一种控制酒萸肉炮制工艺参数的指纹图谱建立方法与流程

本发明涉及中药炮制技术领域，具体涉及一种控制山茱萸炮制工艺参数的指纹图谱建立方法。

背景技术：

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸cornusofficinalissieb.etzucc.的干燥成熟果肉；最早收录于《神农本草经》。其酸、涩，微温，归肝肾经；具有补益肝肾，收敛固涩的功效。医圣张仲景以山茱萸为君药组制了“金匮肾气丸”；宋朝太医钱乙所著《小儿药证直诀》对肾气丸进行删减组方“地黄丸”中也包含了“山茱萸”，用以滋补肾阴，治疗小儿尿床等症。后逐渐用于肾虚、头晕耳鸣、腰膝酸软、消渴、遗精等症。

山茱萸目前为止已知的化学成分主要有：环烯醚萜苷类成分(如马钱苷、莫诺苷、山茱萸苷等)、黄酮类(槲皮素、异鼠李素、山奈酚等)、有机酸(没食子酸、熊果酸、齐墩果酸、原儿茶酸等)及鞣质类等成分。有文献报道环烯醚萜苷类成分是山茱萸含量最高的成分群，同时也是山茱萸的特征性成分，故而在山茱萸及酒萸肉的质量控制中具有指导作用；而在诸多文献报道中，5-羟甲基糠醛对人体横纹肌及内脏有损害,同时具有神经毒性,还能与人体蛋白结合产生积累中毒,常被作为葡萄糖输液中的有害物质加以含量控制；德国更是将其列为刺激性危险品。

山茱萸作为补益类药，尽量减少其毒副反应是传统炮制工艺的目的，因此，5-羟甲基糠醛成分的控制非常有必要。虽然山茱萸是按照药典规定的炮制通则0213进行酒蒸，但是具体参数却不确定，黄酒闷润的时间、酒蒸的时间对其有效成分(原儿茶酸、没食子酸、莫诺苷、马钱苷)及毒性成分(5-羟甲基糠醛)含量是否有影响，目前为止都没有明确的研究。

目前通过山茱萸指纹图谱的建立，利用五个指标性成分炮制前后指纹图谱峰面积的变化规律对其炮制工艺及其参数进行优选，有效控制山茱萸炮制中有效成分及控制性成分(5-羟甲基糠醛)领域尚无较好的研究。

技术实现要素：

针对现有技术状况，本发明利用五个指标性成分炮制前后指纹图谱峰面积的变化规律对其炮制工艺参数进行优选，提供一种控制其炮制工艺参数的指纹图谱建立方法，实现有效控制山茱萸炮制中有效成分及控制性成分(5-羟甲基糠醛)。本发明的技术方案如下：

一种控制酒萸肉饮片炮制工艺参数的指纹图谱建立方法，包括如下步骤：

1)对照品溶液的制备：取没食子酸、原儿茶酸、5-羟甲基糠醛、马钱苷、莫诺苷适量置于容量瓶中，以乙醇或50～100％的甲醇溶解定容；

2)供试品溶液的制备：分别取炮制前的山茱萸药材和炮制过程中山茱萸饮片打粉(过三号筛)，精密称取适量，精密量取乙醇或50％～65％甲醇，称定重量，回流或超声，冷却后以同种溶剂补足重量，摇匀，过0.45μm膜备用即可；

3)hplc指纹图谱的建立：

分别吸取步骤1)和2)所得的对照品和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行含量检测：

其中，色谱条件为：色谱柱为反相色谱柱c18，紫外检测器，检测波长为230～250nm，柱温为30～40℃，流动相为乙睛-0.05～0.2％磷酸溶液，梯度洗脱；流速为1.0ml/min，分析时间为100min；所述梯度洗脱顺序表如下：

表1梯度洗脱顺序表

4)以马钱苷为参照峰的标准指纹图谱的制定

吸取步骤2)所得的山茱萸对照品溶液和山茱萸供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10～15批山茱萸药材的指纹图谱、10～15批山茱萸饮片的指纹图谱，制定山茱萸药材标准指纹图谱和饮片标准指纹图谱；其中所述标准指纹图谱具有14个特征峰，其中8号峰为马钱苷；

5)指纹图谱的质量控制

将山茱萸原药材与其分别对应的山茱萸饮片的指纹图谱与步骤4)制定的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度。

其中所述步骤1)对照品溶液的制备优选为下述方法进行：

没食子酸对照品15.03mg、原儿茶酸对照品10.31mg、5-羟甲基糠醛对照品10.12mg、马钱苷对照品5.78mg、莫诺苷对照品6.32mg，置于100ml容量瓶中，加乙醇或50％～65％甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

