本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，提供了一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器的制备方法及应用。
背景技术：
肿瘤的发病率高，且不易察觉，我国病例数相当庞大，占全世界病例数的55%，且肿瘤的生长和转移的速度快，对人类的健康产生极大危害，然而肿瘤若在早期能够确诊治愈率还是很高的。肿瘤标志物与肿瘤有着密切的关系，通过检测人体血清中肿瘤标志物的含量来推测是否患有肿瘤已经成为一种人们广泛认可的方法。
目前电化学免疫传感器已经广泛用于肿瘤标志物的检测，夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低廉等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物检测等领域都有重要的应用价值。
本发明中使用的rh@pt纳米枝晶不仅具有核壳状双金属的协同作用，还具有丰富的边缘和拐角处的原子，这使得rh@pt纳米枝晶具有优良的催化性。氨基化石墨烯纳米片具有较大的比表面积，能够负载大量的rh@pt纳米枝晶，同时氨基化石墨烯还具有优良的导电性，能够分散rh@pt纳米枝晶催化还原过氧化氢所产生的电子，以防止由于电子聚集而引起催化反应减缓。此外，rh@pt纳米枝晶的引入不仅使复合材料的导电性性得到了明显的提高，还能有效防止了石墨烯的堆叠。因此，rh@pt纳米枝晶复合材料作为信号放大器能够提高传感器的灵敏度。聚吡咯作为导电聚合物，能加速电子传导，在形成聚吡咯-金纳米粒子后不仅具有聚吡咯的高导电性，还具有了良好的生物相容性，能够很好的固载捕获抗体，同时金纳米粒子的加入进一步提高了聚吡咯的导电性。
技术实现要素：
本发明提供了一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的定量检测。
本发明的目的之一是提供一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器应用于肿瘤标志物的特异性、定量检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
1.一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为3~5mm的玻碳电极用al2o3抛光粉打磨，超纯水、乙醇清洗干净；
（2）取6µl、1~3mg/ml的聚吡咯-金纳米粒子修饰到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6µl、8~12µg/ml的肿瘤标志物捕获抗体ab1滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3µl、0.5~1wt%的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到电极表面，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（5）滴加6µl、0.0001~5ng/ml的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原ag溶液，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（6）将6µl、1~3mg/ml的rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中孵化40min后用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗电极，4℃冰箱中干燥，制得一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料的免疫传感器。
2.所用聚吡咯-金纳米粒子、rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液的制备
（1）聚吡咯-金纳米粒子的制备
①聚吡咯的合成
取0.5~1.5ml吡咯分散在25ml、0.5~1.5mol/l的盐酸里，得吡咯和盐酸的混合液；取10ml吡咯和盐酸的混合液，搅拌条件下加入2ml、1mol/l的过硫酸铵，冰浴反应4~6h，离心分离，室温干燥得到聚吡咯；
②聚吡咯-金纳米粒子的合成
取1ml、0.8~1.2wt%的氯金酸溶液加入到99ml超纯水中，加热至微沸，加入2.5ml、0.5~1.5wt%的柠檬酸钠溶液，保持微沸状态15min后，冷却至室温，得到金纳米粒子分散液，将其转移到4℃下保存备用；将20~30ml上述制备的金纳米粒子分散液离心分离，重新分散在10ml的超纯水中，加入10mg聚吡咯，在振荡培养箱中振荡12h，离心分离，室温干燥，得聚吡咯-金纳米粒子；
（2）rh@pt纳米枝晶复合材料制备
①rh@pt纳米枝晶的合成
取0.21g柠檬酸钠和0.2~0.3g十六烷基三甲基氯化铵加入到9ml超纯水中，搅拌5min，依次加入0.1ml、0.1mol/l的三氯化铑，0.9ml、0.08~0.12mol/l的氯铂酸，搅拌15min后，加入1ml甲醛，将混合液转入高压反应釜中，在180℃的条件之下反应40~60min，冷却至室温，离心分离，冷冻干燥，得rh@pt纳米枝晶；
②rh@pt纳米枝晶复合材料合成
取0.8g石墨粉加90~98ml、质量分数为98wt%的浓硫酸和10ml浓磷酸，搅拌25min后，加入4~5g高锰酸钾，搅拌15min后，加热至45~60℃，反应12h后，加40ml超纯水冻成的冰，再加0.5ml，20~30wt%的双氧水，搅拌20min后离心洗涤，加30ml超纯水，超声40min，离心分离，将上清液冷冻干燥得到氧化石墨烯；取0.1g氧化石墨烯放入小烧杯中，加40ml乙二醇，超声30min，加0.8~1ml浓氨水，将混合物转入高压反应釜，180℃下反应5h，冷却到室温，离心分离，室温下干燥得氨基化石墨烯；取15mg氨基化石墨烯和5~10mg的rh@pt纳米枝晶分散在10ml超纯水中，超声1h，离心分离得rh@pt纳米枝晶复合材料；
