一种细菌鉴别的方法与流程

本发明构建了一种基于细菌分泌物和表面增强拉曼散射(sers)技术的细菌鉴别或耐药菌快速检测方法，为生物、医疗、卫生等领域中的细菌鉴别和耐药菌快速检测提供一种方法，本发明属于生物技术和快速检测领域。

背景技术：

抗生素的发明，挽救了无数生命，然而随着长期的抗生素过度使用，细菌耐药性已成为一个全球性的严重问题。耐药菌的出现，对人类健康和疾病诊治能力造成了严重威胁。为了对抗耐药性细菌，迫切需要研发新的更为有效的抗生素投入临床使用，然而由于药物研发的漫长周期和巨大成本，当前最为迫切和现实的是减少抗生素的不合理使用，从而控制细菌耐药性的发展和传播。这就需要更为快速和灵敏的病原菌及其耐药性的临床诊断方法和工具，及时指导治疗用药从而提高抗生素使用的针对性和有效性。

在临床上，分离培养方法仍是明确病原菌和进行药敏试验的金标准。临床病体样本需进行处理分离并接种培养，增殖至可检测水平后经生化检验或质谱分析确定病原菌类型；再通过梯度稀释或纸片扩散等传统药敏试验方法判断其耐药属性和程度。这些方法耗时较长，通常最好的情况下可在24小时内确定致病菌，在48小时内反馈药敏试验结果，在此期间医生只能对病情做经验性判断，影响治疗效果。在对细菌进行鉴定上，生化检验方法技术可靠、成本低，然而操作繁琐，容量及准确性有限；而质谱技术快速准确，但仪器昂贵、通量有限。而常规药敏试验方法，如纸片法等，操作简便，结果直观，但培养过程及其耗时。近年来随着分子生物学技术和其他技术的发展涌现出一些新型检测手段，其中包括pcr技术、宏基因组测序等。pcr技术通过对特定目的基因片段的扩增可以鉴别细菌种类及耐药基因，操作简单、结果准确；宏基因组测序能够提供检测样品的完整序列，通过数据库分析可发现大量的信息，但成本高，分析周期长，在做大范围环境中耐药菌及耐药基因普查中极有优势。上述分子生物学技术无需对细菌进行培养，方便快捷，但检测成本较高，且无法给出具体的药敏性结果。综上所述，目前的常规检测方法尚无法实现对病原菌及其耐药性进行快速准确检测的临床目标。因此，设计一种能够快速鉴别细菌种类以及快速检测耐药性细菌的方法具有十分重要的应用价值，对于临床诊疗及抑制抗生素耐药性具有重大意义。

技术实现要素：

针对以上技术问题，本发明提供了一种细菌鉴别的方法，采用基于贵金属纳米颗粒活性基底的表面增强拉曼散射技术，结合细菌对外源压力的应激反应机制，对其特异性的应激分泌物进行拉曼检测，实现了对细菌类别区分和判断。

本发明提供一种细菌鉴别的方法，包括：

1)对所述测试细菌样品施加外源压力，诱发所述待测细菌样品的应激反应机制，使待测细菌样品产生分泌物，所述施加外源压力选自施加热激、辐射、高压强、低渗透压、化学固定物质、杀菌剂、和/或抗生素；

2)加入贵金属纳米颗粒吸附所述分泌物，充分混合后加入诱导团聚试剂，使贵金属纳米颗粒相互团聚形成拉曼增强“热点”，利用表面增强拉曼光谱技术进行检测获得拉曼光谱测定结果；

3)将步骤2)获得的拉曼光谱测定结果与已知细菌分泌物测定的拉曼光谱或者预测的光谱标志进行比对来鉴别所述待测细菌样品。

所述施加外源压力的时间为1-60分钟，优选地为10-30分钟。

本发明提供了一种耐药细菌鉴别的方法，包括：

1)在待测细菌样品中加入特定药物作用于细胞，使待测细菌样品产生分泌物；

2)加入贵金属纳米颗粒吸附所述分泌物，充分混合后加入诱导团聚试剂，使贵金属纳米颗粒相互团聚形成拉曼增强“热点”，利用表面增强拉曼光谱技术进行检测获得拉曼光谱测定结果；

3)将步骤2)获得的拉曼光谱测定结果与特定药物测定的拉曼光谱或者预测的光谱标志进行比对来鉴别所述测试细菌样品是否为特定药物的耐药菌。

所述特定药物包括抗生素或者抗菌药物，优选地，为β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类或多肽类抗生素药物，更优选地，为青霉烯或碳青霉烯类抗生素。

所述加入特定药物作用于细胞的时间为1-60分钟，优选地为10-30分钟。

所述贵金属纳米颗粒包括金、银或铂中的任一种。

所述贵金属纳米颗粒的直径为5-500nm，优选地，为40-100nm。

所述诱导团聚试剂包括磷酸盐、卤素盐、硫酸盐或亚硝酸盐中的一种或多种。

所述诱导团聚试剂的浓度为1mm-2m，优选地，为10mm-200mm。

所述表面增强拉曼光谱技术所采用连续激光波长为266nm-1064nm，优选地，为532nm或785nm；激光功率为1-50mw，优选地，为10mw；测量时间为1-60s，优选地，为10s。

本发明的有益效果是：操作简单、对样品无需过多预处理，检测灵敏、快速，整个处理及检测过程可在一小时以内完成，克服了传统方法中周期长、成本高等局限。该方法的建立将为细菌鉴别或耐药细菌的临床快速检测提供新的工具。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为盐酸羟胺还原硝酸银所制备的纳米银粒子透射电镜图，其中(a)的放大倍率为20万倍，(b)的放大倍率为40万倍。

图2为e.coli应激反应sers图谱。(a)清水中12小时低渗应激；(b)pbs中42℃热激处理10min；(c)pbs中室温处理10min；(d)pbs缓冲液。

图3为(a)e.coli42℃热激处理10min后离心悬浮液的拉曼光谱；(b)为机械破碎处理e.coli细胞悬液的拉曼光谱；(c)90％乙醇固定2小时后e.coli细胞悬液的拉曼光谱.

