本发明涉及一种微小隐孢子虫感染的检测方法，进一步讲是公开了一种基于病毒抗体检测的隐孢子虫感染间接elisa试剂盒，同时还提供了其制备方法，属于免疫学检测技术领域。
背景技术：
隐孢子虫是引起腹泻为主要临床症状的严重人兽共患性寄生虫，呈世界性分布，对全球公共卫生安全产生重大威胁。微小隐孢子虫病毒（cryptosporidiumparvumvirus,cspv）是一种dsrna病毒，到目前为止的所有报道中，发现微小隐孢子虫病毒特有的存在于人隐孢子虫（c.homini）和微小隐孢子虫（c.parvum）中，人感染隐孢子虫病大多数是由人隐孢子虫（c.homini）和微小隐孢子虫（c.parvum）两种隐孢子虫类型引起，所以利用cspv对c.parvum和c.hominis进行检测和流行病学调查可以有效的预防隐孢子虫病，对人类的身体健康和畜牧业的发展具有重要的意义。
目前用于微小隐孢子虫病诊断方法有很多，例如：病原学诊断方法操作简单是一种直接检测虫体的方法，但危险性也较高并且敏感性低，易误诊或漏诊；分子生物学方法敏感性高但对实验仪器及人员要求较高。而酶联免疫吸附试验（elisa）具有敏感性高、特异性强、重复性好、操作简单并且适用于检测样品多的基层单位等优点而被广泛应用。
cspv在微小隐孢子虫中存在稳定，且数量较多，每个微小隐孢子虫子孢子中大约有500个病毒颗粒，所以可以通过检测cspv而去检测微小隐孢子虫卵囊，且灵敏度大约在2000倍左右（一个卵囊包含4个子孢子），为未来检测cspv方法的建立提供了依据，而且微小隐孢子虫病毒可刺激宿主机体产生抗体，所以检测cspv抗体可作为微小隐孢子虫感染重要诊断指标，并且提高了elisa方法的特异性及敏感性。本发明包被制备的cspv衣壳蛋白，建立检测cspv抗体间接elisa方法，且目前用基于微小隐孢子虫cspv病毒抗体建立间接elisa方法检测动物微小隐孢子虫感染未见报道。
技术实现要素：
本发明提供一种基于病毒抗体检测的隐孢子虫感染间接elisa试剂盒，基于cspv建立一种检测微小隐孢子虫感染的方法，以检测牛微小隐孢子虫感染为示例，利用cspv衣壳蛋白和hrp标记的兔抗牛igg，建立了检测牛微小隐孢子虫感染的间接elisa方法并组装试剂盒。
本发明进一步提供了检测检测牛微小隐孢子虫感染间接elsia剂盒的制备方法，该方法简单、方便、敏感性高、特异性强、重复性好。适用于临床应用。
本发明所述的一种基于病毒抗体检测的隐孢子虫感染间接elisa试剂盒，其主要由以下部分组成：
主要包括捕获抗原、hrp标记的检测抗体、包被液、样品稀释液及洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液、牛微小隐孢子虫感染阳性血清（阳性对照）、参考阴性血清（阴性对照）、可拆聚苯乙烯塑料反应板等，具体如下。
1、捕获抗原为微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白；
2、检测抗体为hrp标记的兔抗牛igg；
3、包被液是0.05m碳酸盐缓冲液，ph值为9.6；
4、样品稀释液（pbs）为磷酸盐缓冲液；
5、洗涤液（pbst）为含有0.5%tween-20磷酸盐缓冲液；
6、封闭液为5%脱脂奶粉；
7、底物显色液为tmb底物溶液；
8、终止液为2mol/l的h2so4溶液。
本发明所述的检测牛微小隐孢子虫感染的间接elisa试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
将cspv-s蛋白包被于酶标板，形成固相载体，洗涤除去游离抗原，加入待检牛微小隐孢子虫感染血清，抗体可与固相载体上的cspv-s蛋白结合，形成三明治夹心结构，再次洗去游离部分或结合不牢固的部分，加入hrp标记兔抗牛igg，与酶标板上的抗原-抗体复合物相结合，洗板除去游离部分或结合不牢固的部分。加入tmb底物显色液，后终止反应。酶标仪测定在450nm波长时的吸光度值（od450nm值），终止反应后颜色的深浅，od450nm值大小与相应的待检样品中的微小隐孢子虫感染的程度多少呈正相关关系。
