一种ST37型艰难梭菌及其单位点变异型ST81的鉴定方法与流程

本发明涉及一种菌种型别的鉴定方法，具体涉及一种st37型艰难梭菌及其单位点变异型st81的鉴定方法。

背景技术：

艰难梭菌(clostridiumdifficile，cd)是一种专性厌氧，革兰阳性的粗大芽孢杆菌，是抗生素相关性腹泻和伪膜性肠炎(pmc)的主要病原体，约30％的抗生素相关性腹泻以及90％以上的伪膜性肠炎由艰难梭菌引起。艰难梭菌相关性腹泻(clostridiumdifficile-associateddiarrhea，cdad)的临床表现差异较大，患者症状可为轻度腹泻或重度致死性的伪膜性肠炎。艰难梭菌基因型与患者病情相关，感染不同的基因型，疾病的发展和预后可能完全不同，如感染了高毒力基因型，例如艰难梭菌027/nap1/bi(pcr-核糖体分型为027，脉冲场凝胶电泳分型为nap1，限制性内切酶分型为bi)可导致严重后果，甚至死亡。

艰难梭菌导致人类腹泻的主要致病机制与该菌产生的两种毒素有关，即肠毒素a(tcda)和细胞毒素b(tcdb)，rt027型艰难梭菌是一种毒素a+b+菌株，但是该菌株在我国并不常见，我国等亚洲地区国家较为广泛流行的是rt017型，也就是多位点序列分型37型(以下简称st37型)，st3型和st54型也较为常见。st37型艰难梭菌是一种毒素a-b+菌株，即仅产生毒素b，不产生毒素a，却比a+b+菌株有更强的耐药特性和致病能力。近年来，由a-b+菌株引起的严重cdi症状和医院内爆发流行时有报道，来自韩国的一家三级医院的研究表明，相比a+b+菌株，a-b+菌株在伪膜性肠炎(pmc)患者中的检出率更高，对氟喹诺酮类、大环内脂类、林可霉素类等多种抗生素呈高水平耐药的特性更促使st37型艰难梭菌在医院内的广泛流行。st81型是st37型的单位点变异型，二者具有非常相近的亲缘关系和相似的生物学特性。st81型与st37型艰难梭菌均为a-b+变异株，且同样存在“耐多药”现象，具有同样的诊断价值。因此，st37型艰难梭菌及其单位点变异型st81型的快速鉴定对cdi的防控和治疗用药的选择具有极其重要的意义。

传统的mlst分型技术需要经过细菌基因组提取，扩增，测序，并将测序结果提交数据库比对后，才可知道分型结果，完整的mlst分型过程需要1～2天的时间，既耗时又耗力，并且操作繁琐，价格昂贵，无法在临床实验室中常规检测。当院内感染暴发时，mlst对引起院内感染的病原体的检测具有滞后性，无法满足快速鉴定的实际需求。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种st37型艰难梭菌及其单位点变异型st81的鉴定方法，以解决现有鉴定方法操作繁琐、耗时长且无法用于常规检测的问题。

本发明的目的是这样实现的，一种st37型艰难梭菌及其单位点变异型st81的鉴定方法，包括以下步骤：提取待鉴定艰难梭菌菌株中的蛋白质，得到质谱测试样品；利用质谱检测设备对上述样品进行检测，所得质谱图中在m/z3235～3245和m/z3280～3290处同时存在特异性的蛋白峰的菌株为st37型艰难梭菌或其单位点变异型st81。

本发明方法中，采用乙醇/甲酸法提取待鉴定艰难梭菌菌株中的蛋白质。

本发明方法中，所述质谱测试样品按照以下步骤制备：取5～10mg新鲜培养的艰难梭菌菌株充分悬浮于300μl超纯水中，再加入900μl无水乙醇，充分混匀后，12000×g离心2min，弃去上清液，向沉淀中加入20μl70％甲酸水溶液(由70μl甲酸和30μl水配成)并混匀，再加入20μl乙腈，充分振荡混匀，12000×g离心2min，吸出上清放于干净的ep管(即离心管)中，将含有艰难梭菌蛋白质提取物的1μl上清液转移到样品靶板上，室温下干燥，之后，将1μlchca基质覆盖在样品靶板上，避风干燥，即得到质谱测试样品。

本发明方法中，所用的质谱检测设备为microflexlt基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪或vitekms全自动快速微生物质谱检测系统。

本发明首次建立了一种基于maldi-tofms的st37型艰难梭菌及其单位点变异型st81的快速鉴定方法，通过检测质谱中是否存在一组特异性的蛋白峰(m/z3235～3245和m/z3280～3290)，即可判定是否为st37型或其单位点变异型st81型艰难梭菌，该方法具有实时快速的特点，可以在菌种鉴定的同时将st37型及其单位点变异型st81实时筛选出来，鉴定过程不再需要其他的特殊仪器设备，也不需要额外的操作步骤，对疾病的快速诊断和提供及时的临床用药指导具有重要意义，适用于医院感染和暴发流行的监测。

