一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条及其制备方法与流程

本发明涉及一种快速检测微量杀虫剂药物的器具，特别是涉及一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条及其制备方法。

背景技术：

氟虫腈，商品名称锐劲特，英文通用名称芬普尼(fipronil)，化学名称(rs)-5-氨基-1-(2,6-二氯-a,a,a-三氟-对-甲苯基)-4-三氟甲基亚磺酰基吡唑-3-腈，分子式为c8n2cl4，分子式c12h4cl2f6n4os，分子量437.2，是法国罗纳普朗克公司1981年开发的苯基吡唑类杀虫剂。从上世纪90年代中期开始使用，是一种世界范围内应用广泛的广谱杀虫剂和兽药，主要用于农作物害虫控制，家庭宠物寄生虫的治疗与控制，公共卫生娱乐场所害虫防控等各方面的得到广泛应用。它通过与γ-氨基丁酸受体结合，有效抑制昆虫中枢神经系统中γ-氨基丁酸调节的氯离子通道，并且与这个通道有很高的亲和力，从而干扰虫体中枢神经系统，导致其神经及肌肉兴奋过度兴奋而死亡。大量的试验结果表明不同浓度的氟虫腈悬浮溶液、粉剂或颗粒剂通过叶面喷雾、种子包衣、拌土撒施等方式对水稻害虫如螟虫、褐飞虱、灰飞虱及稻水象甲作用效果良好。对牧场蝗虫防止效果也特别好，防治率达73％以上。对蚊子，草地红火蚁也有特别好的防治效果。氟虫腈本身对哺乳动物γ-氨基丁酸调节的氯离子通道亲和力相对较低，因此认为对哺乳动物安全性比较高。然而随着研究的深入，氟虫腈的负面影响逐渐显现，氟虫腈在机体内被代谢成很多代谢产物包括砜化物、亚砜化合物、硫化物，脱亚磺酰基化合物，实际上氟虫腈的这些主要代谢产物对哺乳动物γ-氨基丁酸调节的氯离子通道亲和力更强，并产生有害效应，已有的试验结果证明，代谢物砜化物对鸟类、脊椎动物动物的毒性均比氟虫腈本身的毒性更高，脱亚磺酰基化合物也有同样的表现。这些代谢产物通过吸收、代谢、排泄、水解及光解作用，广泛分布于动物的各个组织中，主要作用于含高脂肪器官，特别是脂肪组织、肾上腺及肝脏，以及其他组织如甲状腺，肾脏，损害动物繁殖性能，且作用持久，并通过富集作用，沉积在组织中，通过食物链危害人体健康，导致人呕吐，焦虑不安，癫痫等可见的症状。其对环境、生态系统及人类健康的影响愈来愈受到人们的普遍关注。欧盟委员会还是从2013年限制了氟虫腈的使用范围。联合国粮农组织和世界卫生组织对粮油、蔬菜、水果和动物产品中氟虫腈含量做了最高残留限量，其中牛奶、牛肾及禽蛋为0.02mg/kg，牛肝0.1mg/kg，牛肉0.5mg/kg，禽肉为0.01mg/kg。我国gb2763也对粮油、蔬菜、水果、糖料及食用菌残留限量做了规定，除了(鲜食)玉米为0.1mg/kg外，其他皆为0.02mg/kg。

目前国内外检测氟虫腈残留的方法主要采用理化分析方法，主要是色谱法，包括液相色谱法-串联质谱法(lc-ms/ms)、气相色谱法(gc)、液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)、气相色谱质谱联法(gc-ms)等，这些方法检测氟虫腈需经一系列复杂的前处理净化过程，繁琐费时，从样品预处理到得出检测结果至少需要2天时间，同时需要大型专门的仪器设备和专业技术人员操作，不能满足需求快速检测需求，时效性较差。氟虫腈免疫试剂盒测法，分析过程相对简单，但由于氟虫腈检测限要求比较低，因此对抗体灵敏度要求比较高，有些抗体可能达不到要求。表面增强拉曼免疫检测，具有拉曼的高灵敏度特点，也具有抗体特异性强的优点，对氟虫腈的筛查有独特优势，但目前氟虫腈免疫检测方法虽有报道，但比较少，试纸快速检测方法在国内尚属空白，亟待研究解决。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高的快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜上喷涂有偶联氟虫腈的载体蛋白作为检测线，还设有用羊抗或兔抗小鼠igg、羊抗兔igg抗体或spa印制的质控线。

