本发明属于药物分析领域，具体涉及一种磺达肝癸钠注射液中游离硫酸根的检测方法。
背景技术：
磺达肝癸钠是人工合成的单一的化合物，特异性对靶目标Xa因子高度选择。因此，抗凝作用准确可控。同时，完全采用化学方法合成也减少了病原微生物污染和资源短缺的潜在风险。而传统的抗凝药物是从动物内脏中提取混合物，成分不稳定，作用的靶目标不具选择性，对多个凝血因子都有一部分作用，每一批之间对不同凝血因子的抑制强度又存在差异，因此，疗效存在不可控性。
磺达肝癸钠由于具有独特的作用机理，因此，与常用的传统抗凝药物低分子肝素(LWMH)相比，磺达肝癸钠的表现是相当卓越又安全的。
磺达肝癸钠注射液适用于重大骨科手术患者，预防静脉血栓栓塞事件的发生。该产品作用靶点明确，主要通过和抗凝血酶(ATIII)结合，加速凝血酶(AT)灭活因子Xa，属一种间接Xa因子抑制剂，具有较强的Xa因子抑制作用。
该品种于2001年12月获得美国FDA正式批准，2008年正式在中国上市，商品名为“安卓(ARIXTRA)”。目前，未有国内的生产厂家或研发机构的磺达肝癸钠注射液产品获批。
磺达肝癸钠，是一种亲水性、酸性的硫酸五聚糖的钠盐，易溶于水、氯化钠和氢氧化钠，不溶于乙醇。
磺达肝癸钠化学名为甲基O-(2-脱氧-6-O-磺酸基-2-磺酰胺基-α-D-吡喃葡萄糖)-(1→4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→4)-O-(2-脱氧-3，6-O-二磺酸基-2-磺酰胺基-α-D-吡喃葡萄糖)-(1→4)-O-(2-O-磺酸基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺酸基-2-磺酰胺基-α-D-吡喃葡萄糖苷十钠盐。
磺达肝癸钠的抗凝活性与结构中的硫酸盐密切相关，相关研究发现，当化合物发生降解时，磺达肝癸钠结构中的N-硫酸盐及O-硫酸盐几乎都发生了去硫酸化生成游离硫酸盐，由此通过测定游离硫酸盐的含量可反应磺达肝癸钠产品的质量。
目前，美国药典收载了测定游离硫酸盐离子的方法。但是研究结果显示，使用美国药典收载的测定磺达肝癸钠注射液项下游离硫酸根含量方法时，磺达肝癸钠会在离子色谱柱中逐渐富集，导致硫酸根离子峰保留时间漂移，且每进一针后色谱图上就会比上一针多出杂质峰。
使用美国药典规定的0.1mol/L氢氧化钠再生色谱柱后仍然不能完全解决基线噪音逐渐增大的问题。
采用美国药典关于磺达肝癸钠注射液项下游离硫酸根检测的色谱条件，每进一针样品结束后需要先用0.1mol/L氢氧化钠冲洗和平衡色谱柱总计39min后才能进行下一针样品的检测，检测费时，周期过长。
因此，提供一种准确可靠的离子色谱法测定磺达肝癸钠注射液中游离硫酸盐含量以保证磺达肝癸钠注射液的质量和疗效显得迫在眉睫和意义重大。
技术实现要素：
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种磺达肝癸钠注射液中游离硫酸根的检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种磺达肝癸钠注射液中游离硫酸根的检测方法，该检测方法采用高效离子交换色谱法，其色谱条件包括：色谱柱采用聚乙基苯乙烯表面结合烷基季胺盐的阴离子交换色谱柱，流动相采用碳酸盐类水溶液，再生剂采用高氯酸盐类水溶液，检测器采用电导检测器。
本发明采用聚乙基苯乙烯表面结合烷基季胺盐的阴离子交换色谱柱进行高效离子交换色谱法检测，在其他条件的配合下，准确度和灵敏度高，可以避免或降低其他杂质干扰峰的出现，防止硫酸根离子峰保留时间发生漂移，重现性好，能有效提高分析效率。本发明可以采用现有的各种聚乙基苯乙烯表面结合烷基季胺盐的阴离子交换色谱柱，本发明优选采用AS11分析柱，在实施例中具体采用了保护柱Dionex IonPac AG11，分析柱Dionex IonPac AS11。
本发明以碳酸盐类水溶液为流动相，其中的碳酸盐可以采用多种不影响本方法的具体碳酸盐，在一种优选方案中，碳酸盐类水溶液采用碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或碳酸钾水溶液中的一种或几种；优选为碳酸钠水溶液或碳酸氢钠水溶液；更优选为碳酸钠水溶液。
进一步的，本发明采用的碳酸盐类水溶液的浓度为1.5-3.5mmol/L；优选为2.0-3.0mmol/L；更优选为3.0mmol/L。
本发明的再生剂可采用现有的各种高氯酸盐类水溶液，在一种优选方案中，可以采用高氯酸钠水溶液或高氯酸钾水溶液；进一步优选为高氯酸钠水溶液。
进一步的，高氯酸盐类水溶液的浓度为0.9-2.0mol/L；优选为0.9-1.5mol/L；更优选为1.0mol/L。
在一种优选方案中，高效离子交换色谱法的条件还包括：流动相的流速为0.5-0.8ml/min；优选为0.5-0.6ml/min，进一步优选为0.5ml/min。
在一种优选方案中，高效离子交换色谱法的条件还包括：色谱柱的柱温为25-40℃，优选为30-35℃，更优选为30℃。
在一种优选方案中，高效离子交换色谱法的条件还包括：检测器的温度为25-45℃，优选为30-35℃，更优选为35℃。
本发明提供的一种磺达肝癸钠注射液中游离硫酸根的检测方法，可用于磺达肝癸钠注射液的研究及生产过程中的质量控制。该方法比美国药典收载的磺达肝癸钠注射液项下的游离硫酸根测定方法更具有适用性，可以准确的测定磺达肝癸钠注射液中的游离硫酸根的含量，方法稳定可靠，耐用性好，灵敏度高。
本方法可以准确测定磺达肝癸钠中游离硫酸根的含量，解决了现有官方公布的磺达肝癸钠注射液中游离硫酸根检测方法重现性差的问题，从而为磺达肝癸钠注射液质量分析和控制奠定基础，保证了该药品的安全性。
本方法能有效的分离磺达肝癸钠注射液中游离硫酸根和其他阴离子，每次试验结束后用高氯酸盐溶液以低流速冲洗1小时即可将色谱柱进行保存，待下次使用。
