一种人兽共患隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸的制作方法

本发明涉及一种人兽共患隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸，是一种基于cspv病毒检测的人兽共患隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸，用于人兽共患隐孢子虫的检测，属于免疫学技术领域。

背景技术：

隐孢子虫病是由隐孢子虫引起的主要以腹泻为主要症状的人畜共患寄生虫病，该病呈全球流行，每年对全球畜牧业造成重大的经济损失，严重威胁人畜的健康。隐孢子虫可感染40多种动物，如牛、羊、犬、猫等均可作为该虫的保虫宿主，隐孢子虫病人和带虫者的粪便和呕吐物中均含有卵囊，都是重要的传染源,食用含隐孢子虫卵囊污染的食物或水是主要传播方式。近年来随着养牛业的迅猛发展，人类与牛的接触也随之增加，因此对牛感染该虫情况的动态监测、诊断并及时治疗，对预防和彻底根除隐孢子虫感染具有重大的意义。

隐孢子虫检测方法繁多且各有利弊，如病原检查法和血清学检查法应用效果较好，简便，易操作，但病原检查法敏感性和特异性都不强。分子生物学方法的特异性和敏感性都较高，但该方法的进行需要有先进的仪器和技术，很难推广，所以鉴于以上情况建立一种行之有效的诊断方法非常必要。

微小隐孢子虫病毒（cryptosporidiumparvumvirus,cspv）是一种dsrna病毒，到目前为止的所有报道中，发现所有感染人的隐孢子虫中均存在cspv，且cspv在微小隐孢子虫中存在稳定，数量较多，每个微小隐孢子虫子孢子中大约有500个病毒颗粒，一个卵囊包含4个子孢子，所以利用cspv检测隐孢子虫方法的灵敏度提升了2000倍之多，这也为后续cspv方法的建立提供了依据。

到目前为止，已经在人和260多种动物体内鉴定出30个隐孢子虫种和40多个基因型，其中在人体发现了21个种基因型，绝大多数人体隐孢子虫病是由微小隐孢子虫和人隐孢子虫引起，且均含有微小隐孢子虫病毒。由于cspv特异的存在于感染人的隐孢子虫类型中，故对cspv的检测可以作为人感染隐孢子虫的重要指标，且目前基于cspv病毒建立的隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸方法尚未见报道，该方法的建立为今后隐孢子虫的研究防控和公共卫生安全起到积极的作用。

技术实现要素：

本发明提供一种基于cspv建立的检测人兽共患隐孢子虫的胶体金免疫层析试纸及制备方法，以检测牛微小隐孢子虫为示例，利用cspv单克隆抗体和多克隆抗体，建立了检测隐孢子虫的胶体金免疫层析试纸及制备方法。

本发明提供的一种基于病毒检测的隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸，主要包括玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、pvc底板；其特征在于：

金标垫上的金标抗体为cspv单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的指示线t线包被cspv兔多克隆抗体、c线包被羊抗鼠抗体；

本发明所述的一种基于病毒检测的隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸的制备方法，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金对单克隆抗体进行标记，制备金标垫，组装试纸条，cspv多克隆抗体作为检测线、羊抗鼠抗体作为质检线；具体步骤如下：

（1）胶体金的烧制

利用柠檬酸三钠还原法，向99mlddh2o中加入1ml1%氯金酸，沸腾后加入1ml1%柠檬酸三钠，直至酒红色后，停止加热，制备40nm胶体金颗粒；

（2）金标抗体的制备

取1ml胶体金溶液，加入4µl0.2mol/lk2co3和6μgcspv单克隆抗体，对单抗进行标记，标记后的金标抗体溶解于复溶液中4℃保存待用或直接滴加于金标垫上；

（3）试纸条的组装

取21mm的nc膜贴于pvc底板上，裁剪好的金标垫（8mm×3.2mm）压nc膜上2mm，样品垫（22mm×32mm），压在金标垫上2mm，吸水纸（32mm×32mm），压在nc膜上2mm，粘在底板上，按压保证各组状部分紧紧粘好。

（4）检测线（t）与质控线（c）

将多抗浓度稀释到0.5mg/ml，取1µl点于检测线（t）位置，将羊抗鼠抗体浓度稀释到0.25mg/ml，取1µl点于质控线（c）位置。

本发明的积极效果在于：基于cspv病毒制备双抗夹心胶体金免疫层析试纸，用于人兽共患隐孢子虫的检测，高特异性和敏感性，利用cspv单克隆抗体和多克隆抗体双抗夹心的方法，其中单克隆抗体保证了本方法的特异性，多克隆抗体又提高了本方法的敏感性，使检测结果更加确实。制备的隐孢子虫检测胶体金试纸条具有快捷、便于操作、不需要特殊仪器等特点，检测结果清晰，可以较快的进行判断，适合于临床现场的快速诊断和牧区等大规模流行病学调查。