所述表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层中的标记抗体为表面增强拉曼胶体金标记的抗氟虫腈单克隆抗体或多克隆抗体。

在吸附纤维层、表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层和吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向吸附纤维层一侧0.3-0.7cm处印制有样品标记线。

所述的偶联氟虫腈的载体蛋白的制备方法为，先利用水解法对氟虫腈进行结构改造：在强碱条件下，将氟虫腈中的氰基水解为羧基，得到cnt-cooh；再将cnt-cooh与bsa或ova偶联，得到偶联氟虫腈载体蛋白的溶液。

所述的偶联氟虫腈的载体蛋白的制备方法具体为：

(1)将20mg氟虫腈标品溶于100μl丙酮中，搅拌下将氟虫腈的丙酮溶液逐滴加入到3ml0.1m的naoh溶液中，60℃水浴反应24h，此时反应液由浑浊逐渐变为浅黄色澄清溶液，冷却至室温，然后在冰浴条件下，用0.1m盐酸调节反应液ph值为5，此时有浅黄色固体析出，减压抽滤，单蒸水洗涤，干燥，得到产物，命名为cnt-cooh；

(2)称取5mgcnt-cooh，溶于500μl二甲基甲酰胺中，搅拌下依次加入2.5mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.5mgn-羟基琥珀酰亚胺，室温反应0.5h，使cnt-cooh活化；

(3)称取4.5mgbsa和5mgova分别溶于1ml磷酸盐缓冲液中，将250μl活化后的cnt-cooh溶液分别逐滴加入bsa和ova的溶液中，搅拌下室温反应4h；用pbs透析3d，离心，收集上清，弃沉淀，即得到偶联氟虫腈的载体蛋白溶液，分装后保存于-20℃备用。

所述的pbs透析期间多次换透析液，6-8次/天。

所述的离心的转速为5000r/min，时间为5min。

一种试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)偶联氟虫腈载体蛋白的制备

(2)抗氟虫腈单克隆抗体或多克隆抗体的制备；

(3)氟虫腈表面增强拉曼胶体金标记抗体的制备；

(4)羊抗或兔抗小鼠igg、或羊抗兔igg抗体的制备；

(5)用所得的氟虫腈载体蛋白偶联物在纤维素膜层上制成检测线，用羊抗或兔抗小鼠igg、或羊抗兔igg抗体或spa在纤维素膜层上制备质控线；氟虫腈表面增强拉曼胶体金标记抗体用于制备表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层，然后依次安装支撑层、吸附层和保护层组装成试纸条。

本发明的检测原理为：

表面增强拉曼胶体金免疫层析试纸试验的原理是采用柠檬酸三钠还原haucl4聚合成金颗粒，由于金颗粒之间的静电作用和布朗运动，使其保持水溶胶状态，胶体金富含电子和强大的给电子能力。拉曼活性物质4-氨基苯硫酚(patp)及氟虫腈抗体双标记胶体金纳米颗粒制备免疫探针。把拉曼信号的高灵敏性与免疫检测的高特异性相结合，建立了表面增强拉曼免疫检测方法。胶体金以非共价键分别与patp及氟虫腈抗体结合形成表面增强拉曼金标记抗体(patp-au-ab)，将表面增强拉曼胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉上，一端与固定有氟虫腈-蛋白质偶连物(检测线)和二抗(或spa)(质控线)的硝酸纤维素(nc)膜相连，另一端与吸附纤维层相连。而后连同其它所需的吸水纤维、支撑材料、覆盖材料等按照设计工艺进行制作和组装，制成快速检测试纸。检测样品中不含氟虫腈时，表面增强拉曼胶体金标记抗体就会与氟虫腈蛋白质偶连物反应而被部分截获，检测线显示棕红色；未完全结合的标记抗体至质控线时与二抗或spa结合，质控线显示棕红色；检测样品中含有氟虫腈时，样品中氟虫腈与氟虫腈-蛋白质偶连物竞争性结合表面增强拉曼胶体金标记抗体，阻碍了检测线上氟虫腈-蛋白质偶连物与标记抗体的结合，检测线不出现或出现很弱的红色条带(附图1)。如果要用该试纸进行定量检测，则应用制备的试纸检测系列倍比稀释浓度的氟虫腈标准品，15分钟后用便携式拉曼仪对试纸进行检测读值，以抑制率为纵坐标，浓度为横坐标建立标准曲线。检测样品是，根据拉曼仪的读值，结合标准曲线，从而计算出样品中氟虫腈含量。所制备的快速检测试纸检测氟虫腈残留，可目测也可机器阅读，目测灵敏度为ng级，检测时间5-10分钟；而机器阅读灵敏度ic50为pg级，检测时间1-2小时。

