9的图中将反应时间为I小时之前的部分放大了的图。
【具体实施方式】
[0045]在本发明中，所谓分析用芯片，是指将包含被检物质的溶液(以下有时称为“被检物质溶液”。)注入至该芯片中，用于测定被检物质的存在的有无、被检物质的量、被检物质的性状等的芯片。具体而言，可举出通过被固定化于载体表面的选择结合性物质与被检物质的反应，来测定被检物质的量、有无的生物芯片。更具体而言，可举出将核酸固定化于载体表面的DNA芯片，将以抗体为代表的蛋白质固定化于载体表面的蛋白质芯片，将糖链固定化于载体表面的糖链芯片，和将细胞固定化于载体表面的细胞芯片等。
[0046]本发明所使用的分析用芯片中，形成有注入包含被检物质的溶液的凹部。凹部形成由壁面和底面构成的空间,在凹部的全部底面表面或一部分底面表面固定化有选择结合性物质。
[0047]以下，使用图1?6来说明本发明所使用的分析用芯片的例子。
[0048]图1中，例示了由平板的基板1(例如，载玻片)、具有贯通孔的板材2构成的分析用芯片。基板I与具有贯通孔的板材2接合，形成了由凹部的壁面3和凹部的壁面4构成的凹部6 (或凹部的空间)。(a)是凹部6为I个的情况的一例，(b)是具有多个凹部6的情况的一例，(c)显不各凹部的截面。选择结合性物质被固定化于基板I的表面(上表面)的一部分，但关于其固定化表面，由于基板I与板材2接合，因此凹部6的底面3的一部分成为选择结合性物质的固定化表面5。
[0049]在图1所例示那样的由固定化选择结合性物质的平板的基板、与具有用于形成凹部的贯通孔的板材构成的分析用芯片中，该平板基板和板材的材质没有特别限定，可以适合使用例如，玻璃、陶瓷、硅等无机材料、聚对苯二甲酸乙二醇酯、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、硅橡胶等高分子材料。平板基板与板材的接合方法没有特别限定，可以使用粘接剂而以实质上不能装卸的状态粘接，可以为介由双面带、树脂组合物等的粘接层而以能够装卸的状态粘接。此外，分析用芯片每I片的凹部的数目可以根据分析的目的进行设定，可以为I个也可以为多个。
[0050]图2和图3中，例示了不使用图1所例示的具有贯通孔的板材,通过例如注射成型，在基板I上形成有凹部6的分析用芯片。形成于基板I的凹部6具有由底面3和壁面4构成的空间，凹部的底面3的一部分成为选择结合性物质的固定化表面5。(a)是凹部为I个的情况的一例，(b)是具有多个凹部的情况的一例，(c)显示凹部的截面的一例。分析用芯片每I片的凹部的数目可以根据分析目的选择任意的数目。
[0051]在图2和图3所例示的分析用芯片中，基板的材质可以使用与上述图1中例示的分析用芯片中的基板同样的材质。
[0052]本发明的溶液的搅拌方法中使用的分析用芯片的凹部的深度没有特别限定，优选为0.1?1mm,更优选为0.5?5mm。图2是凹部6的深度浅的类型的分析用芯片的例子，图3是凹部6的深度深的类型的分析用芯片的例子。
[0053]在使注入有被检物质溶液的分析用芯片进行回转旋转时，使用图3那样的凹部深的分析用芯片的情况下，还能够不对分析用芯片加盖而使其直接回转旋转。另一方面，在使用图2那样的凹部浅的分析用芯片的情况下，优选安装覆盖整个凹部的盖而被检物质溶液密闭于凹部中。优选根据使分析用芯片回转旋转的条件(离心加速度、转速、旋转半径)，例如，在凹部的深度为5mm以下的情况下，安装盖。
[0054]图4所例示的分析用芯片为覆盖整个凹部6的盖7被安装于分析用芯片而被检物质溶液密闭于凹部6的分析用芯片的例子。具体而言，是在图2或图3所示的分析用芯片中安装有平板状的盖7而得。(a)是凹部为I个的情况的一例，(b)是具有多个凹部的情况的一例，(c)是显示凹部的截面。在该例子中，盖7具备用于将被检物质溶液注入至凹部的注入孔8。
[0055]作为盖，可以使用树脂制、橡胶制、玻璃制等的平板、粘着性带等密封材料。通过在盖上设置用于将被检物质溶液注入至凹部的注入孔，从而可以在将被检物质溶液注入至凹部后安装盖。在该情况下，优选注入孔有多个，例如可以每个凹部设置2?4个。另一方面，在被检物质溶液的注入后安装盖的情况下，可以在盖上设置注入孔也可以不设置，可以适合使用例如用粘着性带堵塞开放部来进行密闭的方法；使固定有符合开放部形状的O形环的板材密合来进行密闭的方法；用粘土样的物质在开放部加盖来进行密闭的方法等。
[0056]在杂交反应时，需要防止被检物质溶液的蒸发，或将反应温度严密地保持一定的情况下，优选将分析用芯片的凹部的空间密闭，在该情况下，优选在分析用芯片安装盖来使用。
[0057]本发明的溶液的搅拌方法中使用的分析用芯片的凹部的底面的形状，优选为在使分析用芯片回转旋转时，在没有被被检物质溶液填充的凹部，残留的空间(或气泡)易于移动的形状。例如，如图5所示，优选使用凹部的底面的形状为六边形(a)、四边形(b)、椭圆形(C)的分析用芯片，因为凹部所残留的空间(或气泡)9易于移动。此外，在凹部的底面的形状为多边形的情况下，角进行了 R加工(例如，图5的(b))也优选，因为在没有被被检溶液填充的凹部残留的空间(或气泡)易于移动。
[0058]图6为显示在安装有盖的分析用芯片中注入包含被检物质的溶液时的一方式的分析用芯片凹部附近的截面图。显示在分析用芯片的凹部的空间6中注入包含被检物质的溶液，形成没有被溶液填充的空间(或气泡)9，安装有盖7的状态。通过以图6的状态回转旋转分析用芯片，从而可以将被检物质溶液进行搅拌，进行杂交反应。
[0059]本发明中的所谓选择结合性物质，是指可以与被检物质直接或间接地选择性结合的各种物质。作为可结合于载体表面的选择结合性物质的代表例，可举出核酸、蛋白质、肽、糖类、脂质。
[0060]作为核酸，可举出DNA、RNA，可以为PNA、LNA。作为DNA，可以使用染色体DNA、病毒DNA、细菌、霉菌等的DNAjf RNA反转录而得的cDNA、作为它们的一部分的片段等，但不限定于这些。此外，作为RNA，可以使用信使RNA、核糖体RNA、small RNA、micro RNA、作为它们的一部分的片段等，但不限定于这些。此外，还包含化学合成的DNA或RNA等。具有特定碱基序列的单链核酸与具有与该碱基序列或其一部分互补的碱基序列的单链核酸进行选择性杂交而结合，因此相当于本发明中所谓选择结合性物质。核酸可以为来源于活细胞等天然物的核酸，可以通过核酸合成装置合成的核酸。关于来自活细胞的DNA或RNA的调制，可以通过公知的方法来进行,例如对于DNA的提取，利用Blin等人的方法(Blin et al.，Nucleic Acids Res.3:2303 (1976))等进行，此外，对于RNA的提取,可以利用Favaloro等人的方法(Favaloro et al., Methods Enzymol.65:718(1980))等进行。作为被固定化的核酸，还可以使用链状或环状的质粒DNA、染色体DNA、将它们通过限制性酶或化学地切断了的DNA片段、在试管内通过酶等合成出的DNA、或化学合成出的寡核苷酸等。
