本发明涉及免疫学领域、化学发光分析、肿瘤标志物检测和多组分免疫分析等领域，具体涉及了一种基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。
背景技术：
上世纪70年代中期arakawe首先报道了化学发光分析，发展至今已成为一种超微量活性物质检测技术，是公认的肿瘤标志物和各种激素最精确和成熟的检测方法之一。化学发光免疫分析是化学发光法和免疫分析法结合的产物，同时具有化学发光的高灵敏度和免疫分析法的高特异性。指利用化学发光系统作为免疫反应的指示系统，借以定量检测抗原或抗体的方法。近年来，无标记免疫分析受到人们的普遍关注与研究，在疾病检测、药物分析、环境监测和食品安全检测等方面已得到了广泛的应用。无标记免疫分析是指检测过程中无需预先对抗体或抗原进行标记，具有检测成本低，样品消耗少，分析速度快，操作简单等显著优势，适应直接、实时、原位、在线的痕量免疫分析。在此我们使用包埋法将三维笼型氢氧化铜固定于传感器界面以实现无标记免疫分析。
传统的化学发光免疫分析中常以辣根过氧化物酶（hrp）作为标记物来催化鲁米诺-过氧化氢体系发光从而实现高灵敏检测。但天然酶具有稳定性差、提取困难、来源有限等缺点制约了它的生产和应用。相对于天然酶，人工合成具有似过氧化物酶活性的模拟酶具有比表面积大、易于功能化、稳定性好等优势。近年来，越来越多的纳米模拟酶被合成应用，主要包括金属纳米颗粒、碳纳米材料、磁性颗粒、量子点以及这些纳米材料的复合物等。在此，我们合成了一种三维笼型氢氧化铜，尺寸大小为150~200nm，是一种具有内源性模拟酶活性的纳米材料。三维笼型氢氧化铜的合成方法简单且在常温下即可合成，由纳米针状氢氧化铜自组装形成的三维笼型氢氧化铜，其三维结构是由针状氢氧化铜组装而成，因此其比表面积很大且铜离子的似过氧化物酶活性好，因此三维笼型氢氧化铜其催化活性可与天然酶媲美，且大大改善了天然酶固有的缺陷，但尚未应用到化学发光免疫分析领域中。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。其基本思路是：首先将用壳聚糖溶液等体积分散的三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶包埋于丝网印刷环氧硅烷化载玻片的免疫微孔表面；然后将链霉亲和素覆盖涂布于三维笼型氢氧化铜-壳聚糖膜上；再借助链霉亲和素对生物素的特异性识别特性来固定多种生物素化抗体；随后用牛血清蛋白封闭液以封闭非特异性位点后即成功构建多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。当在传感器界面修饰多组分抗原样品，最后滴入化学发光底物。抗原与抗体特异性反应所形成的免疫复合物会阻碍三维笼型氢氧化铜模拟酶对化学发光底物的催化作用，从而导致化学发光信号减弱。
为了达到上述目的，本发明技术方案如下：
本发明提供了一种基于三维笼型氢氧化铜的多组肿瘤标记物无标记化学发光免疫传感器。在丝网印刷载玻片的免疫微孔阵列表面成功构建化学发光免疫传感界面，该界面依次包括环氧硅烷化层作为载体连接层；纳米模拟酶-壳聚糖层作为化学发光信号层；链霉亲和素层作为抗体连接层；生物素化抗体层作为免疫反应识别层。
进一步地，所述免疫微孔阵列是利用丝网印刷技术并借助模板在可抛式的环氧硅烷化载玻片上印刷形成多个微孔的免疫微孔阵列。
更进一步地，所述免疫微孔阵列是利用丝网印刷技术并借助模板在可抛式的环氧硅烷化载玻片上印刷形成4排12列共48个微孔的免疫阵列。
本发明还提供了一种构建基于三维笼型氢氧化铜的多组分无标记化学发光免疫阵列传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将可抛式载玻片浸泡于水虎鱼酸溶液中活化使其表面暴露有羟基，去离子水冲洗并晾干后，再浸泡于含有1%gptms的甲苯溶液中使其硅烷化，先用甲苯后用乙醇冲洗，自然晾干，制成环氧硅烷化载玻片。
（2）利用丝网印刷技术并借助模板将环氧硅烷化载玻片印刷成四排*十二列格式即具有48个免疫微孔的反应阵列。
（3）将氢氧化铜纳米材料超声分散于去离子水中，壳聚糖溶液与氢氧化铜溶液等体积混合并震荡均匀，将该混合液滴涂于环氧硅烷化微孔阵列中，室温晾干即得含有三维笼型氢氧化铜模拟酶的壳聚糖膜；
（4）在上述三维笼型氢氧化铜-壳聚糖膜表面覆盖滴上链霉亲和素，在室温下反应，再放置于3℃下晾干；
（5）将多组分的生物素化抗体滴涂于链霉亲和素功能化的四列免疫微孔阵列的表面，即可通过链霉亲和素特异性识别生物素而成功修饰多组分抗体。温育一段时间后，用磷酸盐缓冲溶液小心冲洗载玻片，然后在氮气氛围下吹干；
（6）将牛血清蛋白封闭缓冲溶液滴涂于上述成功修饰多组分抗体的微孔中，在3℃下封闭。用磷酸盐缓冲溶液小心冲洗载玻片，然后在氮气氛围下吹干，即制得多组分无标记免疫阵列传感器。
