一种NHS残留的检测方法与流程

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种nhs残留的检测方法，更具体的是一种nhs残留的液相色谱检测方法。
背景技术：
：n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)是一种重要的有机合成中间体，在医药生产领域中应用广泛，同时也可以用于合成丁胺卡那霉素、放射性药物的标记、制造生物医学材料。nhs也是一种生物相容性较好的新型交联剂，可用作胶原、明胶等三维网状结构的生成，其交联效率高，交联较为稳定，毒性低，近年来越来越受到关注。交联工艺完成后，交联剂本身的残留定量检测是个亟待解决的问题，但目前nhs残留含量的检测方法并不成熟，如本发明前期尝试了反相色谱法和体积排阻色谱法，发现均不能满足检测需求，故急需寻找到一种高效、精准的nhs残留检测方法。技术实现要素：本发明目的在于填补现有技术空白，提供一种新的准确、快速、可靠和高灵敏度的nhs残留的液相检测方法。本发明首先提供了一种nhs残留的检测方法，该方法采用液相色谱检测，所述液相色谱优选亲水性液相色谱(hilic)。优选的，所述液相色谱检测方法以键合了酰胺基团的亚已基桥杂化颗粒(beh)为固定相。优选的，所述液相色谱检测方法中流动相由ph值为9.0的10mm乙酸铵溶液和乙腈组成。优选的，所述液相色谱检测方法中检测波长为265nm。优选的，所述液相色谱检测方法中流速为0.2ml/min。优选的，所述液相色谱检测方法中柱温为30℃。优选的，所述液相色谱检测方法中洗脱方式为等度洗脱。优选的，所述液相色谱检测方法检测时，配制nhs的标准品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，绘制nhs的标准曲线；供试品按照相同的检测条件进行检测，根据标准曲线计算供试品中nhs的含量。本发明的nhs液相检测方法，不同于以往的反相分离模式，样品无需进行柱前特殊处理，操作简单快捷，准确度高，灵敏度高，能够满足日常检测需求。附图说明图1反相色谱法nhs的出峰情况；图2不同乙腈含量下nhs的出峰情况；图3体积排阻色谱法nhs的出峰情况；图4不同流动相下nhs的出峰情况；图5不同溶剂条件下nhs的出峰情况；图6不同ph条件下nhs的出峰情况；图7全波长扫描；图8不同乙酸铵浓度下nhs的出峰情况；图9不同柱温下nhs的出峰情况；图10不同洗脱方式下nhs的出峰情况，其中a为梯度洗脱色谱图；b为等度洗脱色谱图；图11不同浓度nhs液相检测图谱中峰面积和对应浓度的标准曲线。具体实施方式实施例1比较实施例nhs的检测方法较少，而发明人也尝试了多种检测方法，均未能取得理想的效果，其中以反相色谱法和体积排阻色谱法为例做如下说明：1.1反相色谱法检测nhs仪器：品牌型号：watersacquityuplchclass；bioquaternarysolventmanager；biosamplemanager-ftn；pdadetector；empower3.0数据处理软件色谱柱：watersbehc18，1.7μm，2.1×50mm流动相：20mmph6.5磷酸缓冲液：乙腈＝95:5(v/v)流速：0.2ml/min，检测波长210nm，进样量10μl，样品池温度10℃，色谱柱温25±5℃。结果如图1所示，从图中可以看出nhs较早的洗脱至柱外，在色谱柱上无保留。故对流动相进行调整，降低有机相的比例，结果如图2所示，发现即使调整了流动相中有机相的比例，nhs仍难以在色谱柱上有所保留。1.2体积排阻色谱法检测nhs仪器：品牌型号：watersacquityuplchclass；bioquaternarysolventmanager；biosamplemanager-ftn；pdadetector；empower3.0数据处理软件色谱柱：acquityuplcbeh125sec1.7μm，4.6mm*300mm流动相：含10％含异丙醇(v/v)的20mmph7.5磷酸盐缓冲液流速：0.2ml/min，检测波长265nm，进样量10μl，样品池温度10℃，色谱柱温25±5℃。结果如图3所示：在该条件下，nhs峰形较差，不利于后续的含量的测定。2.在尝试了多种检测方法和不同条件摸索，均未得到理想的分离效果后，发明人偶然间尝试了亲水作用色谱(hilic)，却取得了理想的检测效果。通过实验，对比反相(rp)和亲水作用色谱(hilic)两种不同分离模式对nhs的保留时间的影响，结果见表1(流速等条件参见上述反相色谱法)：表1不同分离模式对nhs保留时间的影响rp分离中无保留的nhs在hilic分离模式下，保留时间明显增加，为nhs含量的检测提供一个新的思路。故继续针对hilic的分离，对其色谱条件进行筛选和优化，以得到更优的峰形。2.1流动相添加剂的选择比较了三种流动相条件(①a:含0.1％tfa的水溶液，b：含0.1％tfa的乙腈溶液；②a:水，b：乙腈；③a:含10mmph9.0的乙酸铵水溶液；b：含10mmph9.0的乙酸铵乙腈溶液)，并按以下梯度洗脱，出峰情况见图4，时间(min)流速(ml/min)％a％b00.259550.2595200.2505020.010.2595250.2595从上述实验结果可以发现，当流动相中添加乙酸铵时，即流动相为a:含10mmph9.0的乙酸铵水溶液；b：含10mmph9.0的乙酸铵乙腈溶液时；样品在色谱柱上的保留增强，分离效果更佳。