[0061]作为蛋白质，可举出抗体和Fab片段、F(ab’)2片段那样的、抗体的抗原结合性片段、以及各种抗原。抗体、其抗原结合性片段与对应的抗原选择性结合，抗原与对应的抗体选择性结合，因此相当于“选择结合性物质”。
[0062]作为糖类，可举出各种单糖、寡糖、多糖等糖链。
[0063]作为脂质，除了单纯脂质以外，可以为复合脂质。
[0064]此外，还可以将上述核酸、蛋白质、糖类、脂质以外的具有抗原性的物质进行固定化。此外，作为选择结合性物质，可以在载体的表面将细胞进行固定化。
[0065]作为这些选择结合性物质中特别优选的物质，可举出DNA、RNA、蛋白质、肽、糖、糖链、脂质。
[0066]作为本发明所使用的被检物质，可举出要测定的核酸(靶核酸)，例如，病原菌、病毒等的基因、遗传病的致病基因等以及其一部分，具有抗原性的各种生物体成分，针对病原菌、病毒等的抗体等，但不限定于这些。
[0067]在本发明的溶液的搅拌方法中，作为包含这些被检物质的溶液，可以使用血液、血清、血浆、尿、便、髓液、唾液、各种组织液等体液、各种饮食物以及它们的稀释物等，但不限定于这些。这里，包含被检物质的溶液的粘度只要是在施加离心加速度使分析芯片回转旋转时，没有被被检物质溶液填充的分析芯片的凹部的空间能够移动，则没有特别限定。
[0068]成为被检物质的核酸可以对由血液、细胞通过常规方法提取的核酸进行标记；可以为将该核酸作为模板，通过PCR等核酸扩增法而扩增了的核酸。在后者的情况下，能够使进行本发明的搅拌方法之后的测定灵敏度大幅度提高。在将核酸扩增产物作为被检物质的情况下，通过在被荧光物质等标记了的核苷三磷酸的存在下进行扩增，从而能够标记扩增核酸。此外，在被检物质为抗原或抗体的情况下，可以将作为被检物质的抗原、抗体通过常规方法直接标记，还可以使作为被检物质的抗原或抗体与选择结合性物质结合之后，将载体进行洗涤，使与该抗原或抗体进行抗原抗体反应的标记了的抗体或抗原进行反应，测定结合于载体的标记。此外，在将没有被扩增的核酸作为被检物质的情况下，例如通过碱性磷酸酶来除去核酸的5’末端的磷酸基，使标记有荧光物质的被检物质与选择结合性物质进行反应，测定结合了的标记的方法；通过选择结合性物质(捕捉探针)捕捉被检物质之后，使被检物质与被荧光物质等标记了的检测探针进行结合，测定检测探针的标记的方法(夹心杂交法)是适合使用的。
[0069]本发明的溶液的搅拌方法中，使上述那样的实施了标记、扩增等的被检物质溶解于水溶液、适当的缓冲液等来制成包含被检物质的溶液(被检物质溶液)。
[0070]在本发明的溶液的搅拌方法中，被检物质溶液向分析用芯片的凹部的空间的注入以残留凹部的空间的一部分的方式进行，在凹部形成了没有被被检物质溶液填充的空间。通过不使凹部的空间被被检物质溶液完全填充而形成没有被被检物质溶液填充的空间，从而可以通过分析用芯片的回转旋转而空间在凹部内移动，将被检物质溶液进行搅拌。在分析用芯片被回转旋转时，凹部所形成的空间可以在凹部内以单一的空间方式存在，也可以划分成多个空间，即成为多个气泡而存在。
[0071]没有被被检物质溶液填充的空间在凹部的空间中所占的比例，其下限优选为10%以上，更优选为20%以上，上限优选为90%以下，更优选为80%以下，进一步优选为70%以下。没有被被检物质溶液填充的空间的比例的范围优选为10%以上90%以下，更优选为15%以上80%以下。进一步优选为20%以上70%以下。如果该空间的比例少于5%，则在分析用芯片回转旋转时，凹部的空间中的被检物质溶液的移动变得不充分，有可能实质上被检物质溶液没有被搅拌，此外如果多于90%，则包含被检物质的溶液与固定化有选择结合性物质的区域接触的机会减少而导致反应的进行降低。此外，在不对图3那样的凹部深的分析用芯片安装盖而使其进行回转旋转的情况下，没有被被检物质溶液填充的空间的比例优选为例如30%以上90%以下，更优选为40%以上80%以下。
[0072]本发明的溶液的搅拌方法中，通过使注入有包含被检物质的溶液的分析用芯片进行回转旋转来进行溶液的搅拌。这里，所谓回转旋转，是指分析用芯片自身通过圆周运动或椭圆运动来绕旋转轴周围旋转。详细地说，本发明的回转旋转是指在分析用芯片上的任意一点，都以进行具有各固有的旋转中心的相同半径圆周运动那样进行的旋转方式。图7显示本发明的回转旋转的一例。关于分析用芯片10上的任意的点A、B，点A为在将OA作为中心的半径r的圆轨道上以规定转速进行旋转，点B也同样地，在将OB作为中心的半径r的圆轨道上以规定转速进行旋转。此时，连结分析用芯片10上的任意的点A、B的直线AB在圆周运动的任意的轨道上总是平行。例如，在图7中，分析用芯片10位于位置P1、位置P2、位置P3、位置P4的任一位置的情况下，直线AB平行。另一方面，在公转旋转、自转公转旋转这样的包含公转的旋转方式的情况下，如图8所示，从公转的中心O直至分析用芯片10上的任意的点A、点B的距离(ra、rb)分别不同。即，包含公转的旋转方式为根据分析用芯片上的位置不同而圆周运动的旋转半径不同的旋转方式。
[0073]在使分析用芯片进行回转旋转时，分析用芯片优选以固定化有该选择结合性物质的面与旋转面成为平行或大致平行的方式被设置。
[0074]在使用具有多个注入包含被检物质的溶液的凹部的分析用芯片的情况下，通过进行回转旋转，从而可以将各凹部内的溶液在相同条件下进行搅拌，由此可以使各凹部中的选择结合性物质与被检物质的反应在相同条件下进行，可以降低凹部间的反应偏差，因此优选。另一方面，在通过一边使分析用芯片公转一边使自身旋转的自转公转方式、旋转中心位于分析用芯片的外侧的公转方式进行搅拌的情况下，有可能多个凹部在各自不同的条件下被搅拌，凹部间产生反应偏差。
[0075]使分析用芯片回转旋转时的旋转面的方向没有特别限定，可以使用例如水平或大致水平方向、从水平方向倾斜了 15度的方向、从水平方向倾斜了 30度的方向、从水平方向倾斜了 45度的方向、从水平方向倾斜了 60度的方向、从水平方向倾斜了 75度的方向、垂直或大致垂直方向等。优选的旋转面的方向为水平或大致水平方向。这里，所谓大致水平方向，是指与分析用芯片的固定化有选择性结合物质的面接近于水平的方向，优选为例如以水平面作为基准而以O度?3度的范围倾斜了的方向。此外，所谓大致垂直方向，是指与分析用芯片的固定化有选择结合性物质的面接近于垂直的方向，优选为例如以垂直面作为基准而以O度?3度的范围倾斜了的方向。