本发明积极有益效果：

①特异性强，灵敏度高。本发明试纸条以竞争模式为基础制备而成，样品及检测线上的靶标物竞争结合表面增强拉曼胶体金标记抗体。标记抗体中金颗粒分别与patp及氟虫腈抗体分子非共价键结合，形成patp-au-ab复合物，patp-au标记对抗体的特异性及亲和力影响很小，且具有较高的标记率。试验表明，本试纸具有较强的特异性和较高的灵敏度，目测检测限为ng级；拉曼仪定量检测检测限为pg级。与其他农药或兽药无交叉反应。可以满足于我国、世界卫生组织及联合国粮农组织对各种粮油、蔬菜、水果及动物源性食品中氟虫腈检测限量，在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要的意义。

②简便、快速。使用本发明试纸条，目测无需其他仪器及设备，机器检测也只需便携式拉曼仪一台，即可进行检测。将150μl样品溶液滴加到试纸条吸附纤维层上(或将试纸条的测试端警示线以下插入待测样品溶液中)，5-10分钟后通过检测的有无及深浅，可以判定结果。也可利用拉曼仪，通过标准曲线建立及计算，1-2个小时内即可判定检测结果。

③结果显示形象、直观、即可定性检测也可定量检测。试纸条以显示棕红色“︱”(或“十”、“┬”、“┴”、“├”、“┤”)印迹作为检测结果阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“︱”印迹，表示样品中含有一定浓度(试纸目测灵敏度浓度)及以上的氟虫腈，显示两条棕红色“∥”印迹，表示被检样品中不含氟虫腈或含量低于一定浓度。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。可以根据检测线深浅，利用拉曼仪进行机器检测，定量测定样品中的氟虫腈含量。

④节省费用。使用快速检测试纸条，如果是定性检测，无需另配仪器设备和其它试剂，可随时随地进行检测，费用低廉，能节省大量贵重仪器和设备费用。即使是定量测定，其检测费用也只是理化检测方法的1/10。

⑤适用范围广，便于推广应用。操作简便，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加工、养殖户以及消费者个人等，该试纸条具有广阔的市场前景和明显的经济效益以及社会效益。

附图说明

以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明试纸条检测结构示意图。

图2为本发明试纸条剖面示意图。图中，1为覆盖在吸附纤维层2和表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层4上的保护层，2为吸附纤维层，3为支撑层，4为表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层，5为纤维素膜层，6为检测线，7为质控线，8为覆盖在吸水材料层9上的保护层，9为吸水材料层。

图3为本发明试纸条俯视示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

如图1-3给出，本发明快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜上喷涂有偶联氟虫腈的载体蛋白作为检测线，还设有用羊抗或兔抗小鼠igg、羊抗兔igg抗体或spa印制的质控线。

所述表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层中的标记抗体为表面增强拉曼胶体金标记的抗氟虫腈单克隆抗体或多克隆抗体。

所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层用吸附氟虫腈的表面增强拉曼胶体金标记抗体玻璃纤维棉制成。

所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。

所述偶联氟虫腈的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。

所述检测线和质控线为平行排列的“∥”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“┬┬”字型排列印迹，或为“┴┴”字型排列印迹，或为“├├”字型排列印迹，或为“┤┤”字型排列印迹。

