本发明涉及一种生物大分子光学检测方法，具体涉及一种与细胞内胶体渗透压相关的生物大分子光学检测方法及其相关药物筛选方法的构建和应用。
背景技术：
化学、电和力学活动是维系细胞生命活动的基本形式，尽管前两者被深入研究，但是胞内力学活动很少受到关注，是当前细胞研究领域的盲点。细胞多种生理和病理活动依赖其内部的力学活动，如细胞生长和分裂、收缩、水肿、分化、神经极化、恶性肿瘤侵袭转移等，细胞形态改变必然是其内部力学牵拉的结果。
尽管以动力分子(myosin、dynein和kinesin)为基础的微丝和微管牵拉力以及以离子通道为基础的晶体渗透压力很早被识别，并成为调控细胞内力学活动的重要驱动因素。但是力是物理矢量特征指标，不同与标量，不仅有大小，还有方向区别，细胞内力学作用是如何实现矢量(方向)改变并不清楚。
微丝和微管的解聚不仅能消除微丝和微管依赖动力分子实施的牵拉张力，因其解聚单体(β-肌球蛋白、α、β-微管蛋白)在细胞内含量极为丰富，各单体约占胞内总蛋白量的1-10％，所形成的生物大分子颗粒及其聚合体大小介于4-100nm之间，能有效的形成胶体渗透压，诱导细胞向外膨胀，逆转微丝和微管向内的牵拉张力，实现胞内力学活动的矢量转变，构成细胞内力学活动的新形式和新调控机制。
技术实现要素：
本发明的目的是解决现有技术识别活细胞和胞内胶体渗透压的不足，提供一种与细胞内胶体渗透压相关的生物大分子光学检测方法，利用蛋白质胶体的光学性质，通过检测细胞内含量丰富的蛋白质颗粒及其聚合体，即胞内胶体渗透压的主要构成来源，测定胞内胶体渗透压的变化及细胞结构张力矢量的变化。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种与细胞内胶体渗透压相关的生物大分子光学检测方法，光学或成像检测细胞内含量丰富的肌球蛋白、微管蛋白等生物大分子颗粒或颗粒聚合体的大小、形状、位置、数量或其蛋白标记物的密度和强度，以评价胞内胶体渗透压的变化及区域定位，其方法包括以下步骤：
a)破碎细胞，提取细胞质，利用具有足够分辨率的成像光进行光强度检测，确定生物大分子颗粒或颗粒聚合体的大小和数量，结合渗透压仪器检测的渗透压数值，建立胶体渗透压改变与胶体光学差分的对应关系；
b)利用具有足够深度分辨率的成像光对细胞或组织细胞进行成像和光学强度检测，确定生物大分子颗粒或颗粒聚合体的位置、数量或其蛋白标记物的密度和强度；借助已建立的渗透压与光学差分的关系，推测胶体渗透压的区域变化。
本发明依据蛋白质胶体性质——丁达尔效应，采用暗场显微技术，观察细胞或细胞质提取液，检测其散射(后向、垂直和前向)或透射光，来测定其颗粒位置、大小和数量比例。具体使用暗场显微镜如徕卡、奥林巴斯等品牌暗视野显微镜，实现蛋白质胶体颗粒的测定。
依据丁达尔效应，利用具有足够深度分辨率的光学检测器检测细胞质提取液，评价与胶体渗透压相关的蛋白质颗粒或其蛋白标记物，定量胞内蛋白质颗粒或其结合荧光物质发出的亮度或荧光量。并将其特性和数量与胶体渗透压数值相关联，作为评价胶体渗透压的函数。具体采取的方式包括使用纳米粒径测定仪Zetasizer Nano ZS90及同类型的纳米粒径测定仪，通过散射或透射光检测其吸光度或浊度、颗粒大小和数量。为增加检测灵敏度，可采用荧光标记物标记蛋白颗粒，结合荧光激发和对应荧光检测，改善对纳米颗粒测定的精确度。
采用能与生物大分子结合的荧光分子与胞内含量丰富的蛋白质颗粒结合，且具有纳米粒子特性，只在与生物大分子结合时才发出特征荧光信号。部分荧光物质能透过细胞膜，与细胞的蛋白质颗粒结合。或纳米金属颗粒可穿过微血管屏障，实现动物和组织水平特定细胞内生物大分子的标记，并结合超分辨荧光显微成像技术对荧光标记的大分子进行定位与计数。首先根据具体的研究内容选取荧光染料或纳米金属颗粒。其中所述荧光物质是选自以下的荧光分子：噁嗪染料AOI987、姜黄素衍生物质、硫磺素S、硫磺素T、刚果红、其任意组合以及其任意生理相容性衍生物；也可采用上述蛋白颗粒偶联的荧光蛋白基因，转入细胞，标记单分子蛋白颗粒；或选择纳米金属颗粒荧光物质，如聚乙二醇包壳的硅球体核。第二步，选择具有nm级分辨率的超分辨荧光显微成像技术，有：随机光学重构显微技术(STORM/dSTORM)、光激活定位显微技术(PALM)、荧光光敏定位显微镜(FPALM)、散射式近场扫描光学显微镜(s-SNOM)、受激发射损耗显微技术(STED)、干涉光激活定位显微技术(iPALM)、旋转盘共聚焦显微技术(SDCM)、超分辨光学波动成像技术(SOFI)、饱和结构照明显微技术(SSIM)、可逆饱和光跃迁技术(RESOLFT)、扫描角干涉显微技术(SAIM)等，实施光学检测。