[0076]在本发明中，关于分析用芯片的回转旋转，可以将转速设为恒定，也可以使转速变化，此外可以在回转旋转中停止一定时间等间歇地进行。此外，旋转方向没有特别限定，可以为顺时针旋转也可以为逆时针旋转，可以为它们的组合。
[0077]反应时进行回转旋转的时间没有特别限定，可以在对于选择结合性物质与被检物质进行反应而言充分的范围内适当决定。例如，在被检物质为核酸的情况下，可以根据与作为选择结合性物质的探针核酸的杂交反应所需要的时间进行设定。本发明的溶液的搅拌方法具有如下特征，通过在回转旋转时施加IXg以上的离心加速度，从而有效地促进被检物质与选择结合性物质的选择性反应，能够以短时间检测或定量被检物质。在有效利用该特征，特别是在检查、诊断用途中使用分析用芯片的情况下等，要求迅速的检测或定量的情况下，优选回转旋转的时间为短时间。例如，在核酸的杂交的情况下，反应时间优选为3小时以上4小时以内，更优选为2小时以内，进一步优选为I小时以内，特别优选为0.5小时以内。
[0078]一般而言，所谓离心加速度，是指在进行旋转运动的体系中，将对物体施加的离心力的大小以加速度的形式表示，其与旋转中心的距离的绝对值和旋转运动的角速度的平方成比例。本发明中的离心加速度是指离心力、即相对离心加速度(Ralative CentrifugeForce ；RCF)，采用以下的式I算出。
[0079]RCF = 1118XRXN2X1(T8..?(式 I)
[0080]RCF:相对离心加速度(Xg)
[0081]R:旋转半径(cm)
[0082]N:转速(rpm)。
[0083]本发明的溶液的搅拌方法中，在使分析用芯片回转旋转时施加IXg以上的离心加速度。离心加速度的下限优选为5Xg以上，更优选为1Xg以上。离心加速度的上限没有特别限定，优选为50Xg以下，更优选为40Xg以下，进一步优选为30Xg以下。离心加速度的范围优选为IXg以上50Xg以下，更优选为5Xg以上40Xg以下，进一步优选为1Xg以上30Xg以下。
[0084]本发明的溶液的搅拌方法中，通过适当设定使分析用芯片回转旋转时的转速与旋转半径，从而可以施加目标的离心加速度。因此，可以根据对分析用芯片进行搅拌的搅拌装置的规格选择转速和旋转半径来进行。例如，在旋转半径小的情况下，通过加大旋转速度，可以施加大的离心加速度。
[0085]旋转半径可以通过与转速的组合而适当选择可获得所期望的离心加速度的值。旋转半径的下限优选为0.1mm以上，更优选为0.2mm以上，进一步优选为0.3mm以上。此外，旋转半径的上限优选为20mm以下，更优选为1mm以下，进一步优选为5mm以下。作为旋转半径的范围，优选为0.1?20mm,更优选为0.2?1mm,进一步优选为0.3?5mm。如果旋转半径大于20mm,则有离心力起支配作用，没有被被检物质溶液填充的空间向凹部的外周挤压的倾向，有时产生搅拌效率的降低、凹部内的搅拌不均匀。另一方面，如果旋转半径小于0.1_，则有在旋转方向上作用的力起支配作用，没有被被检物质溶液填充的空间残留在凹部的中心部的倾向，有时产生搅拌效率的降低、搅拌不均匀。
[0086]此外，回转旋转的转速可以通过与旋转半径的组合而适当选择可获得所期望的离心加速度的值，优选为500rpm以上1000rpm以下，更优选为750rpm以上8000rpm以下。旋转半径小时，可以将反应装置、搅拌装置小型化，可以紧凑地制作实现本发明的溶液的搅拌方法的装置，因此优选。
[0087]此外，在不对分析用芯片安装盖而使其进行回转旋转的情况下，为了使被注入了的被检物质溶液不溢出，因此旋转半径小的搅拌装置适合使用。例如，旋转半径优选为0.1mm以上5_以下，更优选为0.2mm以上4mm以下,进一步优选为0.3mm以上3_以下。
[0088]在本发明中使用的对分析用芯片进行搅拌的搅拌装置只要能够以回转旋转的转速与旋转半径的组合而施加IXg以上的离心加速度，就没有特别限定。对于市售品，可以适合使用板振荡器，可举出例如 “B1Shake5000elm”、“B1Shake 3000-T elm”、“B1Shake3000 elm” (以上，Q Instruments 社制)、“ ? 7 '> 工一夕”、“ r > 工一夕”、“ r > 工一夕 1536” (以上，Thermo Scientific 制)、“MS3 <— '> 'y ” ”、“MS3 r -7' 夕卟”、“VXR basicVibrax(注册商标)、“ VORTEX 3，，(以上，IKA 社制)、“ ι 4 々 口:一卜->工一力一N-704” (日伸理化制)、“ 7。> 一卜 '> 工一力一 KM-M01”(力'7' '乂夕义制)、“ 7。> 一卜务今寸一 P-10”(十慈7 ^ 一力卜''制)等。在安装于自动化装置的情况下，优选为可以从外部控制回转旋转的转速、驱动时间等的装置。
[0089]在本发明中，可以在凹部内侧的空间添加搅拌子。作为搅拌子，可举出微粒(珠)、微棒等，特别优选为微粒。微粒、微棒的形状只要能够在分析用芯片的凹部内移动而将包含被检物质的溶液进行搅拌，就没有特别限定。在微粒的情况下，除了球状以外，可以为多边形，此外在微棒的情况下，可以成为圆筒形、棱柱形等任意的形状，优选为球状。此外，微粒的尺寸也没有特别限定，例如在球状的微粒的情况下，可以成为直径0.1 μπι以上1000 μ m以下的范围，如果考虑到搅拌效率，则更优选为直径50 μ m以上500 μ m以下的范围。在微棒的情况下，可以成为优选为长度50 μ m以上5000 μ m以下,底面直径10 μ m以上300 μ m以下的范围。关于微粒、微棒，从搅拌效率等方面出发，还可以选择I种使用，除此以外可以2种以上组合使用。
[0090]上述微粒、微棒的材质也没有特别限定，可以使用玻璃、陶瓷(例如钇部分稳定化氧化锆)、金属(例如金、钼、不锈钢)、塑料(例如尼龙、聚苯乙烯)等。
[0091]本发明中使用的分析用芯片可以在凹部，在其上部表面具有用于将选择结合性物质进行固定化的凸部。通过将具有这样的结构的分析用芯片用于被检物质的分析，在信号检测时，使扫描仪的焦点与在固定化有选择结合性物质的凸部上面一致，从而可以大幅度降低检测噪声，可以提高S/N比。此外，本发明中使用的分析用芯片优选由可以降低自身荧光的材料来制造，优选为例如固定化选择结合性物质的凸部中至少其一部分为黑色。