在吸附纤维层、表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层和吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向吸附纤维层一侧0.3-0.7cm处印制有样品标记线。

实施例2

要制成快速检测微量氟虫腈表面增强拉曼胶体金试纸条，首先制备偶联氟虫腈载体蛋白和氟虫腈表面增强拉曼胶体金标记抗体，从而制备检测线和表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层；其次制备羊抗或兔抗小鼠igg(或羊抗兔igg)抗体，用于制备质控线。

本发明快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1、偶联氟虫腈的载体蛋白(即氟虫腈载体蛋白偶联物)的制备

(1)水解法对氟虫腈进行结构改造，在强碱条件下，将氟虫腈(cnt)中的氰基(-cn)水解为羧基(-cooh)得到cnt-cooh。将20mg氟虫腈标品溶于100μl丙酮中，搅拌下将氟虫腈的丙酮溶液逐滴加入到3ml0.1m的naoh溶液中，60℃水浴反应24h，此时反应液由浑浊逐渐变为浅黄色澄清溶液，冷却至室温，然后在冰浴条件下，用0.1m盐酸调节反应液ph值为5，此时有浅黄色固体析出，减压抽滤，单蒸水洗涤，干燥，得到产物，命名为cnt-cooh；

(2)称取5mgcnt-cooh，溶于500μl二甲基甲酰胺中，搅拌下依次加入2.5mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和1.5mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温反应0.5h，使cnt-cooh活化；

(3)称取4.5mg牛血清白蛋白(bsa)和5mg卵清蛋白(ova)分别溶于1ml磷酸盐缓冲液中，将250μl步骤(2)活化后的cnt-cooh溶液分别逐滴加入bsa和ova的溶液中，搅拌下室温反应4h；用pbs透析3d(期间多次换透析液，6-8次/天)，5000r/min离心5min，收集上清，弃沉淀，得到偶联氟虫腈的载体蛋白溶液，分装后保存于-20℃备用。

2、抗氟虫腈单克隆抗体或多克隆抗体的制备

单抗制备：用制备的氟虫腈载体蛋白偶联物以每次20μg蛋白/200μl/只的用量免疫6～8周龄balb/c小鼠，背部皮下分4～6点注射，共免4次，免疫间隔时间4周。首免，用无菌pbs稀释制备的氟虫腈载体蛋白偶联物，与等量弗氏完全佐剂(fca)混合，充分乳化；加强免疫，用无菌pbs稀释氟虫腈载体蛋白偶联物，与等量弗氏不完全佐剂(fia)混合，充分乳化，第4次免疫10天后测定血清抗体效价及抑制效价，筛选效价高，抑制效果好的小鼠作为融合小鼠。对融合小鼠进行超强免疫，将100μg氟虫腈载体蛋白偶联物用无菌的pbs稀释到100μg蛋白/200μl，不加佐剂直接腹腔注射。3～4天后将免疫的小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用75％(v/v)的酒精浸泡小鼠5～10min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞。将分离的脾细胞与ns0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀物于37℃水浴中缓缓加入0.7～1.0ml的50％peg4000(v/v)，1min内加完，前30s加0.1～0.3ml，中间15s加0.2～0.4ml，最后15s加完；然后缓缓加入无血清1640培养基15ml，以终止peg的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀物重悬于hat选择培养基中，并加入96孔细胞培养板中(8～10块)，100μl～200μl/孔，置于37℃、5％的co2培养箱中培养。培养10～14天，用间接elisa法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行2次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。

