本发明涉及非对映异构体的绝对构型鉴定技术领域，更具体地，涉及一种叶菌唑非对映异构体的绝对构型鉴定方法。
背景技术：
手性现象在自然界中普遍存在，构成生物大分子的结构单元具有特定的手性特征。人体中的许多药物靶标(如各种受体、酶、蛋白质等)都是由L-氨基酸构成，当手性药物与药物靶标相互作用时会产生立体选择性，不同的对映异构体在生物体内可能产生截然不同的药理活性、生理活性、毒性和代谢等。二十世纪六十年代发生的外消旋沙利度胺致胎儿畸形事件震惊世界。因此，手性分子的绝对构型鉴定对于手性药物的开发至关重要。
目前，研究者主要采用有机合成技术、Mosher 法、X-射线晶体结构分析和手性光谱学等开展手性分子的绝对构型确定研究。对一些反应步骤较长的目标产物而言，有机合成技术繁琐；在Mosher 法，底物分子先与手性试剂反应，再通过核磁共振谱中化学位移差异确定其绝对构型，该法要求底物分子中必须含有可衍生化的官能团，且手性试剂非常昂贵[Seco J. M., Quiñoá E., Riguera R., Chemical Review, 2004, 104(1), 17-118]。对晶体结构分析技术而言，手性分子中需含有原子序数大于16的“重原子”，同时许多手性化合物，特别是天然产物的单晶难以获得 [Bijvoet J.M., Peerdeman A.F., van Bommel A.J., Nature, 1951, 168(4268), 271-272]。
手性光谱方法的研究对象较为广泛、测试方法多样且简便易行，结合量子化学计算的理论光谱可有效地确定手性化合物的绝对构型、生物大分子(如蛋白、核酸、糖类或病毒等)和有机化合物的优势构象，探究超分子体系中主客体相互作用的模式(或构象)。常用方法有电子圆二色(Electronic Circular Dichroism, ECD)谱和振动圆二色(Vibrational CD, VCD)谱。近年来，VCD光谱技术和理论得到迅速发展(Nafie L.A., Guo C.N., Dukor R.K., US 7,378,283，美国授权发明专利)。研究者采用VCD光谱方法确定抗疟疾药物赤甲氟喹[Kohout M., Vandenbussche J., Roller A., Tuma J., Bogaerts J., Bultinck P., Herrebout W., Lindner W., RSC Advances, 2016, 6, 81461-81465]、药物中间体羟吲哚衍生物[Bautista-Hernández C.I., Cordero-Rivera R. E., Zúñiga-Estrada E. A., Trejo-Carbajal N., Meléndez-Rodríguez M., Suárez-Castillo O. R., Sánchez-Zavala M., Morales-Ríos M. S., Joseph-Nathan P., Tetrahedron: Asymmetry, 2016, 27(14-15), 623-638]、麻疯树酚酮[Burgueño-Tapia E., Chávez-Castellanos K., Cedillo-Portugal E., Joseph-Nathan P., Tetrahedron: Asymmetry, 2017, 28(1), 166-174]、异龙脑[Gao R.Q., Fan J., Tan Q., Guo D., Chen T., He R.J., Li D., Zhang H., Zhang W.G., Chirality, 2017, 29(9), 550-557]、人工核苷类呋喃糖[Taniguchi T., Nakano K., Baba R., Monde K., Organic Letters, 2017, 19(2), 404-407] 等的绝对构型。