[0092]在本发明中，作为表示信号检测灵敏度的指标，可以使用S/N比(信号对噪声比)。在该情况下，优选将S/N = 2作为检测限度来判断灵敏度。一般而言，采用S/N比成为2?3的被检物质浓度或量作为检测限度，如果S/N为2以上，则可以判断为进行了具有检测限度以上的可靠性的检测。(例如，丹羽诚著，“ 二札々^ t3化学A O統計手法一正P于''一夕O扱P方一”，2008年，化学同人编，101页)
[0093]本发明的溶液的搅拌方法与以往相比可以促进被固定化于分析用芯片的选择结合性物质与被检物质的选择性反应的进行，因此能够将被检物质以短时间进行检测或定量。例如，在核酸的杂交中，可以大幅度缩短以往需要6?20小时的反应时间的反应时间。因此，例如，在要求迅速地分析大量检体的检查、诊断领域中，使用分析用芯片来进行分析的情况下，优选应用本发明的溶液的搅拌方法。例如，可以优选用于流行性感冒等传染病、败血症的检查、诊断。此外，即使在检查中心处理巨大数目的检体的情况下，也可以迅速地进行分析，因此从减少成本方面出发，优选应用本发明。
[0094]实施例
[0095]通过以下的实施例进一步详细地说明本发明。但是本发明不限定于下述实施例。
[0096]参考例I
[0097](I)分析用芯片的基板的制作
[0098]使用作为公知的方法的LIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung)工艺，制作注射成型用的模具，通过注射成型法，获得具有后述那样的形状的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制的基板。所用的PMMA的平均分子量为5万，PMMA中以I重量％的比例含有炭黑(三菱化学制#3050B)，使基板为黑色。测定该黑色基板的光谱反射率与光谱透射率，结果光谱反射率即使在可见光区域(波长为400nm?800nm)的任一波长都为5%以下，此外，在相同范围的波长下透射率为0.5%以下。光谱反射率、光谱透射率在可见光区域都没有特定的光谱图案(峰等)，光谱一样地为平坦的。另外，光谱反射率使用符合JIS Z 8722的条件C的搭载有照明、受光光学系的装置(S V >夕力^ 9制，CM-2002)，测定射入来自基板的正反射光的情况下的光谱反射率。
[0099]作为基板，使用下述基板:外形为纵76mm、横26mm、厚度Imm,在基板上设置纵
6.48_、横6.90_、深度0.12mm的凹部，在该凹部中设置有576处直径0.1_、高度0.12mm的凸部的基板(以下称为“基板A”。)。该基板A中，凸部上面与平坦部上面的高度的差为3μπι以下。此外，凸部上面的高度的偏差为3μπι以下。此外，使凸部的间距为0.18mm。
[0100]将上述基板A在1N的氢氧化钠水溶液中在70°C浸溃12小时。将其以纯水、0.1N的HCl水溶液、纯水依次洗涤，使基板表面生成羧基。
[0101](2)选择结合性物质的固定化
[0102]对于基板A，在以下的条件下，分别固定化寡核苷酸作为选择结合性物质(探针DNA)。作为与4种基因a?d对应的寡核苷酸，使用序列号I?4的碱基序列所示的寡核苷酸(才?口 >社制DNA微阵列用寡核苷酸试剂盒“Homosapiens (Human)AROS V4.0(各60碱基)”)。使该各寡核苷酸溶解于纯水中以成为0.3nmol/μ L的浓度，制成储备溶液。将该储备溶液点样(点着)于基板时，用PBS(使8g的NaCl,2.9g的Na2HPO4.12H20、0.2g的KCl和0.2g的KH2PO4合并而溶解于纯水，稀释成1L，在其中添加盐酸而调整至pH5.5)稀释10倍，使探针DNA的终浓度为0.03nmol/μ L，并且，为了使PMMA制基板表面所生成的羧基与探针DNA的末端氨基进行缩合，添加1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，使其终浓度为50mg/mL。对于该溶液使用点样仪(spotter)(日本 > 一〒一电子制；“GeneStamp-1I ”)，准备下述芯片:在基板A的凸部上面，将与基因a对应的序列号I的碱基序列所示的探针以N = 4点样的芯片(以下，设为“分析用芯片I”。)、将与基因b?d对应的序列号2?4的碱基序列所示的探针分别以N = 2点样的芯片(以下，设为“分析用芯片2”。)。接着，将点样了的各基板放入至密闭的塑料容器中，在37°C、湿度100%的条件下孵育20小时左右。最后用纯水洗涤基板，用旋转式脱水机进行离心来干燥。
[0103](3)盖构件向分析用芯片基板的粘贴
[0104]对于固定化有选择结合性物质的上述分析用芯片1、分析用芯片2，如下那样粘贴盖构件。盖构件通过将PMMA平板进行切削加工来制作。制作的该盖构件中设置有贯通孔和液面停止用室。而且使用双面带作为粘接构件，将盖构件以镶边的方式并且以厚度50 μπι叠层而粘贴后，将该盖构件粘贴于分析用芯片1、分析用芯片2。
[0105](4)被检物质的调制
[0106]被检物质使用通常作为微阵列的被检物质的aRNA (antisense RNA)来调制。由市售的来源于人培养细胞的total RNA(CL0NTECH社制“Human Reference RNA”)5 μ g，将使用 Amb1n 社制 aRNA 调制试剂盒“MessageAmp II aRNA Amplificat1n Kit”来调制的 aRNA用Cy5 (GE Healthcare社)进行突光标记,从而获得Cy5标记aRNA。
[0107](5)用于选择结合性物质与被检物质的杂交的反应液
[0108]在以下的实施例、比较例中只要没有特别说明，使用将由上述调制的标记aRNA用包含I重量％ BSA、5XSSC、0.01重量％鲑鱼精子DNA、0.1重量％ SDS的杂交溶液(各浓度都为终浓度)稀释后的稀释液。
[0109]实施例1
[0110]在包含参考例I所记载的Cy5标记aRNAlOOng的溶液中混合杂交溶液并成为25 μ L，调制出被检物质溶液。将被检物质溶液10 μ L注入至分析用芯片I。凹部内的没有被被检物质溶液填充的空间的容积为约3 μ L，没有被被检物质溶液填充的空间在凹部内所占的比例为约23 %。准备6组(set)上述的分析用芯片I。将各分析芯片的注入口密封而成为将凹部密闭了的状态，放置在设置于调温至37°C的烘箱中的搅拌装置“B1Shake 5000” (QInstruments社；最大转速5000rpm,旋转半径0.6mm)中，关于各分析用芯片，以5000rpm分别搅拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h来进行反应。此时,施加至各分析用芯片的离心加速度为约17.7Xg。关于各分析用芯片，使用高析像度荧光检测装置(东 > 株式会社；“3D-Gene (注册商标)Scanner”)测定杂交了的标记aRNA的信号强度(荧光强度)。将其结果示于图9、图10、表I中。在反应开始后0.5h检测到阈值(空白点的平均+2SD)以上的信号，显示出反应快速地进行了。
