本发明属于海洋动物应用技术领域，更具体是涉及一种单环刺螠抑菌活性物质的分离及活性测定方法。
背景技术：
海洋作为巨大的天然宝库，蕴含了丰富的生物资源。海洋生物体内存在着一些结构新颖、性质独特的化学物质。目前我国已经有6000多种海洋天然产物被发现，这些天然产物在医药、农药领域都具有很大的发展空间。本实验从单环刺螠中提取天然活性成分，并对其抑菌活性进行研究。
单环刺螠(urchisunicinctus)俗称海肠子，为真体腔原口动物，在分类上隶属螠虫动物门(echiuroidea)，螠纲(echiurida)，无管螠目(xenopneusta)，刺螠科(urechidae)，刺螠属(urechis)，是无管螠目在中国沿海分布的唯一种类。由于其分类地位独特，且能耐受高浓度硫化物，所以一直以来也是学术界研究的热点之一。
抑菌药物是现代医疗中不可或缺的一类药物，临床应用十分广泛。20世纪，抗生素的发现解决了医学界的重大难题。然而随着抗生素的广泛使用甚至滥用，导致细菌产生了耐药性。目前，大部分使用的抗生素来自陆栖放线菌和真菌，长期的开发使陆栖微生物资源日渐枯竭，因此从海洋生物中开发抑菌药物成为新的研究热潮。由于海洋动物生活在复杂的海洋环境中，其先天免疫系统进化的功能强大，能够产生或者分泌一系列抑菌的活性物质来进行自我保护。因此，海洋动物也称为筛选新型抑菌药物的重要资源库。
技术实现要素：
为实现上述目的，本发明提供一种单环刺螠抑菌活性物质的分离及活性测定方法，其特征在于由以下步骤组成：
3种海洋源抑菌活性物质的提取和抑菌活性比较；
单环刺螠有机溶剂提取物的分离和抑菌活性测定；
单环刺螠b萃取物的再分离和抑菌活性的测定；
单环刺螠b3分离物的再分离和抑菌活性的测定；
单环刺螠b3-3组分的再分离和抑菌活性测定；
单环刺螠b3-3-2组分的再分离和抑菌活性测定；
单环刺螠b3-3-2-2组分的分离；
单环刺螠c萃取物的再分离和抑菌活性的测定；
单环刺螠c8分离物的再分离和抑菌活性的测定；
单环刺螠b8-3组分的再分离和抑菌活性测定；
单环刺螠c8-3-2组分的再分离和抑菌活性测定；
单环刺螠中抑菌活性单体ps-3和单体化合物ps-4的结构解析。
所述一种单环刺螠抑菌活性物质的分离及活性测定方法的萃取剂为正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水。
所述一种单环刺螠抑菌活性物质的分离及活性测定方法中用于单环刺螠中抑菌活性测试的供试菌株为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、藤黄微球菌、巴氏杆菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌和黄瓜枯萎病菌的一种或数种。
所述一种单环刺螠抑菌活性物质的分离及活性测定方法中用于单环刺螠b萃取物的再分离的洗脱剂为一定体积比的三氯甲烷-甲醇。
所述一种单环刺螠抑菌活性物质的分离及活性测定方法中用于单环刺螠c萃取物的再分离的洗脱剂为一定体积比的石油醚-乙酸乙酯和三氯甲烷-甲醇。
与现有技术相较，本发明具有以下优势：选择纯天然利用率很低的单环刺螠为研究对象，全面考察了其分离物的抑菌活性，并分离出抑菌活性优良的2种单体化合物ps-3和ps-4，并对两者进行了结构解析，发现ps-3为已知化合物胆甾-4,6-二烯-3-醇，ps-4为hurgadacin。
具体实施方式
本发明通过特定制备和生物活性测定实施例来具体说明一种单环刺螠抑菌活性物质的分离及活性测定方法，所述实施例仅用于具体的说明本发明而非限制本发明。
实施例1
抑菌活性测定方法：制备待测样品溶液，即称取适量样品，以dmso配制成初始浓度为100mg/ml的样品溶液，按二倍稀释法，用dmso依次稀释到不同浓度，备用；制备细菌菌悬液，即将供试细菌接种于lb液体培养基中，恒温（36℃）振荡培养24h。取1ml菌悬液，以lb培养基稀释至10ml，4℃低温保存备用；测定最小抑菌浓度的，即96孔板中添加80μl制备好的菌悬液，再加15μl不同浓度的待测样品溶液，最后加5μl浓度为1.0mg/ml的刃天青显色剂，密封置于36℃恒温培养箱中培养24h，观察孔内颜色变化，若颜色变为深蓝色，说明待测样品具有抑菌活性，若变为粉红色，说明无抑菌活性。以不加样品溶液的孔作为阴性对照，实验重复3次，以完全抑制供试菌株生长的最低浓度作为mic。
实施例2
3种海洋源生物抑菌活性物质的提取和抑菌活性比较：分别用有机溶剂提取海带、马尾藻和单环刺螠中活性成分后，分别进行抑菌活性测定，供试浓度为15mg/ml~0.23mg/ml，结果发现单环刺螠的有机溶剂提取物的抑菌活性最强。
实施例3
单环刺螠有机溶剂提取物的分离和抑菌活性测定：以a、b、c、d和e五种不同极性的溶剂对单环刺螠有机溶剂提取物进行萃取分离后，分别测定5种萃取物的抑菌活性，供试浓度为15mg/ml和7.5mg/ml，结果发现b和c萃取物的抑菌活性最强。