本发明积极效果在于：利用cspv-s蛋白和hrp标记的兔抗牛igg，cspv-s蛋白作为捕获抗原，hrp标记的兔抗牛igg作为检测抗体，建立间接elisa方法，该方法操作简单快捷、稳定性高、特异性强、灵敏性好，并且该检测试剂盒还有检测成本低廉。另外试剂盒中的主要试剂以工作液的形式提供，无需稀释，使用方便。该发明解决了临床上检测和诊断疾病时间紧、待检样品数量大等问题，同时为控制微小隐孢子虫病的发生提供了依据。
具体实施方式：
本发明与以下实施例作进一步说明，但本发明的内容不局限于以下的实施例中。
实施例1：
间接elisa方法的建立
1、包被抗原最佳量与血清抗体最佳稀释比例的确定：
采用棋盘方阵的方法，用cspv-s蛋白作为捕获抗原按2μg倍比稀释至0.0625μg横向包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜。次日甩板并用pbst洗3次，每次3min。用pbst稀释的5%的脱脂奶粉作为封闭剂，100μl/孔，37℃孵育2h。洗板同上，将牛微小隐孢子虫感染阳性与阴性血清均用pbst按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200进行稀释后纵向而后加入酶标板100μl/孔，37℃孵育2h。洗板同上，将hrp标记的兔抗牛igg加入酶标板，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板同上，加tmb底物显色液100μl/孔，37℃孵育15min。加2mol/lh2so4100μl/孔终止反应，测定od450nm值。要设定空白对照、阳性对照（p）和阴性对照（n），后选择包被抗原最佳量与待检血清的最佳工作浓度。包被抗体的最佳量是0.5μg，血清最佳稀释度为1:100（见表1）。
表1包被抗原最佳量与血清抗体最佳稀释比例的确定
2、最佳封闭剂的选择：
在已确定的最佳包被抗原、血清的稀释浓度下，选用4种封闭剂（包括5%脱脂奶粉、10%兔血清、1%明胶、1%bsa）进行封闭。5%脱脂奶粉的为最佳封闭剂（见表2）。
表2最佳封闭剂的选择
3、hrp标记的兔抗牛igg工作浓度确定：
将hrp标记的兔抗牛igg分别进行1：3000、1:4000、1：5000、1:6000、1:7000、1:8000，比例稀释进行试验，确定酶标抗体最佳工作浓度为1:4000（见表3）。
表3hrp标记的兔抗牛igg工作浓度确定
4、底物反应时间的确定：
底物反应时间按5min、10min、15min、20min分别设置梯度。当底物反应时间为37℃温箱中显色10min时的p/n值最大，即最佳反应时间（见表4）。
表4底物反应时间的确定
5、间接elisa临界值的判定：
经检测已知的16阴性血清od450nm值，所得到的平均od450nm值（x）为0.16978，标准差（sd）为0.03759根据统计学原理，测定样品od450nm值后，其阴阳性临界值为x+3sd=0.28255避免阳性的出现，在临界值上加减一个标准差作为可疑区间。因此当od450nm≥0.32015为阳性；当od450nm＜0.24496品判定为阴性；当0.24496＜od450nm＜0.32015定为疑似阳性，需要对疑似样品重新检测。重检的样品，平均od450nm值≥0.24496阳性。
6、性能的测定：
（1）敏感性试验
在其他条件不变的情况下，采用已经确定的间接elisa方法，将牛微小隐孢子虫感染阳性血清按1:100到1:12800倍比稀释。判断该方法的敏感性。该方法的灵敏性为1:3200（见表5）。
表5敏感性试验
（2）特异性试验
经间接elisa方法，以牛微小隐孢子虫感染阳性血清和阴性血清作为参照，检测牛新孢子虫血清和牛泰勒虫血清，进行血清交叉反应试验，确定该方法的特异性（见表6），结果表明该有较高特异性。
表6特异性实验