[0111]实施例2
[0112]与实施例1同样地操作，将被检物质溶液注入至分析用芯片I (6组)中。放置在设置于调温至37°C的烘箱中的搅拌装置“B1Shake 5000”中，以3000rpm分别搅拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h,进行反应。此时,施加至各分析用芯片的离心加速度为约6.04X g。关于各分析用芯片，使用高析像度荧光检测装置测定杂交了的标记aRNA的信号强度(荧光强度)。将其结果示于图9、图10、表I中。在反应开始后0.5h检测到阈值以上的信号，显示出反应快速地进行了。
[0113]实施例3
[0114]与实施例1同样地操作，将被检物质溶液注入至分析用芯片I (6组)中。放置在设置于调温至37 °C的烘箱中的搅拌装置“MS3 r -7'夕^ ” (IKA社；最大转速3000rpm，旋转半径2.25mm)中，以3000rpm分别搅拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h，进行反应。此时，施加至各分析用芯片的离心加速度为约22.6 X g。关于各分析用芯片，使用高析像度荧光检测装置测定杂交了的标记aRNA的信号强度(荧光强度)。将其结果示于图9、图10、表I中。在反应开始后0.5h检测到阈值以上的信号，显示出反应快速地进行了。
[0115]实施例4
[0116]与实施例1同样地操作，将被检物质溶液注入至分析用芯片I (6组)中。放置在设置于调温至37°C的烘箱中的搅拌装置“MS3 r ''J夕中，以100rpm分别搅拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h，进行反应。此时，施加至各分析用芯片的离心加速度为约2.52Xg。关于各分析用芯片，使用高析像度荧光检测装置测定杂交了的标记aRNA的信号强度(荧光强度)。将其结果示于图9、图10、表I中。在反应开始后0.5h检测到阈值以上的信号，显示出反应快速地进行了。
[0117]比较例I
[0118]与实施例1同样地操作，将被检物质溶液注入至分析用芯片I (6组)中。放置在设置于调温至37°C的烘箱内的搅拌装置“B1Shake 5000”中，以100rpm分别搅拌0.5h、比、211、411、811、1611，进行反应。此时，施加至分析用芯片的离心加速度为约0.671 Xg。关于各分析用芯片，使用高析像度荧光检测装置测定杂交了的标记aRNA的信号强度(荧光强度)。将其结果示于图9、图10、表I中。在反应开始后0.5h未检测到阈值以上的信号。检测到阈值以上的信号是在反应开始后Ih以后。
[0119]比较例2
[0120]与实施例1同样地操作，将被检物质溶液注入至分析用芯片I (6组)中。放置在设置于调温至37°C的烘箱内的搅拌装置“B1Shake 5000”中，以250rpm分别搅拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h，进行反应。此时，施加至各分析用芯片的离心加速度为约0.042Xg。关于各分析用芯片，使用高析像度荧光检测装置测定杂交了的标记aRNA的信号强度(荧光强度)。将其结果示于图9、图10、表I中。在反应开始后0.5h未检测到阈值以上的信号。检测到阈值以上的信号是在反应开始后Ih以后。
[0121]比较例3
[0122]与实施例1同样地操作，将被检物质溶液注入至分析用芯片I (6组)中。放置在设置于调温至37°C的烘箱内的搅拌装置“MS3 r ''J夕 > ”中，以250rpm分别搅拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h，进行反应。此时，施加至分析用芯片的离心加速度为约0.157 X g。关于各分析用芯片，使用高析像度荧光检测装置测定杂交了的标记aRNA的信号强度(荧光强度)。将其结果示于图9、图10、表I中。在反应开始后0.5h未检测到阈值以上的信号。检测到阈值以上的信号是在反应开始后Ih以后。
[0123][表I]
[0124]表I 反应时间和信号强度
[0125]
反应时间(h) |θ.5[I[2fi [8 [?6
实施例152.597.8182.5~ 232.3~ 285.5~ 309.0
实施例 241.385.5171.3~ 218.3~ 279.2~ 305.4
实施例 361.7101.9~192.1~ 247.9~ 296.4~ 312.3
实施例 43δΓ36?Γ5150.9~193.5~ 265.4~ 296.4
比较例 I2^83573TL2 136.7~207.2~286.4
比较例 2Τ?ΓδθΓθ 108.3~176.1~279.0
比较例 320 533Γ976?8 145.4~218.9~272.9
[0126]实施例5
[0127]在包含参考例I所记载的Cy5标记aRNA60ng的溶液中混合杂交溶液并成为10 μ L，在分析用芯片2 (2组)中注入6.7 μ L。注入了的Cy5标记aRNA的量为40ng，与实施例I?4同量。凹部内的没有被被检物质溶液填充的空间的容量为约6.3 μ L，没有被被检物质溶液填充的空间在整个凹部中所占的比例为约48%。与实施例1同样地操作，放置在搅拌装置“B1Shake5000”中，分别以5000rpm进行反应I小时。关于各分析用芯片，使用高析像度荧光检测装置测定对3种基因b?d进行了杂交的标记aRNA的信号强度(荧光强度)。将其结果示于表2中。在I小时的反应时间，全部的基因的信号强度成为阈值以上，是有效的。
[0128]实施例6
[0129]在包含参考例I所记载的Cy5标记aRNA60ng的溶液中混合杂交溶液并成为15 μ L，在分析用芯片2 (2组)中注入10 μ L。注入了的Cy5标记aRNA的量为40ng，与实施例I?4同量。凹部内的没有被被检物质溶液填充的空间的容量为约6.3 μ L，没有被被检物质溶液填充的空间在整个凹部中所占的比例为约23%。与实施例1同样地操作，放置在搅拌装置“B1Shake5000”中，分别以5000rpm进行反应I小时。关于各分析用芯片，使用高析像度荧光检测装置测定对3种基因b?d进行了杂交的标记aRNA的信号强度(荧光强度)。将其结果示于表2中。在I小时的反应时间，全部的基因的信号强度成为阈值以上，是有效的。
