本发明涉及微生物技术领域，具体的是涉及一种体外仿生评价微生物降解霉菌毒素的方法。
背景技术：
霉变的饲料中含有霉菌毒素，其中主要为镰孢霉毒素。镰孢霉毒素中最重要、数量最多的是单端孢霉烯类毒素，其中，a类单端孢霉烯包括：t-2毒素、ht-2毒素、镰孢菌酸(neosolaniol，neo)和双乙酸基藨草烯醇(das)；b类单端孢霉烯包括：脱氧瓜萎镰孢菌烯醇(don)及其3-乙酰基或15-乙酰基衍生物、雪腐镰孢菌烯醇(niv)和镰孢菌烯酮-x(fusarenon-x，fx)。畜禽单端孢霉毒素族中毒后的临床症状一般表现为食欲减退或废绝，胃肠炎症和出血，呕吐，腹泻，坏死性皮炎，运动失调，血凝不良，贫血和白细胞数量减少，免疫机能降低和流产等。该类毒素能明显影响食欲，故临床上很少见到急性中毒现象。霉变的饲料被动物采食后，毒素及其代谢产物可残留在畜产品及其加工制品中，通过食物链进入人体，这些具有极强致病及致癌作用的毒素严重威胁人类的健康。
霉菌毒素污染已经成为全球畜禽饲料和人类食品安全无时不在的威胁因素；所以，有效控制和解决霉菌毒素对粮食和饲料的污染，对改善动物生产性能和提高人类食品安全有非常重要的意义。国内外研究者已报到多株降解呕吐毒素的微生物，但各菌株对毒素的降解效率高低有别，且大部分研究结果报道的是所筛选到的菌对呕吐毒素标准品的降级效果，而没有关于菌对发霉饲料中呕吐毒素的降解效果和评价方法。通过动物试验进行体内评价成本高、耗时长。如何进行快速有效的体外评价微生物对饲料及原料中呕吐毒素的降解效果是目前生产实际所迫切需求的。
技术实现要素：
本发明的要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏快速、有效的体外评价微生物对饲料及原料中呕吐毒素的降解效果的方法，提供一种体外仿生评价微生物降解呕吐毒素的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种体外仿生评价微生物降解霉菌毒素的方法，包括步骤如下：
(1)将饲料通过仿生消化法进行消化；
(2)在消化后的体系中加入微生物和培养基组分，进行降解培养；
(4)培养结束后，烘干体系水分，采用免疫亲和柱-高效液相色谱法检测降解前后体系中的霉菌毒素的含量，计算得到霉菌毒素的降解率。
上述方法中，还包括：在步骤(1)之前，设置一系列不同的肠道外源酶混悬液用于体外仿生消化法，测定用不同肠道外源酶混悬液的仿生消化法消化后的饲料的干物质消化率，通过最高干物质消化率，确定仿生消化法中使用的最优肠道外源酶混悬液。
上述方法中，所述仿生消化法包括：体外模拟动物口腔、胃、小肠三部分消化道，其中：
口腔模拟的方法为：称取一定量的饲料加入缓冲溶液中，调节ph到6.8，混匀；然后加入淀粉酶溶液，得到口腔模拟体系，摇床消化1-3h；
胃模拟的方法为：在消化后的口腔模拟体系加入hcl溶液，调节ph至2.0，加入酸性外源酶混悬液，混匀，得到胃模拟体系，封口，摇床消化4-8h；
小肠模拟的方法为：在消化后的胃模拟体系中加入naoh溶液，调节ph至6.8，加入肠道外源酶混悬液，得到肠道模拟体系，封口，摇床消化15-20h。
上述方法中，所述淀粉酶溶液为3-8mg/ml；所述酸性外源酶混悬液为15-25mg/ml的混悬液；所述肠道外源酶混悬液包括：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶；其中，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的三者的总质量和果胶酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶四者的总质量比为3-5:1，所述蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的质量比＝1:1:1、2:1:1或3:1:1，所述蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶三者的总浓度为5-10mg/ml。
上述方法中：
所述淀粉酶溶液制备方法为：将淀粉酶溶于pbs(0.1m、ph6.8)缓冲溶液中，制备得到3-8mg/ml的淀粉酶溶液，其中淀粉酶的规格为30-50u/mg；
所述酸性外源酶，优选的，为胃蛋白酶；
所述为酸性外源酶混悬液的制备方法为：将酸性外源酶溶于0.2mhcl溶液中，制备得到15-25mg/ml的酸性外源酶混悬液；优选，规格为30-70u/mg胃蛋白酶；
所述肠道外源酶为混悬液的制备方法为：将蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶溶于pbs缓冲溶液中，总浓度为5-10mg/ml，其中，蛋白酶：淀粉：脂肪酶质量比为1:1:1、2:1:1或3:1:1，将其他四种酶按比例溶液pbs缓冲溶液中，然后将两者混合。