所述步骤2)供试品溶液的制备优选为下述方法进行：

分别取炮制前的山茱萸药材和炮制过程中山茱萸饮片(过三号筛)0.1～0.5g，精密量取乙醇或50％～65％甲醇20～50ml，称定重量，超声或回流45～90min，冷却后以甲醇补足重量，摇匀，过0.45μm膜备用即可。

所述步骤3)中的色谱柱优选柱长为250mm的c18反相色谱柱，检测波长优选为240nm，流动相优选为乙睛-0.1％磷酸溶液。

所述步骤1)和2)中甲醇浓度优选为50％。

所述步骤2)中超声处理时间优选为45分钟。

所述步骤5)中所述的指纹图谱确定相似度是指将山茱萸原药材与其分别对应的山茱萸饮片的指纹图谱与步骤4)制定的标准指纹图谱进行比对，其相似度为0.9～1.00，共有峰有14个，共有峰峰面积总和占总峰面积的90％以上，以8号峰马钱苷为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积；

其中山茱萸药材包括14个共有峰：各峰的相对保留时间分别为：(1)0.113～0.139、(2)0.167～0.171、(3)0.212～235、(4)0.302～0.328、(5)0.413～0.455、(6)0.461～0.502、(7)0.892～0.915、(s)1.000、(9)1.631～1.650、(10)1.756～1.783、(11)2.042～2.193、(12)2.472～2.513、(13)2.897～2.965、(14)3.087～3.134；各峰的相对峰面积分别为：(1)0.032～0.095、(2)0.023～0.093、(3)0.247～0.745、(4)0.109～0.825、(5)0.077～0.325、(6)0.029～0.314、(7)0.123～0.445、(s)1.000、(9)0.095～0.356、(10)0.558～0.723、(11)0.113～0.236、(12)0.029～0.142、(13)0.753～1.130、(14)0.103～0.752；

本发明所述的酒萸肉为：将洗净的生药山茱萸沥干水，经燀制4～6分钟后，放凉，用黄酒闷润1～1.5小时后，常压蒸1.5～2小时，干燥得到的一种山茱萸饮片。

附图说明

图1马钱苷全波长扫描图

图2莫诺苷全波长扫描图

图3马钱苷hplc图谱

图4莫诺苷hplc图谱

图55-羟甲基糠醛hplc图谱

图6没食子酸hplc图谱

图7原儿茶酸hplc图谱

图8混合对照品

图9山茱萸药材标准指纹图谱

图10燀制与未燀制炮制样品对比图谱

具体实施方式

实施例1

1、试剂与试药

没食子酸(批号：110831-200302，含量测定用，中国药品生物制品检定所)；原儿茶酸(批号：110809-200604，含量测定用，中国药品生物制品鉴定所)；莫诺苷(批号：0424121，天津一方生物科技有限公司)；马钱苷(批号：11640-200502，含量测定用，中国药品生物制品鉴定所)；5-羟甲基糠醛(批号：070102，含量测定用，上海有思生物技术有限公司)；山茱萸(河南产，九芝堂股份有限公司，fm161005)；乙腈为色谱纯(美国tedia公司)，水为超纯水，甲醇(国药集团，ar)。

2、仪器

shimadzulc-20a；lcsolution(日本岛津公司)；zorbaxsbc-18分析柱(4.6mm×250mm，5μm，美国agilent公司)；kq3200de型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；milli-q纯水系统(美国millipore公司)。

3、方法与结果

3.1波长筛选、流动相选择、提取方法与时间选择

采用spd-m20a检测器对样品进行了全波长扫描(见图1-2)，根据3d效果图，综合峰形、峰高、峰面积等因素，选择240nm为检测波长。

考察了不同比例的乙腈-磷酸水等度及其不同比例的梯度考察流动相对样品的洗脱效果，综合考虑图谱分离度、柱效、对称因子等结果，最后选择乙腈-0.1％磷酸梯度洗脱为流动相，又根据样品的检测结果(见图1至图8)，发现所有成分均出峰需要105min，从而确定检测时间为100min。

根据药典中山茱萸的含量测定项下方法，考察了超声和回流对提取率的影响及流动相对其的分离效果，发现超声和回流虽然在莫诺苷和马钱苷的提取率更高，其余成分差别不大，从方便操作考虑选择超声作为提取方式；以甲醇、乙醇为提取溶剂，对其进行考察，发现乙醇提取率极低，甲醇提取率较高，且出峰明显；又考察了不同甲醇浓度(30％、50％、70％、100％)对提取率的影响，发现50％甲醇浓度时，莫诺苷、马钱苷等小极性成分和原儿茶酸和没食子酸及5-羟甲基糠醛等大极性成分提取率达到最佳平衡，因此，选择50％甲醇作为提取溶剂。同时考察了提取时间(30min、45min、60min)，30min时5个指标性成分提取率均较低，而45min、60min时二者相差不大，故而选取45min为最佳提取时间。