[0130]比较例4
[0131]在包含参考例I所记载的Cy5标记aRNA60ng的溶液中混合杂交溶液并成为20 μ L，在分析用芯片2 (2组)中注入13 μ L而填充凹部(没有被被检物质溶液填充的空间在整个凹部中所占的比例为0% )。与实施例1同样地操作，放置在搅拌装置“B1Shake5000”中，分别以5000rpm进行反应I小时。关于各分析用芯片，使用高析像度荧光检测装置测定对3种基因b?d进行了杂交的标记aRNA的信号强度。将其结果示于表2中。在I小时的反应时间，基因b的信号强度成为阈值以上，是有效的，但是与实施例5、6相比，信号强度弱。此外，基因c、d的信号强度比阈值低，是无效的。
[0132][表2]
[0133]表2
[0134]凹部中的没有被被检物质溶液填充的空间的比例和各基因的信号强度
[0135]
~—实施例5 实施例6 比较例4
'凹部中的没有被被检物质溶液填充_ ~~Tl■
空间的比例<*>y
—■430.3 361 O 151 6
基因b-------
___432.2 343.9 155.4
139.3 129.2 107.6
____147.3 132.5 107.6
~~148.7 126.3 99?~~
基因d---
150.6 136.5 101.7
阈值(平均+2SD)111.0 I 107.7 108.8
[0136]参考例2
[0137](I)分析用芯片的基板的制作
[0138]采用与参考例I同样的材质，利用注射成型制作出外形为纵76mm、横26mm、厚度2.5mm的基板。基板使用设置有4处长边4.8mm、短边2.40mm、深度1.5mm的椭圆形的凹部，在各凹部中设置有98处直径0.1mm、高度0.12mm的凸部的基板(以下称为“基板B”。)。在基板B中，凹部的容积为约13.5 μ L0此外，凸部上面与平坦部上面的高度的差、凸部上面的高度的偏差都为3μπι以下。此外，将凸部的间距设为0.18mm。
[0139](2)选择结合性物质(捕捉探针)的固定化
[0140]通过与参考例I同样的制作方法，作为选择结合性物质(捕捉探针)，合成出人乳头瘤病毒的型判别研究中所报告的文献(J.Clin.Microb1l, 1995.p.901-905)中所记载的、序列号5的碱基序列(与成为被检物质的16型人乳头瘤病毒的LI基因区域的序列的一部分互补的序列)所示的寡核苷酸的5’末端修饰了氨基的选择结合性物质，在基板B的98处凸部中的22处点样并固定化，从而获得分析用芯片(以下，称为“分析用芯片3”。)。
[0141](3)被检物质的调制
[0142]作为被检物质，将由t 二一7研究资源库购入的人乳头瘤病毒的基因组DNA被克隆化了的重组质粒(pHPV16(全长16，600碱基对))通过超声波进行了片段化处理。以IX杂交溶液(I重量％牛血清白蛋白(BSA)，5XSSC，1重量％十二烷基硫酸钠(SDS)，50ng/mL鲑鱼精子DNA溶液，5重量％葡聚糖硫酸钠，30%甲酰胺)进行稀释以使核酸浓度为0.1amol/μ L，设为检体DNA溶液。
[0143](4)检测探针溶液的调制
[0144]作为夹心杂交所使用的检测探针，分别合成出ΜΥ11(序列号6 ;将被检物质与捕捉探针结合了的情况下的5’末端的碱基位置作为基准，与5’末端侧第50?69的碱基序列互补的序列)、GP5 (序列号7 ;与MYll同样地，与5’末端侧第10?34的碱基序列互补的序列)、GP6(序列号8 ;将被检物质与捕捉探针结合了的情况下的3’末端的碱基位置作为基准，与3’末端侧第60?82的碱基序列互补的序列)和MY09 (序列号9 ;与GP6同样地，与3’末端侧第340?359的碱基序列互补的序列)的、3’末端和5’末端进行了生物素标记的检测探针。将它们用灭菌水稀释以使浓度为lOOfmol，从而获得各检测探针溶液。
[0145]实施例7
[0146]在参考例2所记载的检体DNA溶液I μ L中，添加参考例2所记载的检测探针溶液I μ L并进行混合，用热循环仪在95°C加热5分钟。静置直至恢复至室温，然后添加8 μ L参考例2所记载的IX杂交溶液并进行混合，制成包含被检物质的杂交溶液。将全部量注入至分析用芯片3的凹部的I处，将开口部用涂布有丙烯酸系粘着剂的PET制膜密封。此时，凹部内的未被溶液填充的空间的容积为约3.5μ L，未被溶液填充的空间在凹部内所占的比例为约26%。通过夹心杂交法，进行被检物质的检测。放置在设置于调温至32°C的烘箱中的搅拌装置“B1Shake 5000”(Q Instruments社)中，以3000rpm搅拌2h,将捕捉探针与被检物质进行杂交反应。此时，施加至各分析用芯片的离心加速度为约6.04Xg。反应后，剥离堵塞了开口部的密封件，用加温至30°C的洗涤液A(0.5XSSC, I重量％ SDS)洗涤5分钟。干燥后，将染色试剂(链亲和素藻红蛋白，Streptavidin phycoerythrin)与稀释液(10mM MES, IM NaCl, 0.05 重量％ Tween20, 2mg/mLBSA)进行混合而调制的、50ng/μ L链亲和素藻红蛋白溶液10 μ L滴加至凹部，在35°C 5分钟遮光下进行了孵育。用加温至30°C的洗涤液W6XSSPE，0.01重量％ Tween20)洗涤5分钟，进行干燥。使用高析像度荧光检测装置(东 > 株式会社；“3D-Gene (注册商标)Scanner”)测定信号强度(荧光强度)。分别读取固定化有选择结合性物质的凸部(信号)和未固定化选择结合性物质的凸部(噪声)的数值，算出信号/噪声比(S/N比)，将其结果示于表3中。S/N = 2.80，超过作为检测限度的S/N = 2。
[0147]实施例8
[0148]将杂交反应时的搅拌装置的转速设为5000rpm，除此以外，进行了与实施例7同样的操作。此时，离心加速度为16.77Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N = 2.53，超过作为检测限度的S/N = 2。
[0149]比较例5
[0150]将杂交反应时的搅拌装置的转速设为100rpm，除此以外，进行了与实施例7同样的操作。此时，离心加速度为0.67Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N=1.56，未达到作为检测限度的S/N = 2。
