一种血清IFN‑γ和LncRNAs组合物用于制备胃癌诊断试剂盒的用途的制作方法

本发明属于基因诊断领域，涉及诊断试剂盒的开发，具体涉及一种血清ifn-γ和lncrnas组合物用于制备胃癌诊断试剂盒的用途。

背景技术：

胃癌在我国发病率居恶性肿瘤第2位，死亡人数占癌症人数14.33％，居第3位，仅次于肺癌和肝癌。由此可见，胃癌是肿瘤防治的重点。随着肿瘤标志物广泛应用于临床，越来越多学者研究发现，在癌症防治过程中肿瘤标志物发挥重要的作用。ifn-γ是参与免疫调节的重要细胞因子，一般由活化的t淋巴细胞分泌，能够影响肿瘤细胞的生长。ifn-γ在肿瘤患者体内表达水平明显异常。基于此，已有多项研究将ifn-γ作为肿瘤诊断的标志物。

已有研究将血清ifn-γ作为诊断标志物用于诊断胃癌(血清ifn-γ和肿瘤标志物联合检测对胃癌的诊断价值，生物医学工程与临床2016年3月第20卷第2期)，但是，单独使用血清ifn-γ诊断胃癌的准确度较低，临床价值低。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供血清ifn-γ和lncrnas组合物用于制备胃癌诊断试剂盒的用途，以提高临床诊断胃癌的准确度。

本发明通过下面的技术方案得以实现：

ifn-γ和lncrnanonhsat089447或lncrnanonhsat041499联合用于制备诊断胃癌的诊断组合物的用途。

ifn-γ和lncrnanonhsat089447、lncrnanonhsat041499联合用于制备诊断胃癌的诊断组合物的用途。

优选地，所述ifn-γ、lncrnanonhsat089447、lncrnanonhsat041499为血清ifn-γ、nonhsat089447、nonhsat041499。

ifn-γ和lncrnanonhsat089447或lncrnanonhsat041499联合用于制备诊断胃癌的诊断试剂盒的用途。

ifn-γ和lncrnanonhsat089447、lncrnanonhsat041499联合用于制备诊断胃癌的诊断试剂盒的用途。

优选地，所述ifn-γ、lncrnanonhsat089447、lncrnanonhsat041499为血清ifn-γ、nonhsat089447、nonhsat041499。

本发明的优点：

单独使用血清ifn-γ诊断区分胃癌与健康志愿者时，roc曲线下面积(auc)为0.636。本发明发现，使用血清nonhsat089447或nonhsat041499与血清ifn-γ联合诊断区分胃癌与健康志愿者时，auc可以提高到0.793或0.805；使用血清nonhsat089447和nonhsat041499与血清ifn-γ联合诊断区分胃癌与健康志愿者时，auc可以提高到0.921。本领域技术人员知道，roc曲线下面积在1.0和0.5之间，在auc>0.5的情况下，auc越接近于1，说明诊断效果越好。auc在0.5-0.7时有较低准确性，auc在0.7-0.9时有一定准确性，auc在0.9以上时有较高准确性。因此，血清ifn-γ可以联合血清nonhsat089447和/或nonhsat041499用于制备诊断胃癌的诊断试剂盒。

附图说明

图1为血清ifn-γ单独诊断区分胃癌患者与健康志愿者的roc曲线；

图2为血清ifn-γ联合nonhsat089447诊断区分胃癌患者与健康志愿者的roc曲线；

图3为血清ifn-γ联合nonhsat041499诊断区分胃癌患者与健康志愿者的roc曲线；

图4为血清ifn-γ联合血清nonhsat089447和血清nonhsat041499诊断区分胃癌患者与健康志愿者的roc曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步介绍本发明的技术方案。

一、实验材料

胃癌患者血清标本取自东南大学附属中大医院胃癌手术后患者。所有患者术前均未接受放射治疗、化学治疗及抗肿瘤药物等治疗，均有完整的临床及病理资料。胃癌患者138例(胃癌组)，其中女性63例，男性75例；年龄35-75岁，平均年龄63.3岁。