其中，蛋白酶，优选中性蛋白酶，其中各种酶规格为：中性蛋白酶(100000u/g)、淀粉酶(≥7000u/g)、脂肪酶(100000u/g)、果胶酶(≥30000u/g)、纤维素酶(≥20000u/g)、甘露聚糖酶(≥50000u/g)、木聚糖酶(≥20000u/g)。
上述方法中，所述方法中饲料、缓冲溶液、淀粉酶溶液、hcl溶液、酸性外源酶混悬液、naoh溶液、肠道外源酶混悬液的质量、体积比为：2g：20-30ml：1-1.5ml：8-12ml：1-1.5ml：4-7ml：2-3ml。
上述方法中，所述缓冲溶液为0.1m、ph6.0的pbs缓冲溶液；所述hcl溶液为0.2m的hcl溶液，所述naoh溶液为0.6m的naoh溶液。
上述方法中，所述摇床消化的条件为：温度为37-39℃，转速为150r/min。
上述方法中，所述降解培养的方法为：37℃培养箱中避光培养48h。
上述方法中，所述微生物为能降解呕吐毒素的细菌，优选的，所述微生物为枯草芽孢杆菌，最优选的，所述微生物为枯草芽孢杆菌ansb471，其保藏号为cgmccno.7344。
上述方法中，所述霉菌毒素为呕吐毒素(don)。
上述方法中，所述饲料干物质消化率测定方法为：
(1)将饲料放入100～105℃±2℃烘箱内，烘3～4h后，移入干燥器中，冷却30min，称重，为消化前干物质重。
(2)将消化后的消化体系5000r/min离心20min，收集沉淀并测定其干物质含量，为消化后干物质重。测定方法为：将沉淀放入烘干箱，65℃、烘干12h，移到室外冷却3～4h回潮，然后置于105℃烘箱中烘4h，置于干燥器中冷却30min后称重。
所述干物质消化率的计算方法为：干物质消化率＝(消化前干物质重-消化后干物质重)/消化前干物质重×100％。
上述方法中，所述的测定体系中霉菌毒素的方法为：按25g饲料计算，加入100ml的甲醇水溶液(v/v，6:4)，然后高速搅拌提取3min，静置，过滤。用pbs缓冲液稀释滤液，使甲醇含量低于10％，然后过滤，直至样品不再混浊。将免疫亲和柱接于10ml玻璃注射器筒下。去掉亲和柱下方堵头，排空亲和柱中保护液。加入10ml滤液于免疫亲和柱中，调节滤液以1ml/min左右流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。然后加入10％的甲醇水10ml于免疫亲和柱中冲洗2次，控制流速为3ml/min左右。直至空气进入亲和柱中，弃去流出液。最后分两次各加入0.5ml甲醇，分别孵育2min，流速为1ml/min左右，收集洗脱液。40℃氮气吹干，溶于流动相，用于hplc分析。
上述方法中，所述霉菌毒素降解率公式如下：
霉菌毒素的降解率＝[(未加微生物和培养基的对照组样品中霉菌毒素含量－加微生物和培养基组分的试验组样品中霉菌毒素含量)/未加微生物和培养基的对照组样品中霉菌毒素含量×100％]/干物质消化率。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的体外仿生评价微生物降解霉菌毒素的方法，克服了通过动物试验进行体内评价成本高、耗时长的缺点，通过模拟动物的消化系统的消化过程，更接近于动物体内的真是情况，能够快速、有效、准确地在体外评价微生物对饲料中霉菌毒素的降解效果。本发明的方法不局限用于饲料领域，该方法可用于食品、粮食、及农副产品加工领域，有效评价微生物对食品、粮油及农副产品中霉菌毒素的降解效果。
具体实施方式
下面将通过具体的实施例对本发明作进一步详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。以下实施例中所使用的试剂和仪器，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
1、本发明仿生消化法具体步骤为：
口腔模拟：准确称取饲料2g，放入100ml锥形瓶中，加入25mlpbs(0.1mph6.0)，调ph到6.8，混匀。加入1ml配制好的淀粉酶溶液，39℃、150r/min消化2h；
所述淀粉酶溶液的制备方法为：将100mg规格40u/mg的淀粉酶溶于20mlpbs(ph6.8)中，终浓度为5mg/ml(200u/ml)。
胃模拟：加10ml0.2mhcl，用1mhcl或1mnaoh溶液调ph至2.0，加1ml新鲜配制的酸性外源酶混悬液，混匀，用parafilm封口，于39℃恒温摇床培养6h(150r/min)；
所述酸性外源酶的制备方法为：将规格50u/mg胃蛋白酶200mg溶于10ml0.2mhcl中，所制成的混悬液的浓度为20mg/ml(1000u/ml)。
小肠模拟：再加入5ml0.6mnaoh溶液，用1mhcl或1mnaoh将ph调到6.8后加入2ml新鲜配制的肠道外源酶混悬液，用parafilm封口，于39℃恒温摇床分别培养18h(150r/min)。