（3）rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液的制备
将1~4mg的负载rh@pt纳米枝晶的氨基化石墨烯分散到1ml超纯水中，加入100µl、80~120µg/ml的肿瘤标志物检测抗体ab2溶液和900µl、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；在4℃下，6000rpm转速下离心10min，得下层沉淀，加入1ml、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤，得下层沉淀，最后加入1ml、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液，制得rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液，4℃下保存备用。
3.肿瘤标志物的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10ml、50mmol/l的ph为5.3~8.0的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4v，取样间隔0.1s，运行时间400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10ml、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10µl、5mol/l的双氧水溶液，记录电流变化。
上述所述肿瘤标志物选自下列之一：afp、cea、psa。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明使用了聚吡咯-金纳米粒子，聚吡咯造价低廉，具有优良的导电性，能够加速电子转移，金纳米粒子能够进一步提高聚吡咯的导电性，同时聚吡咯呈现薄片状，具有较大的比表面积，能够负载较多的金纳米粒子，这使得聚吡咯-金纳米粒子不仅具有优良的导电性，还具有了良好的生物相容性，同时金纳米粒子的加入也增加了聚吡咯在水中的分散性；
（2）采用rh@pt纳米枝晶复合材料作为检测抗体标记物，rh@pt纳米枝晶能够防止石墨烯的堆叠，提高石墨烯在水中的分散性，此外rh@pt纳米枝晶具有较多的边缘和拐角，增大了比表面积，具有较多的活性位点，能够更好地催化过氧化氢的还原，同时基于铂-氨之间的作用rh@pt纳米枝晶能够很好的固载抗体，实现了放大电化学信号的作用，从而提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；
（3）一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器对肿瘤标志物的检测，其线性范围0.0001~5ng/ml，检测限最低0.033pg/ml，表明一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器可以达到定量检测的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器的制备
（1）将直径为3mm的玻碳电极用al2o3抛光粉打磨，超纯水、乙醇清洗干净；
（2）取6µl、1mg/ml的聚吡咯-金纳米粒子修饰到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6µl、8µg/ml的肿瘤标志物捕获抗体ab1滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3µl、0.5wt%的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到电极表面，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（5）滴加6µl、0.0001~5ng/ml的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原ag溶液，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（6）将6µl、1mg/ml的rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中孵化40min后用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗电极，4℃冰箱中干燥，制得一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器。
实施例2一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器的制备
（1）将直径为4mm的玻碳电极用al2o3抛光粉打磨，超纯水、乙醇清洗干净；
（2）取6µl、2mg/ml的聚吡咯-金纳米粒子修饰到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6µl、10µg/ml的肿瘤标志物捕获抗体ab1滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3µl、0.8wt%的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到电极表面，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（5）滴加6µl、0.0001~5ng/ml的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原ag溶液，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（6）将6µl、2mg/ml的rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中孵化40min后用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗电极，4℃冰箱中干燥，制得一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器。