根据特定蛋白质具有的特异吸光性测量蛋白质颗粒浓度。例如细胞中大量存在的肌动蛋白、微管蛋白。该两种蛋白中富含酪氨酸和色氨酸，而酪氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，因此通过测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值测量肌动蛋白和微管蛋白，称为紫外吸收法。
本发明的解决了现有技术识别活细胞和胞内胶体渗透压的不足，提供一种光学检测和光学成像方法。作为本发明所述与细胞内胶体渗透压相关的生物大分子光学检测方法，分析胞内胶体渗透压的改变，并结合渗透压仪，解析晶体渗透压和胶体渗透压在胞内渗透压的组成和功能。
本发明的另一目的是可据本发明光学检测的研究，构建相关药物筛选细胞平台，筛选与胶体渗透压调节相关的药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明所述与细胞内胶体渗透压相关的生物大分子光学检测方法，能分析胞内胶体渗透压的改变，并结合渗透压仪，解析晶体渗透压和胶体渗透压在胞内渗透压的组成和功能，其具有重要的研究意义。可据此构建其相关药物筛选细胞平台，筛选与胶体渗透压调节相关的药物。
附图说明
图1：采用纳米粒径测定仪ZetasizerNanoZS90斜射或散射光检测其吸光度、颗粒粒径和数量。
图2：肌球蛋白或微管蛋白颗粒或其聚合体的渗透压与Count rate(kcps)的对应曲线。
图3：Image J软件处理的细胞结构修正图。
图4：通过使用紫外吸收法对肌动蛋白或微管蛋白浓度进行测定的标准曲线。
具体实施方式
本发明的各种实施方案和方面会在下文中详细阐述。
下文的描述和图示解释了本发明但并不解释为对本发明的限制。所描述的大量特定详细资料为本发明的各种实施方案提供了全面理解。然而，某些情况下，为了对本发明的实施方案提供简明地论述，并未描述一些众所周知或常规的详细资料。
本文使用的术语“包括/包含”被解释为包括在内且是开放式的，并不排外。特别是用在本说明书包括权利要求书中，“包括/包含”及其变体表示特定特征、步骤或成分被包括在其中。这些术语不能解释为排除其他特征、步骤或成分的存在。
本文使用的术语“示例的”意为“可作为例子、实例或例证”，不应当解释为比本文公开的其他配置优选或有利。
本文使用的术语“约/大约”和“大概”，当与粒子尺寸范围、混合物成分或其他物理性质和特征连用时，意为涵盖尺寸范围内上下限中可能存在的微小变化，以不排除平均大部分尺寸满足但在统计学上可存在该范围之外的尺寸的实施方案。本申请不打算排除诸如这些的实施方案。
肌球蛋白、微管蛋白等蛋白颗粒能从细胞骨架结构解聚生成、也能自身合成增加，其聚合和区域变化成为细胞向外张力调控的重要机制，构成了细胞向外的伸展力，驱动细胞形态向外的力学活动。
使用丁达尔现象能对胞内蛋白质颗粒数量及其大小进行定量。使用暗场成像技术来确定蛋白质颗粒在细胞内的亚细胞定位变化。同时，采用偶联荧光蛋白研究了细胞极化前沿，如神经元的生长锥，生物大分子颗粒的分布及其胶体渗透压的变化。另外，利用高分辨率成像技术对位于神经细胞生物大分子分布进行了研究。此形态与暗场显微观察对胞内蛋白质颗粒进行细胞定位基本一致。因此，高分辨率成像技术的发展和应用有利于胞内生物大分子的观察与检测。
分析细胞内蛋白质颗粒标记物。备选标记物包括荧光物质、光谱信号、差分偏振信号、光程差或者散射光差异。这些信号可能来自胞内蛋白质颗粒。接着可以利用更高放大率放大预期区域中显示出现标记物的区域，然后在之前鉴别的区域内评估标记物的形状和尺寸特征以及强度和空间分布信号。