所述肠道外源酶混悬液的制备方法为：分别按蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶质量比为1:1:1、2:1:1或3:1:1制备三种肠道外源酶混悬液，这三种酶总量为480mg，分别溶于30mlpbs缓冲溶液中；分别称取其他四种酶包括果胶酶(≥30000u/g)、纤维素酶(≥20000u/g)、甘露聚糖酶(≥50000u/g)、木聚糖酶(≥20000u/g)，各酶量分别为10mg，溶于10mlpbs缓冲溶液中。将含有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的溶液和其他四种酶的溶液再按体积1:1比例混合。现配现用，用前摇匀。
2、本发明饲料及原料干物质消化率测定方法：
先将称量铝盒烘干至恒重(105℃，1h)，用坩埚钳取出放入干燥器中冷却30min后称重(称量铝盒放入烘箱时应开1/3盖，冷却和称重时应盖严)。
取30g饲料与恒重的称量铝盒m1，将称量铝盒同样本一起放入100～105℃±2℃烘箱内，揭盖1/3，烘3～4h后，移入干燥器中，盖紧盒盖冷却30min。
分别取烘干后的2g饲料(大猪全价饲料)于锥形瓶(消化前干物质重)，用上述仿生消化法体外模拟消化系统进行消化，因肠道外源酶混悬液中蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶质量比为不同分为a、b、c三组。
培养结束之后，5000r/min离心20min。收集沉淀并测定其干物质含量。取沉淀置于称量铝盒中，放入烘干箱(65℃)烘干12h，用坩埚钳移到室外冷却3～4h回潮，然后置于105℃烘箱中烘4h，置于干燥器中冷却30min后称重，为消化后干物质重。然后分别计算干物质的消化率，得到三组干物质的消化率，如表1所示。
本发明干物质消化率的计算公式为：
干物质消化率＝(消化前干物质重-消化后干物质重)/消化前干物质重×100％。
表1仿生法饲料干物质消化率(％)测定结果
试验结果显示肠道外源酶混悬液中蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶质量比为3:1:1时，大猪全价料干物质消化率最高，为53.81％，即采用蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶质量比为3:1:1的肠道外源酶混悬液来建立仿生消化系统。
3、体系中霉菌毒素的测定
在干物质消化率最高的条件下，利用本发明的仿生消化法消化后，测定微生物对霉变饲料中don的降解率，测定方法，具体为：
大猪全价料为例，当肠道外源酶混悬液中蛋白酶:淀粉酶:脂肪酶＝3:1:1时，干物质消化率最高，为53.81％。大猪全价料在此仿生消化系统中被消化后，将降解don的微生物枯草芽孢杆菌ansb471，其保藏号为cgmccno.7344，在cn103243047a中公开。与相应的lb培养基组分分别加到消化后的大猪全价料中，置于37℃培养箱中避光培养48h，作为试验组；另设置，不加入枯草芽孢杆菌及其培养基，而加入pbs缓冲溶液的对照组，以采用免疫亲和柱-高效液相色谱法检测样品中don的含量。
所述的测定体系中don的方法为：按25g饲料或饲料原料计算比例，加入100ml的甲醇水溶液(v/v，6:4)，然后高速搅拌提取3min，静置，过滤。用pbs缓冲液稀释滤液，使甲醇含量低于10％，然后过滤。如样品混浊，需再过滤。将免疫亲和柱接于10ml玻璃注射器筒下。去掉亲和柱下方堵头，排空亲和柱中保护液。加入10ml滤液于免疫亲和柱中，调节滤液以1ml/min左右流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。然后加入10％的甲醇水10ml于免疫亲和柱中冲洗2次，控制流速为3ml/min左右。直至空气进入亲和柱中，弃去流出液。最后分两次各加入0.5ml甲醇，分别孵育2min，流速为1ml/min左右，收集洗脱液。40℃氮气吹干，溶于流动相，用于hplc检测don含量，其中对照组和试验组中呕吐毒素含量如表2。
don的降解率＝[(未加微生物和培养基的对照组样品中don含量－加微生物和培养基组分的试验组样品中don含量)/未加微生物和培养基的对照组样品中don含量×100％]/干物质消化率(53.81％)
表2微生物对大猪全价料中呕吐毒素的降解率
通过本发明的仿生消化法体外评价枯草芽孢杆菌ansb471对大猪全价饲料中don的降解率为80.35％。
本发明的体外仿生评价微生物降解霉菌毒素的方法操作简单、符合动物实际的消化生理状态，能真实反映微生物对饲料中don的降解效率，是一种切实可行的体外评价微生物降解饲料及原料中呕吐毒素降解效率的方法。该方法还可应用到食品、粮食、及农副产品加工领域，有效评价微生物对食品、粮油及农副产品中呕吐毒素的降解效果。