附图说明

图1胶体烧制图；

图2胶体金透射电镜图；

图3金标抗体最佳ph确定图；

图4最佳抗体标记量确定图；

图5透射电镜观察金标抗体；

图6t线多抗包被浓度的确定图；

图7c线抗体包被浓度的确定图；

图8特异性试验结果图；

图9敏感性试验结果图；

图10阴阳性样品的三次重复效果图。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。

实施例1

牛微小隐孢子虫检测胶体金试纸条的制备

1、方法

（1）胶体金的烧制

利用柠檬酸三钠还原法，向99mlddh2o中加入1ml1%氯金酸，沸腾后加入1ml1%柠檬酸三钠，直至酒红色后，停止加热，制备40nm胶体金颗粒。

（2）金标抗体最佳ph确定

利用k2co3梯度标记法，通过观察颜色变化，确定金标最佳ph。

（3）最佳抗体标记量的确定

利用抗体梯度标记法，通过观察颜色变化，确定金标最佳抗体标记量。

（4）金标抗体的制备

利用摸索好的最佳k2co3加入量通过胶体金对单抗进行标记，标记后的金标抗体溶解于复溶液中4℃保存待用或直接滴加于金标垫上。

（5）nc膜上t线多抗包被浓度的确定

将t线多抗稀释成2、1、0.5、0.25mg/ml，每个试纸条包被1µl，按照常规条件进行操作，观察结果t线的显色情况，确定t线多抗的最佳包被浓度。

（6）nc膜上c线抗体包被浓度的确定

将c线抗体稀释成1、0.5、0.25、0.125mg/ml，每个试纸条包被1µl，按照常规条件进行操作，观察结果c线的显色情况，确定c线抗体的最佳包被浓度。

、结果

（1）胶体金的烧制

胶体金溶液颜色均匀透明，透射电镜观察颗粒大小基本一致，约40nm左右，分散均匀，没有聚集，可用于下一步试验（见图1，图2）。

（2）金标抗体最佳ph确定

确定胶体金标记抗体的最适0.2mol/lk2co3加入量为4µl（见图3）。

（4）最佳抗体标记量的确定

当加入5ug抗体时胶体金溶液不变色，在此基础上多加20%，确定抗体标记量的最佳值为6μg，加入6μgcspv单克隆抗体的量（见图4）。

（3）金标抗体的制备

通过透射电镜观察，金颗粒周围有一圈蛋白晕，分散性较好，无聚集现象，表明标记成功（见图5）。

（4）nc膜上t线多抗最佳包被浓度的确定

多抗浓度稀释到0.5mg/ml时t线显色仍较为明显，故选择0.5mg/ml为t线最佳包被浓度（见图6）。

（5）nc膜上c线抗体最佳包被浓度的确定

结果显示当抗体浓度稀释到0.25mg/ml包被时c线显色明显且用量最少，故选择0.25mg/ml为c线最佳包被浓度（见图7）。

实施例2

胶体金免疫层析试纸条性能测试

1、方法

为了测试试纸条的试验性能，需要进行一系列的试验，其中包括特异性试验、敏感性试验、重复性试验、稳定性试验。

（1）敏感性试验

将牛微小隐孢子虫阳性粪便进行倍比稀释（1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64），按常规操作观察试纸条显色情况。当用肉眼无法观察到t线，并且c线依旧清晰可见时，此时的稀释度即为该方法的最低检出浓度。

（2）特异性试验

分别取牛微小隐孢子虫阳性粪便、阴性粪便、牛贾第虫阳性粪便，牛安氏隐孢子虫阳性粪便对照，按照常规方法进行操作，判断各种粪便之间有无交叉反应，从而评价试纸条的特异性。

（3）重复性试验

取微小隐孢子虫阳性粪便及阴性粪便，使用3个不同批次的试纸条按上述方法进行试验，每个样品做3次重复，根据膜片显色情况，确定该方法的重复性情况。

（4）稳定性试验

将试纸条分别于4℃密封保存、37℃密封保存、室温密封保存。分别在1个月、3个月、6个月、9个月几个时间点分别对参照阳性样品进行检测，观察三种环境各试纸条的显色情况，从而判断试纸条检测的稳定情况。

（5）试纸条的初步应用

应用所组装的试纸条对90份采集于长春地区的牛粪便样品进行检测。

、结果

（1）敏感性试验

结果1:32倍稀释时t线仍有显色，所以该试纸条敏感性为1:32（见图8）。

（2）特异性试验

结果只有牛微小隐孢子虫参照阳性粪便t线显色，阴性粪便、牛贾第虫阳性粪便，牛安氏隐孢子虫阳性粪便对照，表明无交叉反应，特异性良好（见图9）。

（3）重复性试验

结果阴阳性样品的三次重复效果较好，结果比较一致，表明试纸条的重复性良好（见图10）。

（4）保存期试验

4℃和室温可存放9个月，37℃可存放6个月。

（5）试纸条的初步应用

应用所组装的试纸条对90份牛粪便样品进行检测，检出阳性样品6份，阳性率为6.67%。

序列表

<110>吉林大学

<120>一种人兽共患隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸

<141>2017-11-24

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

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<211>960

<212>dna

<213>微小隐孢子虫病毒(cryptosporidiumparvumvirus)

<400>1

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