第一种可能的标记物包括对机体细胞无毒的荧光分子，其包括但不限于，智能光学探针(只有在与蛋白质颗粒结合时才发射特征荧光信号)和其他荧光染料，如近红外荧光噁嗪染料μOI987、姜黄素衍生物CRANAD-2、硫磺素T、硫磺素S或其衍生物、罗丹明、或者刚果红。如果使用荧光，那么组织和细胞成像的方法包括会以单或双光子激发来激发所选择分子的波长，分离入射光和荧光的过滤系统，以及对荧光敏感的检测器。选择检测器滤光器和检测器来突出与蛋白分子结合的标记物的荧光波长，以使背景组织荧光不明显。
一些可使用的荧光标记物是能够穿越血脑屏障的标记物。这允许在动物水平检测过程中可实施静脉注射。
也可选择通过脂质体胶囊递送的荧光染料。这种染料在类似脑神经细胞内释放后可在中枢神经细胞定位。在荧光的单或双光子激发的情况下，激发光束可穿入多层细胞，激发荧光染料并返回荧光。上述荧光还可用于确定蛋白质颗粒的结构和形状。同样，蛋白质颗粒可用荧光染料标记。
蛋白质颗粒的第二种可能的标记物是光谱。这包括但不限于拉曼光谱、吸收光谱、荧光相关光谱、NMR光谱、准弹性光散射光谱、圆二色谱以及傅里叶变换光谱，光谱信号可由富含的蛋白质颗粒单独产生或由与染料结合的蛋白质颗粒产生。
作为第三种可能的标记物，胞内蛋白质颗粒通过偏振光(即光学活性)的差分吸收、透射、散射或反射，或者通过偏振光谱、或者通过来自胞内蛋白质颗粒的偏振光的差分反射来显现。此外，可使用光学活性的染料。通过已知增强具有差异偏振特性结构的比对的偏振成像方法(例如利用穆勒矩阵旋光法改良的共焦激光扫描显微镜)或检测结构，其原因是它们对光的偏振特性具有不同的作用。
第四种可能的标记物是包括以下的蛋白质颗粒具有散射特征和差异内源性特性的光。可利用暗场成像或利用超分辨显微镜显现。
除了使用上述标记物以外，还可使用其他光学技术来评估细胞内蛋白质颗粒的密度。可使用通过散射光测量大约4nm至几百nm大小的粒子的其他方法，因为每个胞内蛋白质颗粒会形成差分散射光。这些方法包括前述蛋白质颗粒的光散射特征或差异内源性光学性质，以便确定蛋白质颗粒。
根据上述本发明人所采用的对蛋白质进行标记后测量或直接评估的原理，本发明人采用以下技术或仪器对蛋白质颗粒进行成像、定位与计量：暗视野显微镜、超分辨荧光显微成像技术、以动态光散射为主要原理的纳米粒径测定仪、微量比浊仪、根据特定蛋白质的特异吸光性测量蛋白质颗粒浓度法。
第一种仪器是以动态光散射为主要原理的纳米粒径测定仪，如Zetasizer Nano ZS90及其同类型的纳米粒径测定仪产品。
溶液中蛋白质微粒因布朗运动，能使散射光强随时间起伏涨落而形成的动态。当一束干涉光通过细胞质，遇到溶液中的肌动蛋白和微管蛋白颗粒会向各个方向散射。若颗粒做无规则的布朗运动，散射光强会随时间在平均光强附近随机涨落，散射光频率也会发生微小变化，根据这种在一定角度下光强的涨落情况，可以得到光强自相关函数随时间的变化，进而推算出肌动蛋白和微管蛋白颗粒大小及分布。
为了实现检测胞内胶体渗透压数值变化的目的，本发明提供了一种通过使用纳米粒径测定仪，绘制肌球蛋白或微管蛋白颗粒或其聚合体的颗粒比值与胶体渗透压的对应曲线的方法，以此推测胞内胶体渗透压的变化并用于与胶体渗透压相关疾病的诊断和治疗药物的筛选。
其中，所述检测方法包括：
1、采用微丝或微管解聚剂不同剂量(1，1/2，1/4，1/8，1/16，0倍)刺激细胞15min，诱导胞内肌球蛋白或微管蛋白颗粒及其颗粒聚合体不同程度的形成。其中，微丝解聚剂为Cytochalasin D(Cyto D)，初始浓度为5μM；微管解聚剂为Nocodazole(Noc)，初始浓度为2μM。
2、将细胞培养瓶里的培养液倒掉，用适量4℃的PBS清洗两遍。
3、离心(12000rpm，30min，4℃)，沉淀细胞，弃上清培养基，保留细胞沉淀。
4、采用超速破碎15-30秒。
5、40000rpm离心15min，吸取上清，即细胞质(20-40μl)。
6、采用渗透压仪(如美国Advanced冰点渗透压仪)测定细胞质渗透压值。
7、采用纳米粒径测定仪ZetasizerNanoZS90斜射或散射光检测其吸光度、颗粒粒径和数量(如图1所示)。
为了使得检测待测溶液时得到的数据更为准确，在制备用于ZetasizerNanoZS90检测的样品时，可以对待测溶液的浓度作进一步限定，最小浓度为0.5g/l，最大浓度应以不使蛋白颗粒相互聚集、胶凝为准。
