一种利用pH示差法测定紫色菊花花青素苷含量从而确定最佳采收期的方法与流程

本发明属于菊花栽培和工业提取花青素苷技术领域，具体涉及一种利用ph示差法测定紫色菊花花青素苷含量从而确定最佳采收期的方法。

背景技术：

菊花，多年生草本植物，其头状花序色泽艳丽，富含黄酮类化合物、三萜类化合物和挥发油等多种有效成分，具有重要的观赏、食用、茶用和药用价值。花青素苷，属黄酮类化合物，是植物主要的呈色物质，能够清除自由基，具有抗氧化作用，在食品、保健、医药和化妆品领域的应用日趋受到人们的关注。在所有色系的菊花品种中，紫色系菊花花瓣中花青素苷含量最高，从紫色菊花花瓣中工业化提取花青素苷对于延伸菊花产业链，提高菊花产业的总效益具有重要的意义。

有关紫色菊花花瓣中花青素苷的研究，目前主要集中在花青素苷的提取方面，有关其花青素苷的含量检测方法的研究目前报道较少。已有紫色菊花花青素苷的检测，常用单一ph下的分光光度法和高效液相色谱法两种方法进行，由于菊花花青素提取过程中所得到的浸提液成分复杂，难免会有干扰物影响单一ph下的分光光度法对花青素苷含量的检测；用高效液相色谱法检测花青素苷的含量，则存在所需仪器设备较为昂贵的局限性。ph示差法能够有效减少干扰物对花青素苷含量检测的影响，且设备费用投入较小。目前，使用ph示差法检测花青素苷含量的研究逐渐增多，但在紫色菊花花青素苷检测方面目前报道较少，有关检测方法中的相关参数目前仍不清楚。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供了一种利用ph示差法测定紫色菊花花青素苷含量从而确定最佳采收期的方法，该方法利用ph示差法确定检测紫色菊花花青素苷含量的相关参数，对检测波长、ph和平衡时间进行筛选，通过测定花青素苷含量及计算单花序花青素苷含量的变化确定出紫色菊花的最佳采收时期，为工业提取花青素苷提供技术支持。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种利用ph示差法测定紫色菊花花青素苷含量从而确定最佳采收期的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）紫色菊花样品的采集；

（2）花青素苷浸提液的制备；

（3）紫色菊花样品中花青素苷的浸提；

（4）ph示差法条件参数检测波长、ph及平衡时间的确定；

（5）紫色菊花花青素苷含量的测定；

（6）确定紫色菊花最佳采收期。

进一步优选，步骤（1）的具体过程为：从紫色菊花开花进程选取4个取样时期分别取菊花头状花序，将菊花头状花序鼓风干燥72h后准确称取0.2g菊花花瓣样品作为待测样品。

进一步优选，步骤（2）的具体过程为：将体积分数为80%的乙醇溶液与摩尔浓度为0.1mol/l的盐酸溶液以1:2的体积比混合均匀配制成花青素苷浸提液。

进一步优选，步骤（3）的具体过程为：将准确称取的0.2g待测样品剪至1cm置于10ml的离心管中，再添加10ml花青素苷浸提液，在室温下浸提24h后滤去花瓣，花青素苷滤液用于花青素苷含量的测定，浸提过程中用双层黑色塑料袋遮光以防止花青素苷的降解，并且每隔2-3h充分搅拌1次。

进一步优选，步骤（4）的具体过程为：

检测波长的确定，利用紫外-可见分光光度计对矢车菊色素-3-o-葡萄糖苷标准品和花青素苷滤液在200-800nm范围内进行全波段扫描，在可见光区内，矢车菊色素-3-o-葡萄糖苷的最大吸收峰在511nm附近，花青素苷滤液中花青素苷的最大吸收峰在515nm附近，二者吸收峰相近，因此，确定515nm为花青素苷滤液中花青素苷的最大吸收波长，参考矢车菊色素-3-o-葡萄糖苷中的相关参数来计算花青素苷滤液中花青素苷的含量；

ph的确定，先将花青素苷滤液稀释4倍，再分别准确量取稀释后的花青素苷滤液1ml于9个试管中，然后分别加入ph为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0的缓冲液9ml，以浸提液调零，测定最大吸收波长下的吸光度，花青素苷滤液中花青素苷在ph1.0和ph4.5处的吸光度值的差值最大，并且在此两处的ph附近吸光度值变化较小，所以选择在ph1.0和ph4.5条件下测定花青素苷滤液中的花青素苷含量；