健康志愿者血清标本55例(正常对照组)，其中女性26例，男性29例；年龄35-70岁，平均年龄61.5岁。

胃癌组和正常对照组间年龄和性别构成差异无统计学意义。

ifn-γ检测酶联免疫吸附分析(elisa)试剂盒购于raybiotech公司。

二、实验方法

1、血清ifn-γ测定方法

ifn-γ检测采用elisa方法，按照试剂盒说明严格执行。

2、血清lncrnas测定方法

取血清200μl，使用tiangen公司的rnapreppure试剂盒提取总rna。实验过程中应尽可能减少rna降解，以获得纯度和质量均较高、无蛋白和其它杂质污染的rna。用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析rna的完整性，紫外分光光度法检测rna浓度。

使用tiangen公司的tianscriptcdna第一链合成试剂盒和oligo(dt)15通用逆转录引物进行逆转录反应。反转录总体系为20μl：1-5μg总rna，2μloligo(dt)15，2μlsuperpuredntps，补rnase-freeddh2o至14.5μl。反应管置70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min，加入4μl5xfirststrandbuffer(含有dtt)，0.5μlrnasin，1μltianscriptm-mlv，轻轻用移液器混匀，42℃温浴50min。95℃加热5min终止反应，反应产物于-20℃保存备用。

根据genbank目的基因序列，用引物设计软件primerpremier5.0设计nonhsat089447、nonhsat041499特异性引物，由上海生工公司合成。内参引物hs-actb(β-actin)购自上海生工公司。反应体系(20μl)：sybrselectmastermix10μl，cdna2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddh2o6μl。使用abi公司的7500fast荧光定量检测仪进行检测。反应参数：50℃2min；95℃2min，95℃15s，60℃15s，72℃1min，共45个循环。溶解曲线参数：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。每份样品重复测定3次，获得ct值。以actb的拷贝数作为校正基数，计算各样本中各lncrnas的相对内参表达量，即为该样品中目标lncrnas的相对表达量。

nonhsat089447、nonhsat041499特异性引物如下：

nonhsat089447上游：5’-gtagggcttggatggacttt-3’；

nonhsat089447下游：5’-ccgtcaacacatcaggcct-3’；

nonhsat041499上游：5’-cgattttgggaacctctatc-3’；

nonhsat041499下游：5’-caactgctgggtggagtcta-3’。

3、统计学处理

采用spss20.0软件进行分析，以均值±偏差表示，组间比较采用t检验。评价各项指标应用价值，绘制受试者工作特征(roc)曲线，并计算曲线下面积(auc)；以p＜0.05为差异有统计学意义。采用roc曲线评价各单项指标及联合指标对胃癌的诊断价值。

三、实验结果

1、两组间肿瘤标志物水平的比较

胃癌组血清中ifn-γ水平明显低于正常对照组，胃癌组血清中nonhsat089447、nonhsat041499的相对表达水平均明显高于正常对照组，差异均有统计学意义(t值分别为1.413、2.034和1.935，p＜0.01)。比较结果如表1所示。

表1两组间肿瘤标志物水平的比较(均值±偏差)

2、肿瘤标志物检测胃癌roc曲线分析

单独使用血清ifn-γ诊断区分胃癌与健康志愿者时，roc曲线下面积(auc)为0.636。使用血清nonhsat089447或nonhsat041499与血清ifn-γ联合诊断区分胃癌与健康志愿者时，auc可以提高到0.793或0.805；使用血清nonhsat089447和nonhsat041499与血清ifn-γ三者联合诊断区分胃癌与健康志愿者时，auc可以提高到0.921，准确率高达92.23％。由此可见，血清ifn-γ联合nonhsat089447或nonhsat041499诊断胃癌具有一定的临床价值，血清ifn-γ联合nonhsat089447和nonhsat041499诊断胃癌具有较高的临床价值。两个或三个指标的roc曲线分析结合二元逻辑回归操作。

roc曲线分析结果如表2和图1-4所示。

表2血清ifn-γ单独及联合nonhsat089447和/或nonhsat041499诊断价值比较

本领域技术人员知道，roc曲线下面积在1.0和0.5之间，在auc>0.5的情况下，auc越接近于1，说明诊断效果越好。auc在0.5-0.7时有较低准确性，auc在0.7-0.9时有一定准确性，auc在0.9以上时有较高准确性。因此，血清ifn-γ可以联合血清nonhsat089447和/或nonhsat041499用于制备诊断胃癌的诊断试剂盒。