2016年，美国首次将VCD光谱确定手性药物绝对构型的方法写入美国药典 (United States Pharmacopoeia, USP39，2016，Vibrational Circular Dichroism Spectroscopy—Theory and Practice，1782；Vibrational Circular Dichroism Spectroscopy，782)。美国FDA、Merck公司和Pfizer公司等都将VCD光谱作为判断手性药物绝对构型的标准方法之一。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种叶菌唑非对映异构体的绝对构型鉴定方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种叶菌唑非对映异构体的绝对构型鉴定方法，包括以下步骤：
S1. 在惰性基质中，将待测的叶菌唑非对映异构体进行固体压片制膜，在振动圆二色光谱仪上，仪器分辨率4 cm-1和调制器优化波数1400 cm-1条件下进行VCD光谱测试，得到叶菌唑非对映异构体的VCD实验谱；
S2. 采用密度泛函理论(DFT)，泛函函数B3LYP和方法为6-31+G (d)、6-31+G (2d)、6-31+G (d, p)、6-311G (d, p)或6-311+G (2d, p) 中的一种，分别以4种叶菌唑异构体为分子模型，计算得到VCD理论谱；
S3. 比较分析叶菌唑非对映异构体的VCD实验谱和理论谱中主VCD带信息的吻合度，并依据相互吻合度最高的确认对应的叶菌唑非对映异构体样品的绝对构型。
所述四种叶菌唑非对映异构体分别为：
优选地，步骤S1中所述的惰性基质采用溴化钾或氯化钾。
优选地，步骤S1中所述的惰性基质采用溴化钾。
优选地，步骤S1中叶菌唑异构体与溴化钾基质的质量比为1：10～1：50。
优选地，步骤S1中叶菌唑异构体与溴化钾基质的质量比为1：29。
优选地，步骤S2中所述方法为6-31+G (2d)。
优选地，步骤S2使用量子化学计算软件GaussView 5.0和Gaussian 09W计算得到VCD理论谱。
优选地，步骤S3中，主VCD带信息的吻合度的判断包括主VCD带的信号、频率和相对强度。
优选地，待测样品是通过超临界流体色谱和HPLC两步分离法得到的。
最优选地，一种叶菌唑非对映异构体的绝对构型鉴定方法，包括以下步骤：
S1. 在溴化钾中，将待测的叶菌唑非对映异构体进行固体压片制膜叶菌唑异构体与溴化钾基质的质量比为1：29，在振动圆二色光谱仪上、仪器分辨率4 cm-1和调制器优化波数1400 cm-1条件下进行VCD光谱测试，得到四种叶菌唑非对映异构体的VCD实验谱；
S2. 使用量子化学计算软件GaussView 5.0和Gaussian 09W，采用密度泛函理论(DFT)，泛函函数B3LYP和方法为6-31+G (2d)，分别以4种叶菌唑非对映异构体为分子模型，计算得到其VCD理论谱；
S3. 比较分析叶菌唑非对映异构体的VCD实验谱和理论谱中主VCD带的信号、频率和相对强度等信息的吻合度，并依据相互吻合度最高确认四种叶菌唑非对映异构体的绝对构型。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次采用VCD光谱手段鉴定叶菌唑四个非对映异构体的绝对构型，该方法包含了丰富的分子结构信息，是一种高效鉴定手性化合物绝对构型的有利手段。
附图说明
图1为本发明中叶菌唑在超临界流体色谱仪和HPLC分离的色谱图。
图2为本发明中叶菌唑P1、P2、P3和P4非对映异构体的VCD实验谱。
图3为叶菌唑异构体P1的VCD、IR理论谱与实验谱的对比图。
图4为叶菌唑异构体P2的VCD、IR理论谱与实验谱的对比图。
图5为叶菌唑异构体P3的VCD、IR理论谱与实验谱的对比图。
图6为叶菌唑异构体P4的VCD、IR理论谱与实验谱的对比图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例叶菌唑四种异构体绝对构型鉴定
1、四种叶菌唑异构体的获得