平衡时间的确定，先将花青素苷滤液用浸提液稀释4倍，然后取0.5ml稀释后的花青素苷滤液加入4.5mlph1.0的缓冲溶液，记录样品溶液与缓冲溶液混合后的时间，以浸提液调零，室温下设置平衡时间在0-150min，每隔15min测一次最大吸收波长下的吸光度，用同样的方法测ph4.5的缓冲溶液下样品的平衡时间，在ph1.0的缓冲溶液中，花青素苷的吸光度值随时间的延长而逐渐增加，在60min后趋于稳定，在ph4.5的缓冲溶液中，花青素苷的吸光度值随时间的延长而逐渐减少，在105min后趋于稳定，根据两者的数据进行综合考虑，平衡时间选择为105min。

进一步优选，步骤（5）的具体过程为：将花青素苷滤液用浸提液稀释4倍，然后取1ml稀释后的花青素苷滤液加入ph1.0的缓冲溶液定容至10ml，室温下平衡105min，以浸提液调零，分别在最大吸收波长和700nm处测定吸光度值，然后用同样的方法测定花青素苷滤液在ph4.5的缓冲溶液中最大吸收波长和700nm处的吸光度值，然后代入公式（1）计算紫色菊花花青素苷含量，

x=∆t*v*f*m*1000/ε*m（1）

其中x为紫色菊花花青素苷含量，mg/g；v为稀释体积，l；f为稀释倍数；m=449.2；ε=26900；∆t为吸光度值，∆t=(aλmax-a700nm)ph1.0-(aλmax-a700nm)ph4.5；m为样品质量，g。

进一步优选，步骤（6）的具体过程为：综合所测得的紫色菊花花青素苷含量和计算得到的单花序花青素苷含量，筛选出紫色菊花花青素苷含量较高且不同取样批次间均匀度高，同时单花序花青素苷含量也较高的采样时期，从而确定紫色菊花的最佳采收时期。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、能够有效减少干扰物对紫色菊花花青素苷含量检测的影响；

2、设备费用投入较少，方便操作简单快捷，为测定紫色菊花花青素苷含量提供了方便，能够有效紫色菊花的最佳采收时期，为工业化提取紫色菊花花青素苷提供了技术支持。

附图说明

图1是紫色菊花4个取样时期的头状花序形态图；

图2是矢车菊色素-3-o-葡萄糖苷光谱图；

图3是紫色菊花‘红五九’花青素苷光谱图；

图4是紫色菊花‘红五九’在不同ph下的吸光度值；

图5是紫色菊花‘红五九’吸光度值随时间的变化曲线（ph1.0和ph4.5）。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例

样品采集

本试验以紫色菊花品种‘红五九’为供试材料，按行距60cm、株距40cm种植在生物园地菊花圃，自然生长。在菊花根部萌蘖嫩茎长至15-20cm时（4月20日）采集10cm健壮顶芽，留顶部两片微张开叶片，其余叶片均去除，然后在沙床上扦插育苗，至6月1日幼苗具10-12条8cm以上长度的根时开始移栽定植。从中挑选12株生长健壮且株型相似的菊花作为实验对象。随菊花开花进程选取4个取样时期（见图1），在各时期取菊花头状花序，用于形态和生理指标的检测。各时期形态特征如下：

ii期：花序最外层花瓣展开至竖立状态（开花初期）；

iii期：花序最外层花瓣展开至45°张角（盛花前期）；

iv期：花序最外层花瓣完全伸展，中间管状花集中部分全为黄色（盛花中期）；

v期：花序最外层花瓣完全伸展，中间管状花区域外围一、二圈黄色消失且雌蕊“y”形柱头突出（盛花后期）。

菊花外轮第一轮花瓣长度和干重均采用直接测量和直接称重法测定。具体操作步骤为：取样后，将从菊花圃采回来的新鲜花瓣先用湿纱布擦去表面灰尘，再用吸水纸吸干表面水分，记录花朵数，选择代表型花朵测量并记录第一轮花瓣的长度。将所有花瓣从花序上取下，在40℃下鼓风干燥72h后称量花序花瓣干重，单花序花瓣干重由当次采集多朵花序总干重除以花序数求得。最后将材料收集置于黑色塑料布中，阴凉通风处存放，用于后续花青素苷含量的检测。

‘红五九’花瓣花青素苷浸提液的配制

准确量取400ml无水乙醇用双蒸水定容于500ml的容量瓶中配制成体积分数为80%的乙醇溶液；准确量取8.33ml的浓盐酸用双蒸水定容于1000ml容量瓶中配制成摩尔浓度为0.1mol/l的盐酸溶液；再将体积分数为80%的乙醇溶液与摩尔浓度为0.1mol/l的盐酸溶液以1:2的体积比混合均匀配制成花青素苷浸提液。