8、绘制肌球蛋白或微管蛋白颗粒或其聚合体的渗透压与Count rate(kcps)的对应曲线，解析细胞质晶体(或离子)渗透压的组成。采用药物(微丝或微管解聚剂)刺激神经胶质细胞15min。重复上述步骤(除第一步以外)。以胞质渗透压为Y轴，解聚生成的肌动蛋白或微管蛋白数量为X轴，通过SPSS17.0软件处理，得到线性Y＝0.3149X+152.92。当X＝0时，Y＝152.9，表示细胞质内离子渗透压为152.9Osm/Kg。因而正常情况下的胞质胶体渗透压是147.1Osm/Kg左右。(见图2)
9、可以直接得到胶体渗透压与Count rate的数值对应关系。
第二种是微量比浊仪。比浊仪可以采用包括光电比浊法、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、共振光散射比浊法在内的多种方法。使用激发光照射通过细胞质提取液，肌动蛋白或微管蛋白或其他抗原抗体复合物的散射及吸收作用使光线的透过量降低。使用比浊仪精确测出光密度或透光度。在一定的范围内，蛋白质或抗原抗体复合物颗粒浓度与透光度成反比，与光密度(或散射光)成正比。用一系列已知颗粒数量的悬液测定光密度，作出光密度－蛋白质颗粒数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出肌动蛋白或微管蛋白数量。
为了实现检测胞内胶体渗透压数值变化的目的，本发明提供了一种通过使用免疫散射比浊法，绘制肌球蛋白或微管蛋白颗粒或其聚合体的颗粒比值与胶体渗透压的对应曲线的方法，以此推测胞内胶体渗透压的变化并用于与胶体渗透压相关疾病的诊断和治疗药物的筛选。
散射比浊法采用IMMAGE全自动比浊仪(BECKMAN COULTER.Inc.)与配套试剂及校准品。质控品为自制的细胞质提取液。
其中，所述检测方法包括：
1、测定仪器批内精密度与批间精密度。变异系数CV≤5％时可以使用。
2、选择已知肌动蛋白或微管蛋白或其聚合物浓度的标准液，按梯度稀释成5.1％、7.5％、10.5％、13.5％、15.0％的标本溶液
3、将6份样品使用散射比浊法反复测定，测定结果通过SPSS17.0软件处理，得到线性标准曲线。其中Y为散射比浊仪测定值，X为蛋白颗粒浓度。
4、可以通过使用散射比浊法测定待测样品，利用标准曲线计算蛋白质溶液浓度，以此推测胞内胶体渗透压的变化。
第三种检测仪器为暗视野显微镜，亦称暗场显微镜，是根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜，可以观察到明场看不到的极其微小的物体，可以分辨直径在4-200nm范围的微粒的存在和运动，故暗场显微镜可以用来测定包括肌动蛋白、微管蛋白在内的胞内蛋白质及聚合物。暗场显微镜使用中央遮光板或暗视野聚光器(常用的是抛物面聚光器)，使光源的中央光束被阻挡，不能由下而上地通过标本进入物镜，从而使光线改变途径，倾斜地照射在要观察的细胞上，细胞遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。在暗视野中所观察到的，是胞内蛋白质颗粒的衍射光图像(并非蛋白质颗粒本身)，可以观测到蛋白质颗粒的存在和运动，从而可以对胞内肌动蛋白、微管蛋白在内的胞内蛋白质及聚合物进行相对定量与定位。
为了实现检测胞内胶体渗透压数值变化的目的，本发明提供了一种使用暗场显微镜搭配全内反射照明，对活细胞内肌球蛋白或微管蛋白颗粒或其聚合体进行动态成像和相对定量的方法，以此推测胞内胶体渗透压的变化并用于与胶体渗透压相关疾病的诊断和治疗药物的筛选。
其中，使用暗场显微镜搭配全内反射照明对活细胞内肌球蛋白或微管蛋白颗粒或其聚合体进行动态成像和相对定量的方法包括：
1、将所有细胞在37℃含5％二氧化碳的条件下培养。
2、在细胞生长和实验过程中，将细胞悬浮在添加了10％的胎牛血清的细胞培养基中(Dulbecco的修饰型培养基(DMEM))。