[0151]实施例9
[0152]作为搅拌装置，使用“Mix-EVR”(夕4 f 夕社；最大转速2500rpm，旋转半径1mm)，将杂交反应时的搅拌装置的转速设为2000rpm，除此以外，进行了与实施例7同样的操作。此时，离心加速度为4.47Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N = 2.24，超过作为检测限度的S/N = 2。
[0153]实施例10
[0154]将杂交反应时的搅拌装置的转速设为2500rpm，除此以外，进行了与实施例9同样的操作。此时，离心加速度为6.99Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N = 2.76，超过作为检测限度的S/N = 2。
[0155]比较例6
[0156]将杂交反应时的搅拌装置的转速设为500rpm，除此以外，进行了与实施例9同样的操作。此时，离心加速度为0.28Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N=1.48，未达到作为检测限度的S/N = 2。
[0157]实施例11
[0158]搅拌装置使用“MS3 r -7' 9 (IKA社)，将杂交反应时的搅拌装置的转速设为2000rpm，除此以外，进行了与实施例7同样的操作。此时，离心加速度为10.06Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N = 3.25，超过作为一检测限度的S/N = 2。
[0159]实施例12
[0160]将杂交反应时的搅拌装置的转速设为3000rpm，除此以外，进行了与实施例10同样的操作。此时，离心加速度为22.64Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N = 2.72，超过作为检测限度的S/N = 2。
[0161]比较例7
[0162]将杂交反应时的搅拌装置的转速设为500rpm，除此以外，进行了与实施例11同样的操作。此时，离心加速度为0.63Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N=1.61，未达到作为检测限度的S/N = 2。
[0163]实施例13
[0164]使用制作的搅拌装置(最大转速100rpm,旋转半径5mm),将杂交反应时的搅拌装置的转速设为100rpm，除此以外，进行了与实施例7同样的操作。此时，离心加速度为
5.59Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N = 2.39，超过作为检测限度的S/N = 2。
[0165]比较例8
[0166]将杂交反应时的搅拌装置的转速设为250rpm，除此以外，进行了与实施例13同样的操作。此时，离心加速度为0.35Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N=1.49，未达到作为检测限度的S/N = 2。
[0167]比较例9
[0168]搅拌装置使用,v千工一力一 MMS-210”(东京理化器械社；最大转速250rpm,旋转半径12.5mm)，将杂交反应时的搅拌装置的转速设为250rpm，除此以外，进行了与实施例7同样的操作。此时，离心加速度为0.87Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N=1.56，未达到作为检测限度的S/N = 2。
[0169]比较例10
[0170]使用制作的搅拌装置(最大转速100rpm,旋转半径24mm),将杂交反应时的搅拌装置的转速设为10rpm，除此以外，进行了与实施例7同样的操作。此时，离心加速度为0.27Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N = 1.39，未达到作为检测限度的S/N =2。
[0171]比较例11
[0172]使用制作的搅拌装置(最大转速100rpm,旋转半径72mm),将杂交反应时的搅拌装置的转速设为10rpm，除此以外，进行了与实施例7同样的操作。此时，离心加速度为0.80Xg。算出S/N比，将其结果示于表3中。S/N = 1.57，未达到作为检测限度的S/N =2。
[0173][表3]
[0174]表3 旋转半径、转速、离心加速度和信号强度
[0175]
I旋转半径I转速P心加速度I信号强度
____ (rpm) (Mg) ~ 信号噪声 S/N 比
—比较例5 , 0.6.一 1000 067_ 2841 1S21 1:56
_ 实施例7 一..................................0J........................3000 ~— 6.04 — 5110 1825 "^2J0
"实施例 8 _...............................0J........................5000 16.77 462S 1828................................................2.53
比较例 6 -- —_____ 锻4_~^48
~~—1.....2000 ——— 4Λ7 "'4ci1................................................1802 2.24
—实施例 10................................................1iil..........................2.76'
比较例 7__2.25 500 0.63...........................2924 — 1816 161
实施铜11__2.25 2000 10 06 5879 1809 3 25
—实施例 12.2.25 — 3000 22^64 4S67 1826 — 2.72
比较例 S _5 250 0-35 2713 1821 1.49
5 ~ 100'.....................................1'li 4338 1Α15 2J9
~*555.................................250 0.8? ~2838........................1ili 一^--?