首先，在Enantiopak® OD柱 (250 mm × 20mm, 5μm)、超临界CO2：乙醇=70：30 (v/v)为流动相、流速40 mL/min和检测波长220 nm的条件下，采用超临界流体色谱法对四种叶菌唑异构体进行分离，得到三种组分，分别对应为P1-P2、P3和P4 (图1A)。然后，在Enantiopak® OD (250 mm × 20 mm, 5 μm)柱上、乙腈-水 (50：50，v/v)为流动相、流速为20 mL/min和波长220 nm的条件下，采用高效液相色谱对P1和P2的混合物进行再次分离，最终得到四种光学纯的叶菌唑异构体，分别标记为P1、P2、P3和P4 (图1B)。
2、叶菌唑P1和P2组分绝对构型的鉴定
（1）步骤：
称取叶菌唑P1组分和P2组分(各2 mg)分别与溴化钾(58 mg)混合，充分研磨均匀(必要时可采用球磨机)后压制成固体片模，在分辨率为4 cm-1和调制器优化波数为1400 cm-1条件下进行固体VCD光谱测试，得到P1和P2组分的VCD实验谱图（图2）。先通过GaussView 5.0软件构建(1R, 5S)-和(1S, 5R)-叶菌唑的模型结构，然后在Gaussian 09软件中，使用DFT方法，泛函函数B3LYP结合6-31+G(2d)水平，真空条件下计算得到(1R, 5S)-和(1S, 5R)-叶菌唑的VCD理论光谱（图3和图4）。比较P1和P2组分的VCD实验谱和(1R, 5S)-和(1S, 5R)-叶菌唑的VCD理论谱图中主VCD带的信号、频率和相对强度。
（2）结果表明：
(i) 在1551～1525 cm-1范围内，(1R, 5S)-和(1S, 5R)-叶菌唑的IR理论谱图中出现了一个M型的吸收峰，与P1和P2的IR实验谱图中1507和1490 cm-1两处的吸收峰相对应，这是由C=N与苯环C=C伸缩振动的耦合作用而产生的。同时，在该区域中，(1R, 5S)-叶菌唑的VCD理论谱图出现一个负的吸收峰，与P1的VCD实验谱图相似；而(1S, 5R)-叶菌唑的VCD理论谱图则呈现一个正的VCD吸收峰，与P2的VCD实验谱图相匹配。
(ii) 在1520～1480 cm-1范围内，(1R, 5S)-和(1S, 5R)-叶菌唑的IR理论谱图呈现较弱的吸收峰，与P1和P2在1437 cm-1的吸收峰相对应，可解释为甲基的C-H不对称弯曲振动以及与苯环相连的亚甲基的C-H对称性弯曲振动耦合作用而产生。在该波数范围的VCD理论谱图中，(1R, 5S)-叶菌唑呈现一个由高波数到低波数的正到负的VCD吸收带，而(1S, 5R)-叶菌唑则出现一个负到正的VCD吸收带，分别与P1和P2组分的VCD实验谱相似。
(iii) (1R, 5S)-叶菌唑的IR理论谱图在1477 cm-1处出现弱的吸收峰，VCD理论谱中在相同位置出现一个正到负的吸收带，可解释为五元氮杂环上C-N伸缩振动以及与氮相连的骨架上C-N伸缩振动耦合作用而产生，且与P1组分在1430～1415 cm-1波数范围的实验谱相似。对于(1S, 5R)-叶菌唑，IR理论谱图在1465 cm-1呈现的吸收峰，VCD理论谱图中则在相同位置出现一个强的负到正的吸收带，亦与P2组分在1430～1415 cm-1波数范围的实验谱图一致。
(iv) 在1450～1400 cm-1范围，(1R, 5S)-叶菌唑的IR理论谱图呈现一个明显的吸收峰和一个M型的吸收峰，可解释为苯环上C=C弯曲振动、甲基C-H对称性弯曲振动以及与N相连的亚甲基的C-H对称性弯曲振动耦合产生；在该范围内VCD信号为一个正到负的吸收带；P1组分的IR实验谱在1410～1351 cm-1范围内观察到三个裂分的吸收带，VCD实验谱在该区域则出现较多吸收峰。
对于(1S, 5R)-叶菌唑，IR理论谱图在1450～1400 cm-1范围内仅出现一个明显的吸收峰，VCD理论谱则呈现一个明显的负到正的吸收带；在P2组分的实验谱图中，吸收峰较为丰富，相互干扰较弱。