3、选用ibidi GmbH,Martinsried,Germany型号的玻底培养皿，ibidiμ-Dish 1.5h(170μm+/-5μm)型号的盖玻片。将玻底培养皿和盖玻片彻底清洗干净。在每个实验之前,将细胞脱离于细胞培养瓶，转移到玻底培养皿上，用盖玻片覆盖。
4、采用一种偏转于两轴倾斜扫描镜的平行的、线性极化的488nm激光束。488mm的激光对样品激发以寻找合适的区域进行成像。
5、在光束通道开始处放置声光可调滤波器，保证激光功率在P＝5.0mW恒定。一个20x光束扩展器将光束直径扩大到14毫米，然后直达扫描镜。
6、在聚丙烯中放置特定隔膜，以构成暗视野检测，阻挡所有的全内反射光。只有散射光通过光阑和透镜L4，并在sCMOS相机上形成图像。
7、以100Hz的帧率进行图像采集
8、为了消除被叠加到每一个原始图像上由显微镜光学元件的界面反射引起的恒定的背景干扰，必须将一个单独的背景图像从所有原始图像中减去，得到一个清晰、反射修正的细胞结构清晰的最终图像。
9、图像数据处理均在Image J软件完成(见图3)。
根据成像原理，图像中局部区域的亮度与蛋白质颗粒浓度成正比，与透光度成反比。亮度高(透光度低)区域的蛋白质颗粒浓度高于亮度低(透光度高)区域的蛋白质颗粒浓度。通过相对定量的方式，可以检测细胞内肌球蛋白、微管蛋白等生物大分子颗粒或颗粒聚合体的位置、数量或其蛋白标记物的密度和强度，以评价胞内胶体渗透压的变化及区域定位。
第四种检测技术为超分辨荧光显微成像技术，包括随机光学重构显微技术(STORM/dSTORM)、光激活定位显微技术(PALM)、荧光光敏定位显微镜(FPALM)、散射式近场扫描光学显微镜(s-SNOM)、受激发射损耗显微技术(STED)、干涉光激活定位显微技术(iPALM)等。接下来进行列举详述：
1)光激活定位显微技术(Photoactivated Localization Microscope，PALM)。使用荧光蛋白来标记肌球蛋白或微管蛋白，通过调节激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后再次调节激光照射激发荧光，通过高斯拟合来精确定位肌球蛋白或微管蛋白的位置。随后再使用激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不被下一轮的激光再激活出来。之后，再次循环使用激光来激活和漂白其它的荧光分子。经过持续多次循环后，细胞内大多数荧光分子被精确定位。将这些分子的图像合成到一张图上，不断重复激发和探测，最终可以精确地定位出足够多的荧光分子，利用这些多幅子图像重建出肌球蛋白或微管蛋白超分辨的图像，从而实现蛋白质的定量。此外，将PALM技术与光的干涉原理结合起来，即称为干涉测量光激活定位显微技术(interferometric Photoactivated Localization Microscopy,iPALM)。iPALM可以用来观察纳米级蛋白质显微结构，同样可以按照上述步骤实现肌动蛋白和微管蛋白的测定。
2)随机光学重构显微技术(Stochastic Optical Reconstruction Microscope，STORM)。使用光转换荧光染料作为荧光探针。采用Alexa Fluor647、Alexa Fluor532和ATTO532等花青染料标记肌球蛋白或微管蛋白，这种荧光染料具有在含有巯基物质的溶液中能实现明暗转换，可直接实现光转换。通过控制不同波长激发光的照射可以实现荧光分子在亮态和暗态之间相互转换，实现相邻荧光分子的彼此分离从而达到单分子成像的目的，从而实现标记蛋白颗粒的纳米级成像。STORM技术通过重复激活、定位和淬灭荧光分子，如此循环几百次至上千次后即可重构出一幅细胞内标记蛋白的超高分辨图像，从而实现胞内蛋白颗粒的测定和计量。
3)荧光光敏定位显微镜(Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy,FPALM)。使用可光活化的绿色荧光蛋白(PA-GFP)荧光蛋白来标记肌球蛋白或微管蛋白，每次采集分析数千个的单个荧光分子，以低激发强度一次定位其中的少部分荧光分子。对于这些可光活化的分子，活化速率由活化照度控制；非荧光非活性分子被高频(405-nm)激光激活，然后在较低频率激发时发出荧光。数字图像传感器(CCD)照相机对荧光进行成像，然后将这些分子或者可逆地失活或者不可逆地光漂白以将其从视野中除去。光漂白的速度由用于激发荧光的激光的强度来控制，通常使用Ar+离子激光。因为在给定的时间只有少量的荧光分子是可见的，所以它们的位置可以精确地确定，定位精度比分辨率高10倍，达到优于10nm的空间分辨率。因此，确定肌球蛋白或微管蛋白等胞内蛋白质的数量和分布。