_把较_0 —"24..............................100......0,27 2538 1826 ?5
丨m1 I721100|οΓβοι~.丨丨2820|咖咖^11--?ι.........................Tm
[0176]实施例14
[0177]在参考例2所记载的检体DNA溶液4 μ L中添加参考例2所记载的检测探针溶液4y L并进行混合，用热循环仪在95°C加热5分钟。静置直至恢复至室温，然后添加32 μ L参考例2所记载的IX杂交溶液并进行混合，制成包含被检物质的杂交溶液。在分析用芯片3的凹部4处(凹部N0.#1?#4)分别注入10 μ L，将开口部用涂布有丙烯酸系粘着剂的PET制膜密封。此时，凹部内的未被溶液填充的空间的容积为约3.5 μ L，未被溶液填充的空间在凹部内所占的比例为约26%。通过夹心杂交法，进行被检物质的检测。放置在设置于调温至32°C的烘箱中的搅拌装置“MS3 r ''J夕^ ” (IKA社)中，以2000rpm搅拌2h，将捕捉探针与被检物质进行杂交反应。此时，施加至各分析用芯片的离心加速度为约10.1Xgo反应后，剥离堵塞了开口部的密封件，用加温至30°C的洗涤液A (0.5 X SSC, I重量％ SDS)洗涤5分钟。干燥后，将染色试剂(链亲和素藻红蛋白)与稀释液(10mM MES, IM NaCl,0.05重量％ Tween20,2mg/mL BSA)进行混合而调制的、50ng/μ L链亲和素藻红蛋白溶液10 μ L滴加至凹部，在35°C 5分钟遮光下进行了孵育。用加温至30°C的洗涤液B(6XSSPE，
0.01重量％ Tween20)洗涤5分钟，进行干燥。使用高析像度荧光检测装置(东 > 株式会社；“3D-Gene (注册商标)Scanner”)测定信号强度(荧光强度)。分别读取固定化有选择结合性物质的凸部(信号)和未固定化选择结合性物质的凸部(噪声)的数值，算出4处凹部(凹部N0.#1?#4)的信号/噪声比(S/N比)，将其结果示于表4中。分别为S/N =
2.9,2.7,2.8,2.8，全部凹部都超过作为检测限度的S/N = 2。此外，各凹部内的22个凸部斑点的信号的CV值全部为低于10%的低的值，凹部内的信号的偏差也小。进一步显示出，4处凹部整体的信号(88个)的CV值也低至7.5%，凹部间的偏差也小。
[0178]比较例12
[0179]使用制作的自转公转方式的搅拌装置(公转半径72mm),将公转转速设为350rpm,除此以外，进行与实施例14同样的操作。此时，离心加速度为9.9Xg。算出4处凹部(凹部N0.#1?#4)的S/N比，将其结果示于表4中。分别为S/N= 1.8、1.9、1.7、1.5，全部凹部都未达到作为检测限度的S/N = 2。此外，各凹部内的22个凸部斑点的信号的CV值为10%左右且有偏差，进一步显示出，4处凹部整体的信号(88个)的CV值高达15.3%，凹部间的偏差大。
[0180][表 4]
[0181]表4 搅拌的旋转方式和信号强度、偏差、S/N比
[0182]
实施例14比较例12
旋转方式 —.....—"^?1?.......................................................................................................................1i#^#....................................................................旋转半操2.26 ITHiiI72 ιηπι|
— 榦速1 Π20Μφιη..............................................................................................................................350rpm..........................................n——
离心加速度__10,1 Xg9—9— xg
—~iiplo-lllllllllllllim—lllllllllimiilllllllllllim11111111111111?lllllllllimlllllllllim#3lllllllllimlllllllllim#4llllllllim~--ι…1…1111111…1…111111#2…1…1111111"" #3 #4
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平均 _5266__3112
昏体的信号396.0~475.8
CV(%): ?.S __ 15.3: ~
各》部的噪声平均 18T4 I 1938 ~?Κ9 I 1862 1820 | 1847~ 1757I 1777
S/W Λ ~~ 2.S I 2.7 —2~8~ I 2~8~ 1.8 I 1.9 1.7[ 1~
[0183]产业可利用性
[0184]本发明的溶液的搅拌方法与以往相比，可以大幅度缩短使用DNA芯片等分析用芯片的被检物质的检测或定量所需要的时间。因此，本发明能够进行临床现场、检查中心中的迅速的疾病的诊断、诊察等，因此是有用的。
[0185]符号的说明
[0186]I 基板
[0187]2 具有贯通孔的板材
[0188]3 凹部的底面
[0189]4 凹部的壁面
[0190]5 选择结合性物质的固定化表面
[0191]6 凹部(或凹部的空间)
[0192]7 盖
[0193]8 注入孔
[0194]9 未被溶液填充的空间(或气泡)
[0195]10分析用芯片。
【权利要求】
1.一种溶液的搅拌方法，是被注入到分析用芯片中的包含被检物质的溶液的搅拌方法， 该分析用芯片具有注入该包含被检物质的溶液的凹部，在该凹部的全部底面表面或一部分底面表面固定化与该被检物质选择性结合的选择结合性物质， 在分析用芯片的凹部的空间以残留该空间的一部分的方式注入该包含被检物质的溶液， 对注入有该包含被检物质的溶液的分析用芯片施加IXg以上的离心加速度使其回转旋转。
2.根据权利要求1所述的溶液的搅拌方法，使注入有该包含被检物质的溶液的分析用芯片以0.1mm以上20mm以下的旋转半径进行回转旋转。
3.根据权利要求1或2所述的溶液的搅拌方法，在所述凹部以残留10%以上70%以下的空间的方式注入所述包含被检物质的溶液。
4.根据权利要求1?3的任一项所述的溶液的搅拌方法，所述分析用芯片具有彼此被壁面隔开了的注入包含被检物质的溶液的多个凹部。
5.根据权利要求1?4的任一项所述的溶液的搅拌方法，在所述分析用芯片上安装覆盖整个所述凹部的盖，从而将所述包含被检物质的溶液密闭在该凹部内。
6.根据权利要求1?5的任一项所述的溶液的搅拌方法，注入有所述包含被检物质的溶液的分析用芯片，以所述凹部的底面成为水平或大致水平的方式设置而在水平或大致水平的方向上回转旋转。
7.一种被检物质的分析方法，通过权利要求1?6的任一项所述的溶液的搅拌方法使被检物质与被固定化于分析用芯片的选择结合性物质结合，检测与选择结合性物质结合的该被检物质。
【文档编号】G01N37/00GK104169722SQ201380011640
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年2月27日 优先权日:2012年2月29日
【发明者】黑田俊彦, 信正均 申请人:东丽株式会社