体内诱生腹水法批量制备抗体，取spf级balb/c小鼠，腹腔注射液体石蜡400μl/只，7～10天后，把用培养基rmpi-1640稀释成浓度为1×10⁶个细胞/ml的杂交瘤细胞，按500μl/只注射到腹腔中。待小鼠腹腔肿大，皮肤紧绷时，采取腹水，3000r/min离心5min，弃沉淀。然后辛酸硫酸铵法纯化腹水，1ml腹水中加入4ml乙酸乙酸钠缓冲溶液(ph4.0)稀释腹水，用1m的naoh溶液将腹水的乙酸乙酸钠缓冲溶液ph值调至4.5。然后缓慢搅拌加入130μl辛酸，室温下搅拌反应30min，6000r/min离心30min，去沉淀，上清用滤纸过滤除去杂质，滤液与10倍浓缩的磷酸盐缓冲液(pbs)按体积比9:1混合，即滤液处于1倍pbs离子环境下，然后用1m的naoh调ph至7.4，放入冰浴中冷却。按0.2778g/ml的浓度加入硫酸铵粉末，4℃下搅拌反应2h，6000r/min离心20min，去上清，1mlpbs溶解沉淀，pbs流动透析3天，6000r/min离心10min弃沉淀，-20℃冻存备用。经检测，所制备的单克隆抗体可特异地与氟虫腈反应，亲和力常数达到10¹⁰-10¹²l/mol，可用于制备表面增强拉曼胶体金标记抗体玻璃纤维层。

多抗制备：用氟虫腈载体蛋白偶联物免疫新西兰白兔，免疫剂量为每次200μg蛋白/1ml/只，背部皮下分4～6点注射，共免4次，免疫间隔时间3～5周。首免，用无菌pbs稀释制备的氟虫腈载体蛋白偶联物，与等量弗氏完全佐剂(fca)混合，充分乳化；加强免疫，用无菌pbs稀释氟虫腈载体蛋白偶联物，与等量弗氏不完全佐剂(fia)混合，充分乳化。最后一次免疫后10～15天，以elisa法测其定效价达到10⁵以上时，采血并分离收集高免血清。饱和硫酸铵盐析法提取igg抗体，取1份高免血清加2份pbs混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4℃冰箱12h，4℃、2500r/min离心15min，弃上清，再以适量pbs溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃、2500r/min离心15min，弃上清，以适量pbs溶解沉淀，置4℃透析柜内pbs透析3天，中间换液数次，4℃、12000r/min离心15min，收集上清，得纯化的抗氟虫腈多克隆抗体，-20℃冻存，用于制备表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层。

3、氟虫腈表面增强拉曼胶体金标记抗体和金标记抗体玻璃纤维棉的制备

采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液。99ml超纯水加入到洁净的带刻度的200ml锥形瓶中，锥形瓶置于加热磁力搅拌器上加热并搅拌，加入1ml1％(w/v)氯金酸溶液，加热至沸腾，然后迅速加入1.6ml1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热至溶液颜色由浅黄色变为深红色，继续煮沸3-5min(沸腾时注意补加超纯水保持溶液体积)，冷却至室温，用0.1mol/l的k2co3调节ph值至7.5左右(1ml金溶液大约4μl0.1mol/l的k2co3溶液)，制得胶体金溶液，室温避光保存备用。2.5μl1mm的patp加入到1ml胶体金溶液中，摇动2h，然后5000r/min离心10min，弃上清，沉淀用1ml硼酸盐缓冲液重悬，即得到patp-au溶液。

温和搅拌上述patp-au溶液，将氟虫腈腹水5μl逐滴加入其中，室温孵育30min，加入100μl含有10％(w/v)bsa的20mm硼酸盐缓冲液，室温孵育3h，4℃、12000r/min离心30min，弃上清，沉淀用含1％(w/v)bsa、0.1％(w/v)叠氮钠的20mm硼酸盐缓冲液洗涤1次，再按上述方法离心，弃上清，沉淀用1ml含有0.5％tween-20(v/v)的磷酸盐缓冲液(pbst)重悬，4℃保存备用。用喷涂仪按5μl/cm将上述溶液喷涂于玻璃纤维棉上，4℃低温真空干燥，制备出氟虫腈表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层。

4、羊抗或兔抗小鼠igg(或羊抗兔igg)抗体的制备

以饱和硫酸铵纯化的氟虫腈阴性小鼠血清igg免疫兔或羊(或阴性兔血清igg免疫羊)，方法同制备氟虫腈兔多抗血清一样，用于微量氟虫腈快速检测试纸条中质控印迹的制备。质控印迹也可以是喷涂spa(金黄色葡萄球菌a蛋白)。