4)受激发射损耗显微技术(STED)。使用荧光蛋白标记肌球蛋白或微管蛋白。荧光分子中的电子处在基态，受到激发光照射，吸收光子并且跳转到不稳定的激发态。电子在激发态会跃迁到基态，同时发出自发荧光。当激发态的电子遇到波长相当于激发态与基态之间的能量差的光子时，产生受激辐射。样本激发光与损耗光相结合，并通过物镜聚焦到待测蛋白质样品上。然后，采用损耗光和激发光组合的光激发样品，两束激光共同作用在荧光分子上，荧光分子可自发辐射荧光，而那些被损耗光照射的部位发生受激损耗效应不会产生荧光，从而实现肌球蛋白或微管蛋白等胞内标记蛋白的定位和计量。
5)散射式近场扫描光学显微镜(scattering-type Scanning Near-field Optical Microscopy,s-SNOM)。近场是指用做物理观察物的探头的尺度及探头与被观察物的距离均小于用于观测的辐射波长。待测胞质提取液样品由远场激发或隐失波激发，SNOM针尖作为检测探针收集光信号。探针在胞质提取液表面上逐点扫描，采集胞内蛋白质颗粒表面附近近场范围内的各种散射光场信息的变化，逐点记录后成像，得到胞质内肌动蛋白和微管蛋白等蛋白颗粒的形貌和光学信息，组合成光学图像。
为了实现检测胞内胶体渗透压数值变化的目的，本发明提供了一种通过使用STORM技术对肌动蛋白或微管蛋白进行成像的方法，以此推测胞内胶体渗透压的变化并用于与胶体渗透压相关疾病的诊断和治疗药物的筛选。
其中，使用STORM平台对细胞内肌动蛋白或微管蛋白进行光学检测的方法包括：
1、采用微丝或微管解聚剂刺激细胞15min，诱导胞内肌球蛋白或微管蛋白颗粒及其颗粒聚合体不同程度的形成。其中，微丝解聚剂为Cytochalasin D(Cyto D)，浓度为5μM；微管解聚剂为Nocodazole(Noc)，浓度为2μM。
2、选用#1.5型号、规格为22mm*22mm的载玻片。将载玻片和盖玻片彻底清洗干净。
3、将细胞接种在处理好的孔板或培养皿中培养，细胞密度不宜过高。
4、采用含3％多聚甲醛和0.1％戊二醛的细胞骨架缓冲液(Cytoskeletal Buffer,CB,配方见下表)固定细胞的肌动蛋白微丝；采用含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液固定微管蛋白。
5、使用多聚甲醛固定的样品，使用含有50mM的甘氨酸溶液冲洗样品以淬灭其产生的自发荧光；使用多聚甲醛固定的样品，使用新鲜配置的含0.1％硼氢化钠的缓冲液冲洗以消除自发荧光。
6、使用TritonX-100或NP-40等非离子清洗剂进行透膜，使用浓度范围为0.05％到0.5％(v/v)。
7、对肌动蛋白或微管蛋白进行荧光标记。
肌动蛋白染色步骤(以直径33mm的皿为例)：
(1)取出细胞样品，吸去培养液。用1mL37C预热的CB缓冲液冲洗细胞2次，每次2分钟。
(2)固定：取1mL含3％多聚甲醛和0.1％戊二醛的固定液固定细胞10分钟，固定后用2mLPBS冲洗3次，每次5分钟。
(3)透膜：加入1mL新鲜配置的0.25％Triton X-100室温透膜10分钟，增加细胞的通透性。PBS冲洗2次，每次5分钟。
(4)为了减少自发荧光，加入lmL新鲜配制的0.1％硼氢化钠溶液，室温作用7分钟。PBS冲洗，每次10分钟。
(5)封闭：加入1mL新鲜配置3％牛血清白蛋白(BSA)溶液37C封闭细胞1小时，防止抗体非特异性吸附，之后用PBS冲洗3次。
(6)染色：将Alexa Fluor647标记的鬼笔环肽荧光抗体用含1％BSA的PBS溶液稀释
(7)后固定：加入1mL4％的多聚甲醛溶液重复固定10分钟，PBS冲洗；用50mM甘氨酸溶液冲洗细胞2次，每次5分钟。
微管蛋白染色步骤：