2.2样品溶剂的选择根据上述优化的流动相条件，考察不同溶剂条件下nhs的出峰情况如图5所示，从图中可见nhs用水稀释溶解时，由于水的极性较强，峰形扭曲，而改用有机相(含10mmph9.0的乙酸铵乙腈溶液)作为溶剂时，峰形明显改善。2.3流动相ph的选择根据上述优化的流动相条件下，考察不同ph对出峰的影响。如图6所示，ph为9.0时，峰形和分离度相对更好。2.4检测全波长的确定根据上述优化的流动相条件下，对nhs样品进行全波长扫描，结果如图7及图5所示，结果表明，15.366min处为溶剂峰，9.058min处为nhs的出峰，故确定265nm为nhs的最大吸收波长，检测波长更改为265nm。2.5添加剂浓度的选择根据上述优化的流动相条件下，考察不同乙酸铵浓度对出峰的影响。从图8可以看出，添加剂乙酸铵浓度过低或过高不仅会引起保留时间的变化，同时也导致峰形变差，乙酸铵浓度为10mm时峰形较好。2.6柱温的选择根据上述优化的流动相条件下，考察不同柱温对出峰的影响。从图9可以看出，提高柱温，保留时间不断前移，也会导致主峰变歪，同时考虑较高的柱温会影响色谱柱的使用寿命，故而选择30℃的柱温。2.7洗脱方式的选择根据上述优化的流动相条件下，比较了以下两种洗脱方式对保留时间的影响：(1)梯度洗脱：a:含10mmph9.0的乙酸铵水溶液；b:含10mmph9.0的乙酸铵乙腈溶液时间(min)流速(ml/min)％a％b00.259550.2595200.2505020.010.2595250.2595(2)等度洗脱：含ph9.010mm乙酸铵的95％的乙腈溶液将100mmnhs标准品溶液用流动相稀释至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mm的梯度标准品溶液进样，结果如下：如图10所示，梯度洗脱时，随着进样次数，保留时间不断前移，出峰不稳定；等度洗脱时，保留时间更为稳定。根据上述方法优化的过程，最终确定nhs残留的液相检测方法，具体如下：采用watersglycanbehamide(1.7μm，2.1×150mm)为色谱柱，以含ph9.010mm乙酸铵的95％的乙腈溶液为流动相，上样量为10μl，检测波长为265nm，流速为0.2ml/min，柱温为30℃，采集时间为20min。实施例2方法验证1.相关溶液的配制1.1流动相的配制ph9.0200mm乙酸铵备用缓冲液：称取15.4g的乙酸铵加入适量的去离子水溶解后，加入约8ml的氨水，用ph计调节至9.0后，再加水定容至1l。含ph9.010mm乙酸铵的95％的乙腈溶液：在950ml乙腈溶液中加入50ml200mm的乙酸铵备用缓冲液，混匀并超声脱气10min，待用。1.2nhs标准品的配制称取115.09mgnhs溶解于10ml流动相，制得100mm的nhs标准品溶液，再用流动相稀释至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mm的梯度标准品溶液。2.仪器及参数2.1uplc(含紫外检测器)品牌：waters，型号：h-class；2.2色谱柱品牌：waters，型号：glycanbehamide，1.7μm，2.1×150mm；2.3色谱条件以含ph9.010mm乙酸铵的95％的乙腈溶液为流动相，上样量为10μl，流速为0.2ml/min，检测波长为265nm，柱温为30℃，采集时间为20min。3.方法验证3.1标准曲线将上述制备的0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mm的梯度标准品溶液，依次注入液相色谱检测，结果如下表，峰面积和浓度的标准曲线为：y＝2,384,958.2466x-9,489.4274，r2为0.9999。表2梯度标准品溶液的液相分离相关参数结果通过标准曲线结果，如图11，可以看出，nhs在0.1mm-1.0mm范围内线性较好，且可以满足日常nhs残留的检测。3.2重复性平行制备6份0.5mmnhs标准品溶液进样检测，结果如下，保留时间和峰面积的rsd值分别为0.18％和0.54％，均小于2％。表3重复性考察结果样品保留时间面积110.4151095502210.4161087752310.4381082718410.4411080797510.451080232610.4631088661mean10.4371671085943.7std0.01890415857.1656rsd0.180.543.3准确度由于供试品中未检测到nhs，故在供试品中添加一定量的nhs标准品溶液，制成低中高(0.1、0.4、0.8mm)三个浓度的样品，每个浓度平行3个样品。结果如下，平均回收率为100.79％，在90-110％的要求范围内，rsd为1.53％，小于2％，符合要求。表4准确度考察结果当前第1页12