5、试纸条的组装

用所得的氟虫腈载体蛋白偶联物在纤维素膜层上制成检测线，用羊抗或兔抗小鼠igg、或羊抗兔igg抗体或spa在纤维素膜层上制备质控线；将吸附纤维层、氟虫腈表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层、纤维素膜层和吸收材料层依次组装在支撑层上，再组装保护层，制得试纸条。

检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条的检测反应原理：

将150μl样品溶液滴加到试纸条吸附纤维层上或将试纸的测试端警示线(max)以下插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测氟虫腈及表面增强拉曼胶体金标记抗体玻璃纤维棉中的表面增强拉曼胶体金标记抗体一起向纤维素膜层扩散，并最终渗入手柄端的吸水材料层。在扩散过程中，待测氟虫腈可与表面增强拉曼胶体金标记抗体纤维层中的标记抗体相结合，进而封闭标记抗体上氟虫腈的抗原结合点，阻止标记抗体与纤维素膜上偶联氟虫腈载体蛋白的检测印迹(检测线)结合，试纸条上无法显示检测印迹，而羊或兔抗小鼠igg(或羊抗兔igg)抗体则可与标记抗体结合，形成棕红色质控印迹(质控线)带“︱”，即一条棕红色带“︱”印迹为阳性表示。反之样品溶液中若无氟虫腈，则不能阻止标记抗体与纤维素膜上偶联氟虫腈载体蛋白的检测印迹结合，试纸条显示棕红色检测印迹带“︱”；同样羊抗或兔抗小鼠igg(或羊抗兔igg)抗体也能与标记抗体结合，显示棕红色质控印迹带“︱”，形成两条棕红色带“∥”为阴性表示。如果质控线上没有棕红色带显示，则表明试纸条已失效。

实验例1、灵敏度检测

1、裸眼目测：

以浓度为1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、6ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、20ng/ml和40ng/ml的氟虫腈溶液为样品，采用氟虫腈表面增强拉曼金标试纸条进行氟虫腈检测。目测结果显示(5-10分钟)，10ng/ml、20ng/ml和40ng/ml时所有的试纸条检测线均不显色，8ng/ml时有90％的试纸条检测线不显色，6ng/ml时有60％的试纸条检测线不显色，1ng/ml，2ng/ml和4ng/ml的试纸条检测线均显色，因此判定氟虫腈表面增强拉曼金标试纸的目测最低检测浓度为10ng/ml，灵敏度设定为10ng/ml。

2、拉曼仪检测：

以浓度为4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml、0.13ng/ml、0.063ng/ml、0.031ng/ml、0.0156ng/ml、0.0078ng/ml和0ng/ml的氟虫腈溶液为样品，采用氟虫腈表面增强拉曼金标试纸条进行氟虫腈检测，拉曼仪读取结果，以各浓度的读值(b)与0ng/ml读值(b0)比为纵坐标，以浓度对数为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算出ic50为0.127ng/ml，最低检测限以20％抑制浓度为检测线，计算结果为0.0098ng/ml，约为0.01ng/ml，因此氟虫腈表面增强拉曼金标试纸检测灵敏度设定为0.01ng/ml(10pg/ml)。

实验例2、特异性检测

1、裸眼目测：

以浓度为20μg/ml的百菌清、草甘膦、亚胺硫磷、毒死蜱、对硫磷、马拉硫磷和敌敌畏为样品，采用氟虫腈表面增强拉曼金标试纸条进行检测。结果显示，各检测试纸条的检测线均显色，没有被抑制，说明本发明的试纸条特异性强，与其它农药无交叉反应。

2、拉曼仪检测：

以浓度为20μg/ml的百菌清、草甘膦、亚胺硫磷、毒死蜱、对硫磷、马拉硫磷和敌敌畏为样品，采用氟虫腈表面增强拉曼金标试纸条进行检测。结果显示，上述几种农药ic50值均大于1μg/ml，与氟虫腈ic50的比值均小于0.1％，因此判定本发明试纸条的特异性强，与其它农药无交叉反应。