通过考察提取方式、提取溶剂、提取时间，最终确定以50％甲醇超声提取45min为最佳前处理方式。

表2提取溶剂的考察

表3提取溶剂浓度的考察

表4提取时间的考察

3.2色谱条件

通过考察检测器、流动相体系、色谱柱、柱温和流速等条件，经过反复优化，得到指纹图谱的最佳色谱条件为：紫外检测器，流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)，梯度洗脱，agilentzorbaxsb-c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为35℃，流速为1.0ml/min，进样量为10μl，检测波长240nm，检测时间：100min。

3.3对照品溶液的制备：

没食子酸对照品15.03mg、原儿茶酸对照品10.31mg、5-羟甲基糠醛对照品10.12mg、马钱苷对照品5.78mg、莫诺苷对照品6.32mg，置于100ml容量瓶中，加50％甲醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

3.4供试品溶液的制备：

分别取炮制前和炮制过程中的山茱萸(过三号筛)0.5g精密称定，精密加入50％甲醇25ml，称重，超声处理45min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

3.5以马钱苷为参照峰的标准指纹图谱的制定

吸取步骤3.3,3.4所得的山茱萸对照品溶液和山茱萸供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的10～15批山茱萸药材的指纹图谱、10～15批山茱萸饮片的指纹图谱，制定山茱萸药材标准指纹图谱和饮片标准指纹图谱；其中所述标准指纹图谱具有14个特征峰，其中8号峰为马钱苷；

上述方法中图谱见附图1-9。

3.6指纹图谱的质量控制

将山茱萸原药材与其分别对应的山茱萸饮片的指纹图谱与步骤4)制定的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度。3.6重复性、精密度、稳定性考察：

取供试品溶液于同1d内重复进样连续进样6次，计算原儿茶酸、没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷峰面积rsd％，考察仪器日内精密度。

取样品，分别制备6份，进行测定，计算5个指标性成分的峰面积rsd％，考察方法的重复性。

分别在0，2，4，8，12，24h对同一供试品溶液进行测定，记录5个指标性成分的峰面积，计算出相对保留时间和相对峰面积rsd％，以考察样品的稳定性。

表6方法学考察结果

由上述结果可知，该指纹图谱方法来控制炮制过程中的酒萸肉饮片的质量可行。

4、指纹图谱技术控制下的酒萸肉炮制工艺参数研究

本实施例所述的酒萸肉的制备方法考察中，其制备方法为将洗净的生药山茱萸沥干水，经燀制1-5分钟后，放凉，用黄酒闷润40-120分钟后，常压蒸50-150分钟，干燥得到的山茱萸饮片；其中燀制、闷润时间及蒸制时间考察：

样品：山茱萸(河南产，九芝堂股份有限公司提供，fm161005)

根据上述指纹图谱技术方法，以炮制前后马钱苷、莫诺苷、没食子酸、原儿茶酸、5-羟甲基糠醛的峰面积做对比，以单因素考察方式比较炮制前、燀制后1分钟、3分钟、5分钟，闷润40分钟、80分钟、120分钟，蒸制50分钟、100分钟、150分钟后5个特征性成分的峰面积的变化；结合燀制、闷润及蒸制时间，择取马钱苷、莫诺苷、没食子酸、原儿茶酸最高含量或者损失最小，5-羟甲基糠醛最低含量的最佳炮制时间。(做平行3份样品，取平均值。)

以同一批样品对其进行初步挑选后，以指纹图谱方法对其炮制前、燀制1分钟、3分钟、5分钟，加黄酒闷润40分钟、80分钟、120分钟，蒸制50分钟、100分钟、150分钟时分别取样并分析，以没食子酸、原儿茶酸、莫诺苷、马钱苷的含量(峰面积值)最高或者损失最小及5-羟甲基糠醛含量(峰面积值)最低时为燀制、闷润及蒸制的最佳时间；最终确定燀制5分钟、闷润80分钟、蒸制时间100分钟可达到同时最佳。具体分析结果见下表7和图10。

表7实施例炮制参数及数据表

同上述山茱萸炮制工艺考察方法，以同一批样品对其进行初步挑选后，以建立的指纹图谱方法对其炮制前、加黄酒闷润40分钟、80分钟、120分钟，蒸制50分钟、100分钟、150分钟时分别取样并分析，以没食子酸、原儿茶酸、莫诺苷、马钱苷含量最高或者损失最小及5-羟甲基糠醛含量最低为燀制、闷润、蒸制的最佳时间；最终确定闷润80分钟、蒸制时间100分钟可达到同时最佳。结果见下表：

表8对比例炮制参数及数据表

对比结论：与燀制过的样品相比，未燀制得到的炮制品中没食子酸、原儿茶酸、莫诺苷、马钱苷等成分比燀过得炮制品的含量相差不大，略有增加，但是5-羟甲基糠醛保留量却比燀制多出一倍。因此，燀制在山茱萸炮制过程中很有必要。