其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（1）中，水虎鱼酸溶液是体积比7：3的h2so4和h2o2组成，活化8~12小时。含有1%gptms的甲苯溶液需浸泡过夜以完成硅烷化；
其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（2）中，借助模板印刷油漆形成疏水性无光活性膜，膜内微孔直径2mm，边缘间距4mm。
其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（3）中，三维笼型氢氧化铜浓度为0.5~2.0mg/ml，壳聚糖溶液的浓度为0.5~1.5wt%。
其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（4）中，链霉亲和素溶液的浓度为50~200μg/ml。
其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（5）中，生物素化抗体的浓度为1.0~5.0μg/ml，放置于室温下温育3小时
其中，上述的多组分无标记免疫阵列传感器制备方法的步骤（6）中，牛血清蛋白封闭溶液的浓度为10~50mg/ml，保鲜密封于3℃下封闭过夜。
本发明达到了如下有益效果：
本发明成功构建了一种基于三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，首先借助环氧硅烷化的丝网印刷载玻片表面制作了高通量免疫微孔阵列；将壳聚糖分散的三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶溶液包埋于微孔中；然后链霉亲和素覆盖于氢氧化铜-壳聚糖膜表面；借助链霉亲和素对生物素的特异性识别从而有效地固定多种生物素化抗体；最后用牛血清蛋白封闭非特异性位点后即成功制备多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。在传感器界面温育上相对应的肿瘤标志物抗原，利用电感耦合ccd即能同时检测多组分肿瘤标志物的化学发光信号，因此提供了一种基于三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器的制备方法。本发明具有如下优点：
（1）本发明利用丝网印刷技术并借助模板在环氧硅烷化载玻片上制成可抛式化学发光成像免疫微孔阵列，是能够提供多组分肿瘤标志物同时检测的阵列。多组分检测的优势不仅仅在于其极大简化操作过程，具有分析通量高、所需时间短、样品消耗少、分析成本低等显著优势，而且多组分肿瘤标志物同时检测能够大大提升诊断的准确性。
（2）本发明所合成材料是有针状氢氧化铜纳米材料自组装形成的三维笼型氢氧化铜，尺寸大小为150~200nm，由针状氢氧化铜自组装形成的三维结构具有很大的比表面积，而且合成方法简单，材料价格低廉，稳定性好。三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶具备内源性模拟酶性质且因其三维结构更增强了其催化活性。将三维笼型氢氧化铜引入化学发光体系来代替辣根过氧化物酶，改善了天然酶不稳定、易受环境影响、不易获取等缺点。因此基于三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶构建的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，其发光强度与天然酶相似，而灵敏度和稳定性却能得到显著的提升，同时大大减低了制作传感器的成本。
（3）本发明使用了链霉亲和素-生物素固定法，一分子链霉亲和素与四分子生物素相结合，两者之间的亲和力极为强烈。首先链霉亲和素通过静电吸附固定到传感器表面，随后通过生物素-亲和素特异性作用能高效地固定抗体。因此链霉亲和素-生物素固定法不仅仅起到了固定作用，还有放大信号作用。
（4）本发明使用的是无标记免疫分析技术并利用包埋法将三维笼型氢氧化铜包埋于传感器底层。首先将三维笼型氢氧化铜-壳聚糖滴涂于微孔中，利用壳聚糖的成膜性将氢氧化铜纳米模拟酶包埋于界面。然后通过链霉亲和素-生物素专一性亲和力将多组分抗体修饰于氢氧化铜模拟酶表面。最后在化学发光信号层修饰上免疫识别层，免疫反应后，抗体与抗原特异性结合后，在氢氧化铜模拟酶表面形成免疫复合物而阻碍化学发光底物向化学发光信号层扩散抑制了化学发光反应。无标记免疫分析技术能够直接测定生物样品，测定过程中无需预先对抗体或抗原进行标记，具有检测成本低，样品消耗少，耗费时间短，操作简单等显著优势，适应直接、实时、原位、在线的痕量免疫分析。
附图说明
图1一种基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器的制备方法示意图。
图2本发明afp、cea检测的化学发光成像图以及线性回归曲线。
具体实施方式