本发明方法简单，操作简便，结果准确有效，重复性好，且所用设备均为常规实验设备，便于推广和应用。

附图说明

图1是实施例1中159株艰难梭菌菌株clinprotools软件分析的质谱图。

图2是实施例1中159株艰难梭菌菌株的mlst分型结果柱状图。

图3是实施例3中编号38-1样品的质谱图。

图4是实施例3中编号81-1样品的质谱图。

图5是实施例3中编号90-1样品的质谱图。

图6是实施例3中编号3-1样品的质谱图。

图7是实施例3中编号45-1样品的质谱图。

图8是实施例3中编号86-1样品的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂为市售分析纯或化学纯。

实施例1

样品：159株艰难梭菌均来自河北省医学微生物菌种保藏中心(hbcmcc)，其中152株艰难梭菌采用随机数字表的方法随机选取自2010到2014年收集的腹泻患者和健康人群分离菌株(65株收集于腹泻患者，87株收集于健康成人或儿童)，另包含7株已知不同st型的艰难梭菌标准菌株(atccbaa-1870，atccbaa-1382，atccbaa-1812，atccbaa-1804，atcc9689，atcc43255和atcc43598)。

菌株保存于hbcmcc超低温冰箱，使用前进行菌株复苏，将菌株接种于哥伦比亚血琼脂平板(英国oxoid公司)中，37℃厌氧环境下培养48小时，48小时后，刮取形态典型的单个菌落进行第二次传代，相同条件下培养48小时后用于下面的实验。

所用试剂：

α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)，美国sigma公司；色谱级无水乙醇，美国sigma公司；色谱级乙腈，美国sigma公司；色谱级甲酸，美国sigma公司；三氟乙酸(tfa)，美国sigma公司；bruker细菌测试蛋白标准品，德国brukerdaltonics公司。

所用仪器：

vitekms全自动快速微生物质谱检测系统，法国biomérieux公司；

microflexlt基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，德国brukerdaltonics公司。

按照如下方法对各样品进行测试。

maldi-tof样品准备：

挑取适量(5-10mg)新鲜培养的细菌充分悬浮于300μl超纯水中，再加入900μl无水乙醇，充分混匀后，12000×g离心2min，弃去上清液(尽量去除乙醇和水)，向沉淀中加入20μl70％甲酸水溶液，混匀，再加入20μl乙腈并充分混匀，12000×g离心2min，将含有细菌蛋白质提取物的1μl上清液转移到样品靶板上，室温下干燥，之后，将1μlchca基质覆盖在样品靶板上，避风干燥，即得到maldi-tofms测试样品。

数据获取：用vitekms全自动快速微生物质谱检测系统和microflexlt基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪分别对159株艰难梭菌样品进行检测。

vitekms：n2激光，λ＝337nm，线性阳离子模式，vitekms(2.0)软件用于质谱数据采集，釆集的质量范围为：2000-20000da；参数设定为：离子源电压，20kv；透镜电压，6kv；延时提取，200ns；激光频率，50.0hz；545shots叠加形成一张谱图；大肠杆菌atcc8739用于质量校准及仪器参数优化。

microflexlt：n2激光，λ＝337nm，线性阳离子模式，flexcontrol3.0软件用于质谱数据采集，釆集的质量范围为2000-20000da；参数设定为：源1电压，20kv；源2电压，18.5kv；透镜电压，8.45kv；延时提取，320ns；激光频率，20.0hz；50shots釆集一个样品结晶点，平均每个样本结晶点釆集10次，500shots叠加形成一张谱图(保证每张总谱图峰强度达到10000以上)；bruker细菌测试蛋白标准品用于质量校准及仪器参数优化。

数据分析：

检测质谱图中在m/z3235～3245和m/z3280～3290处是否存在蛋白峰，质谱图中信噪比大于4的峰为有效的蛋白峰，或者导出包含峰列表的txt文件，观察是否含有m/z3235～3245和m/z3280～3290蛋白峰。

鉴定结果：159株艰难梭菌中有21株菌的质谱图中同时在m/z3235～3245和m/z3280～3290处存在蛋白峰，由此确定，该21株菌为st37型艰难梭菌或其单位点变异型st81，且采用两种设备所测得的结果相同。将这21株艰难梭菌的质谱检测数据归为一组，将其余138株艰难梭菌的质谱检测数据归为另一组，将两组数据导入clinprotools软件中，得到159株艰难梭菌的clinprotools软件分析的质谱图，如图1，图1中可以看出，由上述21株艰难梭菌质谱检测数据得到的曲线中，在m/z3240和m/z3285处同时出现特异性蛋白峰，由上述138株艰难梭菌质谱检测数据得到的曲线中，在m/z3240和m/z3285处均不存在有效的蛋白峰。

对上述159株艰难梭菌进行mlst分型，以验证上述结果，具体步骤如下：

管家基因的扩增与测序：根据griffiths等的方案，选取7个管家基因(adk、atpa、dxr、glya、reca、sod、tpi)进行pcr扩增。反应体系：2×taqmastermix25μl，上、下游引物(10pmol/l)各1μl，dna模板2μl，ddh2o21μl。反应程序：94℃预变性15min，然后94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸70s，共35个循环，最后72℃再延伸5min。扩增产物送上海生物工程有限公司和北京华大基因研究中心测序，测序峰图用chromas软件读取。