实施例3一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器的制备
（1）将直径为5mm的玻碳电极用al2o3抛光粉打磨，超纯水、乙醇清洗干净；
（2）取6µl、3mg/ml的聚吡咯-金纳米粒子修饰到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6µl、12µg/ml的肿瘤标志物捕获抗体ab1滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3µl、1wt%的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到电极表面，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（5）滴加6µl、0.0001~5ng/ml的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原ag溶液，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（6）将6µl、3mg/ml的rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液，滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中孵化40min后用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗电极，4℃冰箱中干燥，制得一种基于rh@pt纳米枝晶复合材料免疫传感器。
实施例4聚吡咯-金纳米粒子的制备
（1）聚吡咯的合成
取0.5ml吡咯分散在25ml、0.5mol/l的盐酸里，得吡咯和盐酸的混合液；取10ml吡咯和盐酸的混合液，搅拌条件下加入2ml、1mol/l的过硫酸铵溶液，冰浴反应4h，离心分离，室温干燥得到聚吡咯；
（2）金纳米粒子分散液的制备
取1ml、0.8wt%的氯金酸溶液加入到99ml超纯水中，加热至微沸，加入2.5ml、0.5wt%的柠檬酸钠溶液，保持微沸状态15min后，冷却至室温，得到金纳米粒子分散液，将其转移到4℃下保存备用；
（3）聚吡咯-金纳米粒子的合成
将20ml上述制备的金纳米粒子分散液离心分离，重新分散在10ml的超纯水中，加入10mg聚吡咯，在振荡培养箱中振荡12h，离心分离，室温干燥，得聚吡咯-金纳米粒子。
实施例5聚吡咯-金纳米粒子的制备
（1）聚吡咯的合成
取1ml吡咯分散在25ml、1mol/l的盐酸里，得吡咯和盐酸的混合液；取10ml吡咯和盐酸的混合液，搅拌条件下加入2ml、1mol/l的过硫酸铵溶液，冰浴反应5h，离心分离，室温干燥得到聚吡咯；
（2）金纳米粒子分散液的制备
取1ml、1wt%的氯金酸溶液加入到99ml超纯水中，加热至微沸，加入2.5ml、1wt%的柠檬酸钠溶液，保持微沸状态15min后，冷却至室温，得到金纳米粒子分散液，将其转移到4℃下保存备用；
（3）聚吡咯-金纳米粒子的合成
将25ml上述制备的金纳米粒子分散液离心分离，重新分散在10ml的超纯水中，加入10mg聚吡咯，在振荡培养箱中振荡12h，离心分离，室温干燥，得聚吡咯-金纳米粒子。
实施例6聚吡咯-金纳米粒子的制备
（1）聚吡咯的合成
取1.5ml吡咯分散在25ml、1.5mol/l的盐酸里，得吡咯和盐酸的混合液；取10ml吡咯和盐酸的混合液，搅拌条件下加入2ml、1mol/l的过硫酸铵溶液，冰浴反应6h，离心分离，室温干燥得到聚吡咯；
（2）金纳米粒子分散液的制备
取1ml、1.2wt%的氯金酸溶液加入到99ml超纯水中，加热至微沸，加入2.5ml、1.5wt%的柠檬酸钠溶液，保持微沸状态15min后，冷却至室温，得到金纳米粒子分散液，将其转移到4℃下保存备用；
（3）聚吡咯-金纳米粒子的合成
将30ml上述制备的金纳米粒子分散液离心分离，重新分散在10ml的超纯水中，加入10mg聚吡咯，在振荡培养箱中振荡12h，离心分离，室温干燥，得聚吡咯-金纳米粒子。
实施例7rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液的制备
（1）rh@pt纳米枝晶的合成
取0.21g柠檬酸钠和0.2g十六烷基三甲基氯化铵加入到9ml超纯水中，搅拌5min，依次加入0.1ml、0.1mol/l的三氯化铑，0.9ml、0.08mol/l的氯铂酸，搅拌15min后，加入1ml甲醛，将混合液转入高压反应釜中，在180℃的条件之下反应40min，冷却至室温，离心分离，冷冻干燥，得rh@pt纳米枝晶；
（2）氨基化石墨烯的合成
取0.8g石墨粉加90ml、98wt%的浓硫酸和10ml浓磷酸，搅拌25min后，加入4g高锰酸钾，搅拌15min后，加热至45℃，反应12h后，加40ml超纯水冻成的冰，再加0.5ml，20wt%的双氧水，搅拌20min后离心洗涤，加30ml超纯水，超声40min，离心分离，将上清液冷冻干燥得到氧化石墨烯；取0.1g氧化石墨烯放入小烧杯中，加40ml乙二醇，超声30min，加0.8ml浓氨水，将混合物转入高压反应釜，180℃下反应5h，冷却到室温，离心分离，室温下干燥得氨基化石墨烯；
（3）rh@pt纳米枝晶复合材料合成
取15mg氨基化石墨烯和5mg的rh@pt纳米枝晶分散在10ml超纯水中，超声1h，离心分离得rh@pt纳米枝晶复合材料；
（4）rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液的制备
将1mg的rh@pt纳米枝晶复合材料分散到1ml超纯水中，加入100µl、80µg/ml的肿瘤标志物检测抗体ab2溶液和900µl、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；在4℃下，6000rpm转速下离心10min，得下层沉淀，加入1ml、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤，得下层沉淀，最后加入1ml、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液，制得rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液，4℃下保存备用。