为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合具体实施方法及附图对本发明做进一步介绍。
实施例1
本发明构建了一种基于三维笼型氢氧化铜检测多组分肿瘤标志物的无标记化学发光成像免疫阵列传感器。利用丝网印刷技术并借助模板在可抛式的环氧硅烷化载玻片上印刷形成4排12列共48个微孔的免疫阵列，然后将用壳聚糖分散的氢氧化铜模拟酶包埋于微孔，随之链霉亲和素滴涂于氢氧化铜-壳聚糖膜表面。通过链霉亲和素与生物素的专一性亲和力成功固定多种生物素化的抗体，牛血清蛋白溶液封闭非特异性位点后，再通过抗原抗体特异性识别温育上相对应的抗原。利用化学发光的减弱和抗原浓度呈直接线性关系，从而实现对多组分抗原样品的检测。
本发明提供了一种多组分同时检测afp、cea的方法。免疫微孔阵列中包含了4排*12列共48个检测微孔，每个微孔直径2mm。将afp、cea抗原分别固定于不同两排。每一列可检测一种肿瘤标志物的两种不同浓度的抗原样品，那么两排即可同时检测一种肿瘤标志物的24个抗原样品。
如图1：一种基于三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶能同时检测多组分肿瘤标志物的无标记化学发光成像免疫阵列传感器的制备方法包括以下步骤：
（1）将载玻片浸没于水虎鱼酸溶液中（h2so4：30%h2o2=7：3，v/v）活化8~12小时使玻璃片表面暴露有羟基，用去离子水冲洗自然晾干或是氮气氛围下吹干；然后再用1%gptms甲苯溶液浸泡处理过夜使其硅烷化，先用甲苯冲洗，再用乙醇冲洗，以除去玻璃片表面吸附的硅烷试剂，自然晾干，即制成环氧硅烷化载玻片；
（2）经过（1）处理好的载玻片表面借助模板印刷上一层疏水无光活性膜制成4*12共48个直径为2mm的微孔；
（3）取0.5mg三维笼型氢氧化铜纳米材料超声分散于1.0ml去离子水中，取0.5mg/ml三维笼型氢氧化铜纳米材料悬浮液与0.5wt%壳聚糖溶液等体积混合震荡至均匀，将氢氧化铜-壳聚糖混合溶液分别滴入48个微孔中，每个微孔滴入量为5μl。放置于室温下反应待至晾干形成三维笼型氢氧化铜-壳聚糖膜；
（4）在三维笼型氢氧化铜-壳聚糖膜表面覆盖滴入5μl的50μg/ml链霉亲和素溶液，室温下反应30min后放置于3℃下晾干。
（5取5μl的1μg/ml生物素化afp抗体滴入链霉亲和素功能化载玻片的任意两排共24个微孔中；再取5μl的3μg/ml生物素化cea抗体滴入链霉亲和素功能化载玻片的其余两排的微孔中，每个微孔滴入的量均为5μl。室温下保鲜密封温育3小时，在用磷酸盐缓冲溶液小心冲洗三次，氮气氛围下吹干。
（6）将5μl的0.01g/ml牛血清蛋白滴入每一个微孔，3℃下保鲜密封温育12小时后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗三次并于氮气氛围下吹干后，即制得该多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器。
实施例2
对实施例1中所构建的一种基于三维笼型氢氧化铜纳米模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器进行的免疫分析方法包括如下步骤：
1、制作具有线性关系的标准曲线
（1）将5μl已稀释成不同浓度的afp和cea的抗原标准样品分别滴入固定了相对应抗体的检测微孔中，在线温育25~35分钟，磷酸盐缓冲溶液冲洗三次后再置于氮气氛围下吹干。
（2）将5μl化学发光底物溶液（由5mm鲁米诺、0.6mm对碘苯酚及4mm过氧化氢组成）迅速滴入48个反应微孔中，将载玻片放入电感耦合ccd中动态积分收集化学发光信号4分钟后，显示成不同强度的光斑图。由配套的软件alphaviewsa识别分析所得到的化学发光成像图的发光点。在每个微孔中心去固定直径的圆形，利用平均像素强度来计算每个点的化学发光强度。
如图2所示，所测定的一系列浓度afp、cea抗原的标准样品，得到afp、cea抗原标准样品的化学发光成像图以及afp、cea测定的工作曲线。在最佳的分析条件下，化学发光强度随着afp或cea抗原浓度的增加而下降，线性回归方程分别为icl=59565.12534-560.01876c[afp]，icl=62616.35213-825.67379c[cea]。从图2的线性曲线中可以看出，检测afp和cea的线性范围分别为0.01~100ng/ml（r2=0.98471）和0.01~75ng/ml（r2=0.99641）。该化学发光成像图以及afp、cea测定的工作曲线，为临床免疫诊断提供了一种可视、灵敏、可靠、快速、高通量的检测分析方法。
以上所述，仅为本发明较好实施案例，并非是对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施案例所作简单的修改、等效物替换及条件优化等，仍属于本发明技术方案的保护范围内。