（3）重复性试验：
应用已经建立的检测牛微小隐孢子虫感染的间接elisa方法进行重复性试验，对已知的8份阳性血清，3份阴性血清分别进行批内、批间重复性试验。经计算得到该elisa方法的批内重复和批间重复试验的变异系数均小于6%，表明该方法具有良好的重复性。（表7）
表7重复性实验
实施例2
检测牛血清中微小隐孢子虫感染间接elisa试剂盒的组装
elisa检测试剂盒包括以下组分：
1、捕获抗原与检测抗体分别为cspv-s蛋白和hrp标记的兔抗牛igg；
2、包被液（ph值9.6的0.05m碳酸盐缓冲液）：秤取1.59gnaco3；2.93gnahco3；80ml蒸馏水，待其溶解后，调ph值9.6，定容至100ml，4℃保存备用；
3、封闭液：（5%脱脂奶粉溶液）称取5g脱脂奶粉加入pbst定溶至100ml；
4、样品稀释液(pbs)：称取8gnacl；0.2gkcl；2.9gnahpo4.12h2o；0.2gkh2po4；调ph值7.4，定容至1000ml；
5、洗涤液（pbst）：在1lpbs的基础上加入0.5ml的tween-20即可；
6、tmb底物显色液：按底物a液（称取200mgtmb，加入100ml无水乙醇，调ph值5.0，加双蒸水定容至1000ml），与底物b液（称取9.33g柠檬酸，14.60gna2hpo4，加入6.4mlh2o2，调ph值5.0，加双蒸水定容至1000ml）1:1加入显色；
7、终止液：浓硫酸22.2ml；蒸馏水178.8ml；
8、标准微小隐孢子虫感染血阳性清；
9、标准阴性血清；
10、将上述材料组装。
保存条件：标准阴、阳性血清、cspv-s蛋白和hrp标记的兔抗牛igg为-20℃保存。试剂盒其余组分的保存温度为4℃保存。
实施例3
间接elisa检测试剂盒对牛微小隐孢子虫感染的检测
利用建立的间接elisa试剂盒对长春地区的96份样品检测，其步骤如下：
1、抗原按0.5ug/孔包被于酶标板中，37℃孵育2h；
2、甩干板内液体，洗涤液洗涤3次，3min/次；
3、加入封闭液，100ul/孔，每个样品2个重复，37℃孵育2h；
4、甩干板内液体，洗涤液洗涤3次，3min/次；
5、加待检样品：加入用pbs按1:100稀释的待检样品，100ul/孔，每个样品3个重复，37℃孵育2h；
6、甩干板内液体，洗涤液洗涤3次，3min/次；
7、加检测抗体：用pbst按1:4000稀释检测抗体100ul/孔，加入酶标板37℃孵育1h；
8、甩干板内液体，洗涤液洗涤4-5次，3min/次；
9、显色：加入tmb底物显色液，100ul/孔，37℃孵育10min；
10、加入终止液，100ul/孔；
11、测od值：用酶标仪测定od450值；
12、结果判定：以空白对照孔调零后测各孔值,测定od450nm值后，依据公式：当od450nm≥0.32015为阳性；当od450nm＜0.24496品判定为阴性；当0.24496＜od450nm＜0.32015定为疑似阳性，需要对疑似样品重新检测。重检的样品，平均od450nm值≥0.24496阳性。
结果：对长春地区的96份样品检测，显示有19份为阳性血清，阳性率为19.79%（19/96）。
序列表
<110>吉林大学
<120>基于病毒抗体检测的隐孢子虫感染间接elisa试剂盒
<141>2017-08-28
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>960
<212>dna
<213>隐孢子虫病毒(cryptosporidiumvirus)
<400>1
atgattacaagttttgaatcaatagagaaaaagaatgcagtttactatccagtggatttg60
aaatttgtcactgacttatcttcagatctttcgaatacggctgacggattaggccaggct120
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