图4为(a)革兰氏阴性菌e.coli和(b)革兰氏阳性菌s.mutant应激分泌物的拉曼光谱。

图5为细菌应激sers技术快速检测细菌耐药性。(a)卡那霉素分子的拉曼光谱；(b)非耐药菌株抗生素应激拉曼光谱；(c)耐药菌株抗生素应激拉曼光谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：表面增强拉曼散射(sers)活性基底的制备

sers活性基底采用贵金属纳米溶胶，包括但不限于金、银、铂纳米粒子，粒子尺寸制作为5-500nm。图1所示为采用盐酸羟胺化学还原法制备的纳米银粒子透射电镜图片，其形状为球形，直径为30-60nm。

实施例2：采用sers技术检测细菌应激反应

以纯培养大肠杆菌e.colidh5α为模式对象，采用基于纳米银溶胶的sers技术检测了e.coli在不同外源压力情况下的应激反应。检测步骤为：

首先，将大肠杆菌分成三组，对其中两组进行不同的外源压力操作，另一组作为对照组，具体操作为：

第一组：在清水中悬浮e.coli并室温处理12小时以上以维持低渗透压；

第二组：在等渗pbs缓冲液中悬浮e.coli并42℃处理10min以提供热激外源压力；

第三组：在等渗pbs缓冲液中悬浮e.coli并室温放置10min作为对照组。

随后，取上述三组菌液分别与合成的纳米银溶胶等体积混合，并加入诱导团聚试剂kcl。

最后，取混合液滴涂至载玻片，测量其拉曼光谱，可获得图2所示的拉曼光谱图。拉曼测量使用的是horibalabramhr显微拉曼系统，采用532nm激光，10倍物镜，激光功率1mw，采集时间10s。其中，(a)为经低渗透压处理的细菌悬液的拉曼光谱，(b)为经热激处理的细菌悬液的拉曼光谱，(c)为对照组的拉曼光谱，(d)为pbs缓冲液的拉曼光谱。图2结果显示，在低渗透压及热激等外源压力下，e.coli可产生应激反应并向胞外分泌应激分泌物，可通过sers技术灵敏检测。

为进一步证实拉曼光谱是来自于细菌的应激分泌物而非细胞本身或部分细胞破裂造成的内容物释放，分别对热激处理细菌悬液离心后的上清液、经机械破碎后的细胞悬液以及经乙醇固定处理后的细胞悬液进行拉曼测量，可获得图3所示的拉曼光谱图。其中(a)为e.coli42℃热激处理10min后离心悬浮液的拉曼光谱；(b)为机械破碎处理e.coli细胞悬液的拉曼光谱；(c)90％乙醇固定2小时后e.coli.细胞悬液的拉曼光谱。将图3的测量结果与图2中(b)的结果对比，可证实，所测得的拉曼光谱的确来源于细菌应激分泌物。

实施例3：利用细菌应激分泌物的sers光谱进行细菌鉴别和区分

基于实施例2中实验结果，可利用sers技术检测细菌应激分泌物从而对不同细菌做出区分。分别以革兰氏阴性菌e.colidh5α和革兰氏阳性菌s.mutantua159为对象，采用热激的方式对两种细菌pbs悬浮液进行处理，随后混合纳米银溶胶及诱导团聚试剂，并分别测量两种细菌热激后分泌物的拉曼光谱，可得如图4所示结果，其中(a)为革兰氏阴性菌e.coli应激分泌物的拉曼光谱，(b)为革兰氏阳性菌s.mutant应激分泌物的拉曼光谱。从图中可清楚看出，e.coli与s.mutant两种细菌应激分泌物的拉曼光谱在峰位及强度上均有明显差别，表明这两种细菌具有特异性的应激分泌反应，可根据拉曼光谱快速区分及鉴别出两种细菌类别。

实施例4：采用sers技术检测细菌在抗生素作用下的应激反应快速判断细菌耐药性

基于耐药性细菌对抗生素的耐受作用，其在抗生素药物作用压力下的细胞应激反应与敏感细菌不同，因此可根据这一原理采用sers技术对耐药细菌进行快速检测和判断。分别对正常菌株e.colidh5α及卡那霉素耐药菌株pet28/bl21的pbs细菌悬液中加入mic浓度卡那霉素(100mg/ml)，孵育10-30min，随后加入纳米银溶胶及诱导团聚试剂，并测量其拉曼光谱，同时测量相同浓度卡那霉素药物为对照以区分药物分子拉曼光谱。可得图5所示拉曼光谱图，其中(a)为卡那霉素分子的拉曼光谱，(b)为非耐药菌株抗生素应激拉曼光谱，(c)为耐药菌株抗生素应激拉曼光谱。从图5结果明显可见，非耐药菌株在抗生素作用下迅速产生应激反应，并释放出特征分泌物，可经由sers技术检测出，如图5中732cm^-1及1330cm^-1位置的拉曼峰；而卡那霉素耐受菌株则对药物压力几乎无响应，其拉曼光谱与单纯卡那霉素药物分子的拉曼光谱基本一致，说明耐药细菌能够耐受抗生素药物压力，无应激物质分泌至胞外。根据这一现象，可快速判断细菌是否为特定抗生素的耐药菌。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。