(v) 在1394 cm-1波数处，(1R, 5S)-叶菌唑的VCD理论谱图中观察到一个负到正的吸收带，与P1组分在1350～1330 cm-1范围内VCD实验谱图相似，可解释为五元氮杂环中C=N伸缩振动耦合与其相连的亚甲基C-H不对称弯曲振动而产生的。(1S, 5R)-叶菌唑则在相似振动区域的1399 cm-1波数处出现一个强的正到负的VCD吸收带，与P2组分实验谱图相吻合。
(vi) 在1375～1340 cm-1范围的VCD吸收峰归属为由骨架上C-H弯曲振动、O-H弯曲振动以及与N原子相连的亚甲基C-H弯曲振动耦合而产生。在(1R, 5S)-叶菌唑的VCD理论谱图中在该区域中观察到一个-/+/-/+的VCD吸收带，而(1S, 5R)-叶菌唑则在相似振动区域出现一个+/-/+/-的VCD吸收带，与VCD实验谱图在1325～1300 cm-1范围的吸收带一致。
(vii) 在1335～1195 cm-1范围的VCD吸收带归属为骨上的C-H弯曲振动、O-H弯曲振动、C-N伸缩振动和C-C伸缩振动耦合而产生。在(1R, 5S)-叶菌唑的VCD理论谱图中，在该区域出现了由高波数到低波数的+/-/+/+/-/+/-/+/-的VCD吸收带，与P1组分的VCD吸收带一致；在(1S, 5R)-叶菌唑的VCD理论谱图中，在该区域出现了-/+/-/-/+/-/+/-/+的VCD吸收带，与P2组分的VCD吸收带吻合。
(viii) 在IR理论谱中，1173 cm-1处的吸收峰归属于五元氮杂环上的C-N伸缩振动，而IR实验谱图中该吸收峰出现在1135 cm-1处。VCD理论谱图中1164、1137和1120 cm-1等处的吸收峰可归属为结构骨架上的C-H弯曲振动，与VCD实验谱图中1119、1105和1070 cm-1的吸收峰相一致。1110 cm-1处的较强IR吸收峰归属为结构骨架上C-H不对称性弯曲振动，在实验谱图中则出现在1068 cm-1处，理论和实验VCD谱在此波数处则均出现了一个负的吸收峰。
对VCD理论和实验光谱进行综合分析（图3和图4），通过比较主VCD带的信号、频率和相对强度等信息，鉴定VCD理论谱图和VCD实验谱图基本一致。因此，P1组分的绝对构型鉴定为(1R, 5S)-叶菌唑，同时确定P2组分为(1S, 5R)-叶菌唑。
3、叶菌唑P3和P4组分绝对构型的鉴定
（1）步骤：
称取叶菌唑P3组分和P4组分(各2 mg)分别与溴化钾(58 mg)混合，充分研磨均匀(必要时可采用球磨机)后压制成固体片模，在分辨率为4 cm-1和调制器优化波数为1400 cm-1条件下进行固体VCD光谱测试，得到P3和P4组分的VCD实验谱图（图2）。先通过GaussView 5.0软件构建(1S, 5S)-和(1R, 5R)-叶菌唑的模型结构，然后在Gaussian09软件中，使用DFT方法，泛函函数B3LYP结合6-31+G(2d)水平，真空条件下分别计算(1S, 5S)-和(1R, 5R)-叶菌唑的VCD理论光谱（图5和图6）。比较P3和P4组分的VCD实验谱图和(1S,5S)-和(1R, 5R)-叶菌唑的理论VCD谱图中主VCD带的信号、频率和相对强度。
（2）结果表明：
(i) 在1550～1520 cm-1波数范围下，(1R, 5R)-和(1S, 5S)-叶菌唑的IR理论谱图中在1544与1528 cm-1处出现了一个裂分不完全的M型吸收峰，可归属为五元氮杂环上C=N与苯环C=C伸缩振动的耦合产生，这与P4组分的IR实验谱图中1510和1492 cm-1处的峰形一致；理论与实验VCD谱图在该区域均呈现一个由高波数到低波数的-/+/-/+的吸收带，两者高度一致。对于(1S, 5S)-叶菌唑，归属为C=N与苯环C=C伸缩振动吸收峰出现在1550～1520 cm-1范围内，IR理论谱和实验谱中均观察到一个裂分不完全的M型吸收峰，而VCD谱图在该区域则呈现一个+/-/+/-的吸收带，与P3组分的VCD实验谱相吻合。
(ii) (1R, 5R)-叶菌唑的VCD理论谱图在1520～1480 cm-1范围的吸收峰非常丰富，可指认为结构骨架上的甲基和亚甲基C-H对称性弯曲振动耦合作用，与P4组分在1477～1444 cm-1范围的VCD实验谱图相匹配。(1S, 5S)-叶菌唑的VCD理论谱图在1518～1470 cm-1范围内亦观察到较为丰富的吸收峰，与P3组分在1477～1440 cm-1范围的VCD实验谱相对应。