实施例8rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液的制备
（1）rh@pt纳米枝晶的合成
取0.21g柠檬酸钠和0.25g十六烷基三甲基氯化铵加入到9ml超纯水中，搅拌5min，依次加入0.1ml、0.1mol/l的三氯化铑，0.9ml、0.1mol/l的氯铂酸，搅拌15min后，加入1ml甲醛，将混合液转入高压反应釜中，在180℃的条件之下反应50min，冷却至室温，离心分离，冷冻干燥，得rh@pt纳米枝晶；
（2）氨基化石墨烯的合成
取0.8g石墨粉加90~98ml、98wt%的浓硫酸和10ml浓磷酸，搅拌25min后，加入4.5g高锰酸钾，搅拌15min后，加热至50℃，反应12h后，加40ml超纯水冻成的冰，再加0.5ml，25wt%的双氧水，搅拌20min后离心洗涤，加30ml超纯水，超声40min，离心分离，将上清液冷冻干燥得到氧化石墨烯；取0.1g氧化石墨烯放入小烧杯中，加40ml乙二醇，超声30min，加0.9ml浓氨水，将混合物转入高压反应釜，180℃下反应5h，冷却到室温，离心分离，室温下干燥得氨基化石墨烯；
（3）rh@pt纳米枝晶复合材料合成
取15mg氨基化石墨烯和8mg的rh@pt纳米枝晶分散在10ml超纯水中，超声1h，离心分离得rh@pt纳米枝晶复合材料；
（4）rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液的制备
将2mg的rh@pt纳米枝晶复合材料分散到1ml超纯水中，加入100μl、100μg/ml的肿瘤标志物检测抗体ab2溶液和900µl、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；在4℃下，6000rpm转速下离心10min，得下层沉淀，加入1ml、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤，得下层沉淀，最后加入1ml、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液，制得rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液，4℃下保存备用。
实施例9rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液的制备
（1）rh@pt纳米枝晶的合成
取0.21g柠檬酸钠和0.3g十六烷基三甲基氯化铵加入到9ml超纯水中，搅拌5min，依次加入0.1ml、0.1mol/l的三氯化铑，0.9ml、0.12mol/l的氯铂酸，搅拌15min后，加入1ml甲醛，将混合液转入高压反应釜中，在180℃的条件之下反应60min，冷却至室温，离心分离，冷冻干燥，得rh@pt纳米枝晶；
（2）氨基化石墨烯的合成
取0.8g石墨粉加98ml、98wt%的浓硫酸和10ml浓磷酸，搅拌25min后，加入5g高锰酸钾，搅拌15min后，加热至60℃，反应12h后，加40ml超纯水冻成的冰，再加0.5ml，30wt%的双氧水，搅拌20min后离心洗涤，加30ml超纯水，超声40min，离心分离，将上清液冷冻干燥得到氧化石墨烯；取0.1g氧化石墨烯放入小烧杯中，加40ml乙二醇，超声30min，加1ml浓氨水，将混合物转入高压反应釜，180℃下反应5h，冷却到室温，离心分离，室温下干燥得氨基化石墨烯；
（3）rh@pt纳米枝晶复合材料合成
取15mg氨基化石墨烯和10mg的rh@pt纳米枝晶分散在10ml超纯水中，超声1h，离心分离得rh@pt纳米枝晶复合材料；
（4）rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液的制备
将4mg的rh@pt纳米枝晶复合材料分散到1ml超纯水中，加入100µl、120µg/ml的肿瘤标志物检测抗体ab2溶液和900µl、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；在4℃下，6000rpm转速下离心10min，得下层沉淀，加入1ml、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤，得下层沉淀，最后加入1ml、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液，制得rh@pt纳米枝晶复合材料肿瘤标志物检测抗体rh@pt/nh2-gs/ab2溶液，4℃下保存备用。
实施例10肿瘤标志物afp的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10ml、50mmol/l的ph为5.3的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4v，取样间隔0.1s，运行时间400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10ml、50mmol/l的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10µl、5mol/l的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）根据所得电流强度与afp浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得线性范围为0.0001~5ng/ml，检测限为0.033pg/ml。
实施例11肿瘤标志物cea的检测
按照实施例10的方法对样品中cea进行检测，其线性范围为0.001~5ng/ml，检测限为0.3pg/ml。
实施例12肿瘤标志物psa的检测
按照实施例10的方法对样品中psa进行检测，其线性范围为0.0005~5ng/ml，检测限为0.1pg/ml。