实施例4
单环刺螠b萃取物的再分离和抑菌活性的测定：利用硅胶柱色谱对b萃取物进行分离，得到7种分离物b1~b7,分别测定b1~b7的7种分离物的抑菌活性，供试浓度分别为15mg/ml和7.5mg/ml，结果发现b3分离物的抑菌活性最强。
实施例5
单环刺螠b3分离物的再分离和抑菌活性的测定：利用硅胶柱色谱对b3组分进行分离后得到b3-1~b3-5的5种分离物，分别测定5种分离物的抑菌活性，供试浓度分别为15mg/ml~0.23mg/ml，结果发现b3-3分离物的抑菌活性最强。
实施例6
单环刺螠b3-3组分的再分离和抑菌活性测定：经硅胶柱色谱进一步分离后得到b3-3-1、b3-3-2和b3-3-3组分，分别测定3种分离物的抑菌活性，供试浓度范围为15mg/ml~1.88mg/ml，结果发现b3-3-2分离物的抑菌活性最强。
实施例7
单环刺螠b3-3-2组分的再分离和抑菌活性测定：b3-3-2组分经制备薄层色谱分离后，得到b3-3-2-1和b3-3-2-2组分,分别测定2种分离物的抑菌活性，供试浓度范围为3.75mg/ml~0.23mg/ml，结果发现b3-3-2-2分离物的抑菌活性最强。
实施例8
单环刺螠b3-3-2-2组分的分离：利用sephadexlh-20凝胶柱色谱对b3-3-2-2组分进行纯化，最终得到白色粉末状固体，记为ps-3。
实施例9
单环刺螠c萃取物的再分离和抑菌活性的测定：利用硅胶柱色谱对c萃取物进行分离，得到10种分离物c1~c10,分别测定10种分离物的抑菌活性，供试浓度为5mg/ml~0.625mg/ml范围内，结果发现c8分离物的抑菌活性最强。
实施例10
单环刺螠c8分离物的再分离和抑菌活性的测定：利用硅胶柱色谱对c8组分进行分离后得到c8-1~c8-6的6中分离物，分别测定6种分离物的抑菌活性，供试浓度范围为3.75mg/ml~0.23mg/ml，结果发现c8-3分离物的抑菌活性最强。
实施例11
单环刺螠c8-3组分的再分离和抑菌活性测定：经硅胶柱色谱进一步分离后得到c8-3-1、c8-3-2和c8-3-3组分，分别测定3种分离物的抑菌活性，供试浓度范围为15mg/ml~1.88mg/ml,结果发现c8-3-2分离物的抑菌活性最强。
实施例12
单环刺螠c8-3-2组分的再分离和抑菌活性测定：利用凝胶柱色谱，以一定体积比的三氯甲烷和甲醇为洗脱剂，对c8-3-2组分进行纯化后得到单体化合物ps-4,对ps-4进行抑菌活性研究，浓度范围为3.75mg/ml~0.23mg/ml,结果发现ps-4对大肠杆菌和巴氏杆菌的抑菌效果最好。
实施例13
单环刺螠中抑菌活性单体ps-3的结构解析：白色粉末状物质ps-3，经气相色谱-质谱联用（gc-ms）检测，并与nist11数据库中的已知化合物对比后，发现所得白色固体ps-3的质谱图与化合物胆甾-4,6-二烯-3-醇的质谱图相似度达到92.4%，将对两者的质谱图进行比较，可以看出，在m/z=366、247、211、91、57和43处均出现相同的碎片离子峰，因此鉴定ps-3为已知化合物胆甾-4,6-二烯-3-醇。
实施例14
单体化合物ps-4的结构解析：化合物ps-4，白色粉末。根据气相色谱-质谱检测结果，将其质谱数据与数据库中的已知化合物hurgadacin进行比较发现两者的质谱图相似度达到93.3%。由图可知，化合物ps-4在m/z=426处有分子离子峰，因此判断其相对分子质量为426。此外，在m/z=314、299、271、229、145、105、55和43处，ps-4和已知化合物hurgadacin存在相同的离子峰。根据化合物ps-4的核磁谱图，对c、h信号进行归属：
1h-nmr(500mhz,meod)δ：0.87，0.88，0.95，0.96，1.04（3h,s,h-18,19,21,29,30），3.87（1h,dd,h-3），4.56（1h,d,h-27a）,4.72（1h,d,h-27b）；
13c-nmr(125mhz,meod)δ：36.28（c-1）、30.9（c-2）、71.0（c-3）、41.6（c-4）、140.8（c-5）、121.0（c-6）、31.8（c-7）、31.6（c-8）、50.3（c-9）、37.1（c-10）、21.1（c-11）、39.8（c-12）、42.1（c-13）、56.7（c-14）、23.9（c-15）、27.9（c-16）、56.0（c-17）、10.9（c-18）、18.5（c-19）、35.6（c-20）、17.8（c-21）、34.6（c-22）、22.8（c-23）、29.4（c-24）、30.7（c-25）、156.4（c-26）、105.5（c-27）、33.5（c-28）、20.8（c-29）、20.9（c-30）。通过与文献报道的数据比对发现，ps-4的波谱数据与化合物hurgadacin的数据基本一致，因此鉴定ps-4为hurgadaci。