(iii) (1R, 5R)-叶菌唑的VCD理论谱图在1460～1429 cm-1范围呈现的-/+/-/+吸收带，可解释为五元氮杂环上的C-N-C伸缩振动和与N相连的亚甲基的C-H对称性弯曲振动耦合作用，这与P4组分在1410～1390 cm-1范围的VCD实验谱图相一致。(1S, 5S)-叶菌唑的VCD理论谱图则在1450～1414 cm-1范围内观察到一个+/-/+/-的VCD吸收带，与P3组分在1426～1393 cm-1范围内的VCD吸收带相吻合。
(iv) (1R, 5R)-叶菌唑在1420～1400 cm-1范围的VCD吸收峰可归属为两个甲基的C-H对称性弯曲振动及与五元手性中心上的C-H弯曲振动耦合作用，与P4组分实验谱图在1385～1370 cm-1范围的VCD吸收峰相对应；对于(1S, 5S)-叶菌唑和P3组分的VCD谱图，相似振动的VCD吸收峰出现在1404 cm-1处。
(v) (1R, 5R)-叶菌唑在1396～1340 cm-1的VCD吸收峰归属为五元氮杂环上的C=N伸缩振动和与N相连的亚甲基C-H不对称性弯曲振动、五元环手性中心上的C-H和O-H弯曲振动耦合而产生的，与P4组分在1367～1300 cm-1范围的VCD吸收峰相对应。对于(1S, 5S)-叶菌唑，VCD吸收峰出现在1397～1330 cm-1处，与P3组分的VCD实验谱图相近。同时，在IR实验和理论谱图中，均观察到与之相对应的IR吸收峰。
(vi) (1R, 5R)-叶菌唑在1326 cm-1处的VCD吸收峰归属为苯环骨架的C-C伸缩振动，对于(1S, 5S)-叶菌唑，该VCD吸收峰出现在1319 cm-1处，与VCD实验谱图中1291 cm-1处的吸收峰相一致。(1R, 5R)-叶菌唑在1314 cm-1处出现正的VCD吸收峰，而对于(1S, 5S)-叶菌唑，则在1318 cm-1处出现负的VCD吸收峰，均可归属为五元氮杂环的C-N伸缩振动，其VCD吸收峰出现在1283 cm-1处。
(vii) (1R, 5R)-叶菌唑在1294～1243 cm-1的VCD吸收峰归属为骨架中的C-H弯曲振动以及C-C伸缩振动耦合而产生，对于(1S, 5S)-叶菌唑，相似振动作用产生的吸收带出现在1294～1224 cm-1范围内。这与VCD实验谱在1277～1215 cm-1范围内的吸收带高度相似。同时，其IR实验和理论谱图中的吸收带也高度匹配。
(viii) (1R, 5R)-叶菌唑在1231 cm-1的VCD吸收峰归属为与苯环相连的C-C伸缩振动而产生，对于(1S, 5S)-叶菌唑，在1221 cm-1处未出现显著的VCD吸收峰，而在1210 cm-1处出现强的负吸收峰，归属为骨架中C-C伸缩振动和五元氮杂环上的C-H弯曲振动耦合作用，与P3组分的VCD实验谱图相一致。
对于(1R, 5R)-叶菌唑，苯环C-H弯曲振动、五元氮杂环的C-H不对称性弯曲振动和N-N伸缩振动，以及骨架上的C-C伸缩振动和C-H弯曲振动等相互耦合作用产生的VCD负吸收峰出现在1188 cm-1处，与P4组分的VCD实验谱图相一致。对于(1S, 5S)-叶菌唑，在该区域的VCD正吸收峰相对较弱，亦与P3组分的VCD实验谱图相一致。
(viiii) (1S, 5S)-叶菌唑在1161 cm-1处的IR吸收峰归属为五元氮杂环上的C-H对称性弯曲振动，在相同位置的VCD吸收峰呈现弱的负吸收峰；对于(1R, 5R)-叶菌唑，同样在该位置出现了IR吸收峰，但其VCD吸收峰较为显著。在IR实验谱图中，此处的吸收峰较强，与之相对应的VCD吸收峰较为丰富，与VCD理论谱图基本一致。
对VCD理论和实验光谱进行综合比较（图5和图6），通过比较主VCD带的信号、频率和相对强度等信息，鉴定VCD理论谱图和VCD实验谱图基本一致。因此，P3组分的绝对构型鉴定为(1S, 5S)-叶菌唑，同时确定P4组分为(1R, 5R)-叶菌唑。