(1)取出细胞样品，吸去培养液，用37C预热的PBS溶液冲洗细胞；
(2)取1mL4％多聚甲醛的磷酸缓冲液固定细胞10分钟，PBS冲洗；
(3)透膜和封闭可参照肌动蛋白的实验步骤；
(4)一抗孵育：将2ugAnti-a-tublin抗体稀释在1mLPBS溶液中，加入细胞样品，室温作用1小时，2mLPBS冲洗3次，每次5分钟。
(5)二抗孵育：将2ug Alexa Fluor 647-labeled Goat Anti-Mouse抗体稀释在1mL含1％BSA的PBS溶液中，37℃孵育2小时，PBS冲洗3次，每次5分钟。
(6)后固定步骤同上。
8、在样品中加入荧光微球基准粒子，将其固定在玻片上，通过计算基准粒子与目标荧光点的相对位置来校准图像。原液均用PBS溶液稀释1000倍，4C保存。使用时，可用超声振荡10分钟，以保证荧光微球分布均匀。
9、当样品加入基准粒子后，将成像缓冲液加入样品中浸泡1分钟，之后即可放入显微成像系统进行超分辨成像。
10、采用640mm的激光对样品激发以寻找合适的区域进行成像。
11、找到合适的成像区域(必须保证区域内含有基准粒子)后，逐渐增大激发光的强度直至样品大部分转换为暗态。
12、加入低强度的激活光(532nm)使得部分荧光分子由暗态恢复至亮态，激活光的强度一般设置在1.5％-3％之间。当图像中单分子荧光点分布均匀时即可用EMCCD进行图像的采集，一个区域采集约3万帧图像。
13、图像数据处理均在Matlab软件完成。
14、估算胞质内蛋白质数量，计算胞质胶体渗透压。
第五种技术是根据特定蛋白质具有的特异吸光性测量蛋白质颗粒浓度。例如细胞中大量存在的肌动蛋白、微管蛋白。该两种蛋白中富含酪氨酸和色氨酸，而酪氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，因此测定细胞质在280nm处的吸光度值是测量肌动蛋白和微管蛋白的紫外吸收法。测定时，将待测细胞质滴加在微量光学检测仪上，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值，计算出以酪氨酸和色氨酸特异吸光度为基础的蛋白质颗粒的大致浓度。
为了实现检测胞内胶体渗透压数值变化的目的，本发明提供了一种通过使用紫外吸收法对肌动蛋白或微管蛋白浓度进行测定的方法，以此推测胞内胶体渗透压的变化并用于与胶体渗透压相关疾病的诊断和治疗药物的筛选。
其中，所述检测方法包括标准曲线的绘制和依据紫外吸光度计算相应蛋白质浓度：
1、用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL 3.00mg/mL标准蛋白质溶液于5只10mL比色管中，用0.9％NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。此系列含蛋白质分别为：0.3、0.45、0.6、0.75、0.9mg/mL。
2、用1cm石英比色皿，以0.9％NaCl溶液为参比，在278nm处分别测定各标准溶液的吸光度A278,记录数据。
3、以标准蛋白质溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。(见图4)
4、通过SPSS17.0软件处理，得到线性Y＝4.3298X+51.795。
5、取适量浓度的待测蛋白质溶液50μL，按上述方法测定278nm处的吸光度，平行测定三次。
6、依据标准曲线，测得待测样品的蛋白质含量。
以下列举几个具体实施例：
实施例1
基于动态光散射原理的纳米粒径测定仪Zetasizer Nano ZS90测定肌球蛋白或微管蛋白颗粒及其颗粒聚合体
应说明的是，本发明人意图通过这个实施例说明纳米粒径测定仪观察肌球蛋白或微管蛋白颗粒及其颗粒聚合体的操作方法及原理，并不局限于Zetasizer Nano ZS90仪器，亦不局限于肌动蛋白或微管蛋白及其颗粒聚合体，而是适用于全部基于动态光散射原理的纳米粒径测定仪和全部蛋白质及其他大分子，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
标准曲线的绘制(图2)