‘红五九’花瓣花青素苷的浸提

准确称取0.2g不同时期采收的处理后的菊花花瓣样品，将称量好的菊花花瓣剪至1cm左右置于10ml的离心管中，添加10ml花青素苷浸提液，在室温下浸提24h后滤去花瓣，花青素苷滤液用于花青素苷含量的测定，浸提过程中用双层黑色塑料袋遮光，防止花青素苷降解，并且每隔2-3h充分摇匀1次。

ph示差法相关条件的确定

测定波长的选择：先用矢车菊色素-3-o-葡萄糖苷的标准品，用ph1.0的缓冲液配制成溶液，稀释合适倍数后，在波长200-800nm范围内进行全波段光谱扫描，确定其最大测定吸收波长。空白对照用浸提液。参考同种方法对‘红五九’的滤液进行200-800nm全波段光谱扫描，确定其最大吸收波长。

ph的选定：由于花青素苷仅在ph小于7的酸性条件下稳定，因此先将‘红五九’花瓣滤液稀释4倍，再分别准确量取稀释后的滤液1ml于9个试管中，再分别加入ph为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0的缓冲液9ml，以浸提液调零，测定最大吸收波长下的吸光度，根据吸光度的变化选择合适的ph花青素含量测定参照ph示差法进行。

平衡时间的确定：改变花青素苷的溶液条件后，花青素苷的结构形式需要经过一定时间才能达到动态平衡。先将花青素苷滤液用浸提液稀释4倍，然后取0.5ml样品稀释液再加入4.5mlph1.0的缓冲溶液，记录样品溶液与缓冲溶液混合后的时间，以浸提液调零，室温下设置平衡时间在0-150min之内，每隔15min测一次最大吸收波长下的吸光度。用同样的方法测ph4.5的缓冲溶液下样品的平衡时间。

花青素苷含量的测定：将花青素苷滤液用浸提液稀释4倍，然后取1ml样品稀释液再加入ph1.0的缓冲溶液定容至10ml，室温下平衡后，以浸提液调零，分别在最大吸收波长和700nm处测定吸光度值。然后用同样的方法测定滤液在ph4.5的缓冲溶液中最大吸收波长和700nm处的吸光度值，按公式（1）计算花青素苷含量。

x=∆t*v*f*m*1000/ε*m（1）

其中x为紫色菊花花青素苷含量，mg/g；v为稀释体积，l；f为稀释倍数；m=449.2；ε=26900；∆t为吸光度值，∆t=(aλmax-a700nm)ph1.0-(aλmax-a700nm)ph4.5；m为样品质量，g。

利用上述ph示差法测定紫色菊花品种‘红五九’花青素苷相关条件及花青素苷含量结果如下：

测定波长的选择利用紫外-可见分光光度计对矢车菊色素-3-o-葡萄糖苷标准品和‘红五九’滤液在200-800nm范围内进行全波段扫描。在可见光区内，矢车菊色素-3-o-葡萄糖苷（见图2）的最大吸收峰在511nm附近，‘红五九’滤液中花青素苷（见图3）的最大吸收峰在515nm附近，二者吸收峰相近，因此，确定515nm为‘红五九’中花青素苷的最大吸收波长，参考矢车菊色素-3-o-葡萄糖苷中的相关参数来计算‘红五九’中花青素苷的含量。

ph的选定由图4可知，‘红五九’中的花青素苷在ph1.0和ph4.5处的吸光度的差值最大，并且在此两处的ph附近吸光度值变化较小，所以选择在ph1.0和ph4.5条件下测定‘红五九’的花青素苷的含量。

平衡时间的确定图5反映了在ph1.0和ph4.5缓冲溶液处理下，花青素苷提取液的吸光度值在不同时间下的变化情况。结果表明，在ph1.0的缓冲溶液中，花青素苷的吸光度值随时间的延长而逐渐增加，在60min后趋于稳定。在ph4.5的缓冲溶液中，花青素苷的吸光度值随时间的延长而逐渐减少，在105min后趋于稳定。因此，根据两者的数据进行综合考虑，平衡时间选择为105min。

如表1所示，将上述4个采收状态下‘红五九’头状花序花瓣花青素苷含量和单花序花青素苷含量的变化结果进行比较可知，在不同开花状态下采收，随着采收期的推迟，采收具体时间后移，外轮第一轮花瓣长度逐渐增大且在不同批次间的差异逐渐减小；单花序花瓣平均干重随采收期的推迟逐渐增加，在各个采收状态下随取样具体日期的推迟逐渐减少；花青素苷含量在ii期、iii期和v期采收时，不同批次样品均存在显著差异，在iv期采收时不同批次样品无显著差异且数值较高；单花序花青素苷含量随采收期的推迟逐渐增加，且随具体采收日期的推迟均逐渐减少。综上可知，在iv期采收时，可获得花青素苷含量较高且不同取样批次间均匀度高的样品，同时单花序花青素苷含量也较高。因此，确定iv期菊花品种‘红五九’工业提取花青素苷最佳采收期。

表1不同采收期‘红五九’取样时间、形态和生理指标变化比较

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。