管家基因的比对：扩增序列提交到网络开源数据库(http://pubmlst.org/cdifficile/)中进行比对，每个位点得到相应的等位基因号，并形成相应的等位基因谱，判断该菌株的st。若出现新的等位基因型以及等位基因谱，则对相应的菌株进行2次以上重复试验，并送往不同公司测序，从而避免由于失误导致的假的新基因型。

结果显示，采用本发明方法鉴定出来的21株菌中有20株为st37型艰难梭菌和1株st81型艰难梭菌，其他的138株菌中均不是st37型或st81型菌株，由此可见，本发明方法将159株艰难梭菌中所有的st37型艰难梭菌及其单位点变异型st81型准确地鉴定出来，鉴定结果准确率高达100％。159株艰难梭菌的mlst分型结果见图2。

实施例2

样品：从收集于不同国家和地区(包括中国内地、中国香港、韩国、新加坡、澳大利亚)的艰难梭菌菌株中随机选取3株st35型艰难梭菌，4株st2型艰难梭菌，3株st3型艰难梭菌，1株st8型艰难梭菌，4株st54型艰难梭菌，1株st139型艰难梭菌，1株st81型艰难梭菌和22株st37型艰难梭菌，上述菌株均来自hbcmcc。

所用试剂：同实施例1。

所用仪器：vitekms全自动快速微生物质谱检测系统，法国biomérieux公司。

按照如下方法对各样品进行测试。

maldi-tof样品准备：方法同实施例1。

数据获取：

vitekms：同实施例1。

数据分析：检测质谱图中m/z3235～3245和m/z3280～3290处是否存在蛋白峰，或者导出包含峰列表的txt文件，观察是否含有m/z3235～3245和m/z3280～3290蛋白峰。

鉴定结果见表1，表中39株不同来源菌株的试验结果显示，21株st37型菌株和1株st81型菌株被正确鉴定出来，鉴定结果的准确率高达95.6％(22/23)。

表1各样品鉴定结果

注：“+”代表该菌株的质谱图中在m/z3235～3245和m/z3280～3290处存在的蛋白峰，“-”代表该菌株的质谱图中在m/z3235～3245和m/z3280～3290处不存在蛋白峰。

实施例3

样品：从收集于不同年份(2010年、2012年、2014年)的艰难梭菌菌株中随机选取2株st37型艰难梭菌(分别编号38、90)、1株st81型艰难梭菌(编号81)、1株st3型艰难梭菌(编号3)、1株st102型艰难梭菌(编号45)和1株st348型艰难梭菌(编号86)，共6株菌株，上述菌株均来自hbcmcc，各菌株编号、型别和收集年份见表2。

表2菌株信息

由三位实验人员分别在不同时间重复对这6株艰难梭菌进行接种传代两次，培养条件都是37℃厌氧培养48h(厌氧培养系统，广州尤德公司)。在每个菌株的第二次传代的培养基中随机挑选三个菌落，总共采集54个艰难梭菌菌落，作为鉴定样品，编号分别为38-1～38-9、90-1～90-9、81-1～81-9、3-1～3-9、45-1～45-9、86-1～86-9。

所用仪器、试剂、maldi-tof样品准备方法、数据获取均同实施例2。

数据分析：总共得到54张质谱图，检测质谱图中m/z3235～3245和m/z3280～3290处是否存在蛋白峰，或者导出包含峰列表的txt文件，观察是否含有m/z3235～3245和m/z3280～3290蛋白峰，结果见表3。

表3样品检测结果

注：“+”代表该菌株的质谱图中在m/z3235～3245和m/z3280～3290处存在的蛋白峰，“-”代表该菌株的质谱图中在m/z3235～3245和m/z3280～3290处不存在蛋白峰。

结果显示：编号38-1～38-9、90-1～90-9、81-1～81-9的样品对应的质谱图中均同时在m/z3235～3245和m/z3280～3290处出现蛋白峰而被鉴定出来，编号3-1～3-9、45-1～45-9、86-1～86-9的样品对应的质谱图中均没有在m/z3235～3245和m/z3280～3290处同时出现蛋白峰而被区分出来。图3～8为部分样品的质谱图，图3为编号38-1样品的质谱图，图中在m/z3244处和m/z3286处同时出现特异性的蛋白峰，图4是编号81-1样品的质谱图，图中在m/z3243处和m/z3285处同时出现特异性的蛋白峰，图5是编号90-1样品的质谱图，图中在m/z3245处和m/z3284处同时出现特异性的蛋白峰；图6～8依次为编号3-1、45-1、86-1样品的质谱图，图中在m/z3235～3245和m/z3280～3290处均未出现蛋白峰。

上述试验表明：本发明方法能够准确地将st37型艰难梭菌及其单位点变异型st81鉴定出来，且不同操作人员和不同检测时间对鉴定结果没有影响，m/z3235～3245和m/z3280～3290蛋白峰有很高的重现性。