1、采用微丝或微管解聚剂不同剂量(1，1/2，1/4，1/8，1/16，0倍)刺激细胞15min，诱导胞内肌球蛋白或微管蛋白颗粒及其颗粒聚合体不同程度的形成
2、4℃条件下，离心沉淀细胞，弃上清培养基，保留细胞沉淀，采用超速破碎15-30秒。
3、40000g离心15min，吸取上清，即细胞质(20-40μl)。
4、采用渗透压仪测定细胞质渗透压值
5、采用纳米粒径测定仪ZetasizerNanoZS90斜射或散射光检测其吸光度、颗粒大小和数量。
6、绘制肌球蛋白或微管蛋白颗粒或其聚合体的渗透压与Count rate(kcps)的对应曲线。解析细胞质晶体(或离子)渗透压的组成，及胶体渗透压与Count rate的数值对应关系。
当X＝0时，Y＝152.9，表示细胞质内离子渗透压为152.9Osm/Kg；因为正常细胞内，渗透压值是300Osm/Kg，因而其胶体渗透压是147.1Osm/Kg左右。
测定
1、采用药物(谷氨酸)刺激神经胶质细胞15min。
2、重复上述步骤2、3、5和6
7、依据上述公式，计算细胞质晶体和离子渗透压的组成和数值
注：四组数据分别是正常细胞、微丝解聚细胞、微管解聚细胞、微丝和微管解聚细胞的渗透压值及其对应的蛋白颗粒比值。
实施例2
全内反射暗场显微镜观察肌球蛋白或微管蛋白颗粒及其颗粒聚合体在细胞内的数量和分布
应说明的是，本发明人意图通过这个实施例说明暗场显微镜观察肌球蛋白或微管蛋白颗粒及其颗粒聚合体的操作方法及原理，并不局限于肌动蛋白或微管蛋白及其颗粒聚合体，而是适用于全部蛋白质及其他大分子，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
1.将培养皿/盖玻片内的细胞或提取的细胞质置于高分辨率的暗场聚光器下。
2.可以选择对目标蛋白进行染色，例如使用共轭罗丹明-鬼笔环肽着色肌动蛋白约1h，使肌动蛋白颗粒便于观察。
3.将聚光镜光圈调至1.4。
4.光源的光圈孔调至最大。
5.在聚光器上放一大滴香柏油，将标本置载物台上，旋上聚光器使油与载玻片接触(不能有气泡发生)。
6.用低倍物镜及7×目镜进行配光对准物体。调节聚光器的高度，首先在载玻片上出现一个中间有一黑点的光圈，最后为一光亮的光点，光点愈小愈好，由此点将聚光器上下移动时均使光点增大。
7.换上所需目镜和高倍镜，缓慢上升物镜进行调焦，至视野中心出现发光的样品。
8.在盖玻片上滴一滴香柏油，并将油镜转至应在位置调节配光，进行观察。
9.使用CCD相机进行图像的记录。
10.每完成一次实验，聚光器用蒸馏水和70％乙醇冲洗3次，然后用紫外线灭菌30分钟。
实施例3
基于特定蛋白质的特异吸光性，对肌动蛋白或微管蛋白颗粒浓度进行测定。
应说明的是，本发明人意图通过这个实施例说明特定蛋白质的特异吸光性在目标蛋白颗粒含量测定中的操作方法及原理，并不局限于肌动蛋白或微管蛋白，而是适用于全部蛋白质及其他大分子，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
标准曲线的绘制(图4)
1、采用微丝或微管解聚剂不同剂量(1，1/2，1/4，1/8，1/16，0倍)刺激细胞15min，诱导胞内肌球蛋白或微管蛋白颗粒及其颗粒聚合体不同程度的形成
2、4℃条件下，离心沉淀细胞，弃上清培养基，保留细胞沉淀，采用超速破碎15-30秒。
3、40000g离心15min，吸取上清，即细胞质。
4、采用渗透压仪测定细胞质渗透压值
5、采用280nm紫外光检测其吸光度或蛋白含量。因为β-肌球蛋白或α-微管蛋白β-微管蛋白富色氨酸，其高含量有更显著的吸光值。
6、绘制肌球蛋白或微管蛋白颗粒或其聚合体的渗透压与蛋白含量(mg/ml)的对应曲线。解析细胞质晶体和离子渗透压的组成，及胶体渗透压与蛋白含量的数值对应关系。
测定
1、采用药物(谷氨酸)刺激神经胶质细胞15min。
2、重复上述步骤2、3、5和6
7、依据上述公式，计算细胞质晶体和离子渗透压的组成和数值。
注：四组数据分别是正常细胞、微丝解聚细胞、微管解聚细胞、微丝和微管解聚细胞的渗透压值及其对应的蛋白含量比值。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。