采用本发明的技术方案，优势如下:
采用本发明的方法进行磺达肝癸钠注射液中游离硫酸根的检测时不需要中途额外添加色谱柱再生和平衡程序。
本发明分析效率高，节省时间，有利于实验室大量样品的快速分析，有利于生产的效率的提高，可用于磺达肝癸钠注射液的研究及生产过程中的质量控制。
附图说明
图1是实施例1的离子交换色谱图；
图2是实施例1的离子交换色谱图。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
实施例1
仪器与条件
离子色谱仪：瑞士万通离子色谱仪IC930，电导检测器；
色谱柱：保护柱Dionex IonPac AG11(2X50mm)，分析柱Dionex IonPac AS11(2X250mm)；
流动相：2mmol/L Na2CO3
再生剂：1mol/L NaClO3
柱温箱温度：30℃
检测器温度：35℃
流速：0.5mL/min
进样量：20μL
实验步骤：
空白溶液：水
专属性溶液：辅料溶液
对照品溶液(2μg/mL)：用移取200μL硫酸根溶液标准物质置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀即得。
灵敏度溶液(0.1μg/mL)：用移移取500μL对照品溶液置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀即得。
系统适应性溶液(2μg/mL氯离子、2μg/mL硫酸根)：用移取200μL氯离子溶液标准物质及200μL硫酸根溶液标准物质同置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得。
供试品溶液(0.4mg/mL)：用移取800μL磺达肝癸钠注射液置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取空白溶液、专属性溶液、对照品溶液、灵敏度溶液系统适应性溶液和供试品溶液20ul，按照上述条件进行分析，记录色谱图。
1、空白溶液和空白辅料溶液中无干扰硫酸根离子的峰，LOQ为2.0μg/mL，氯离子与硫酸根分离度为11.6，对照品溶液重复进样6次，峰面积的RSD为0.7％。
2、该色谱条件下基线较平稳，进供试品后无未知杂质峰出现。
实施例2
仪器与条件
离子色谱仪：瑞士万通离子色谱仪IC930，电导检测器；
色谱柱：保护柱Dionex IonPac AG11(2X50mm)，分析柱Dionex IonPac AS11(2X250mm)；
流动相：3mmol/L Na2CO3
再生剂：1mol/L NaClO3
柱温箱温度：30℃
检测器温度：35℃
流速：0.5mL/min
进样量：20μL
实验步骤：
空白溶液：水
专属性溶液：辅料溶液
对照品溶液(2μg/mL)：用移取200μL硫酸根溶液标准物质置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀即得。
灵敏度溶液(0.1μg/mL)：用移移取500μL对照品溶液置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀即得。
系统适应性溶液(2μg/mL氯离子、2μg/mL硫酸根)：用移取200μL氯离子溶液标准物质及200μL硫酸根溶液标准物质同置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得。
供试品溶液(0.4mg/mL)：用移取800μL磺达肝癸钠注射液置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取空白溶液、专属性溶液、对照品溶液、灵敏度溶液系统适应性溶液和供试品溶液20ul，按照上述条件进行分析，记录色谱图。
1、空白溶液和空白辅料溶液中无干扰硫酸根离子的峰，LOQ为0.10μg/mL，氯离子与硫酸根分离度为13.2，对照品溶液重复进样6次，峰面积的RSD为1.1％。
2、该色谱条件下基线较平稳，进供试品后无未知杂质峰出现。每次实验后，用1mol/L高氯酸钠溶液以低流速冲洗1小时以上即可。
对比例1
仪器与条件
离子色谱仪：瑞士万通离子色谱仪IC930，电导检测器；
色谱柱：保护柱Waters IC-Pak Anion Guard-Pak Kit，分析柱Waters IC-Pak Anion 4.6X50mm,10μm；
流动相：3mmol/L Na2CO3与NaHCO3缓冲液
再生剂：0.1mol/L NaOH
柱温箱温度：30℃
检测器温度：35℃
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
实验步骤：
空白溶液：水
专属性溶液：辅料溶液
对照品溶液(2μg/mL)：用移取200μL硫酸根溶液标准物质置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀即得。
灵敏度溶液(0.1μg/mL)：用移移取500μL对照品溶液置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀即得。
系统适应性溶液(2μg/mL氯离子、2μg/mL硫酸根)：用移取200μL氯离子溶液标准物质及200μL硫酸根溶液标准物质同置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得。
供试品溶液(0.4mg/mL)：用移取800μL磺达肝癸钠注射液置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取空白溶液、专属性溶液、对照品溶液、灵敏度溶液系统适应性溶液和供试品溶液20ul，按照上述条件进行分析，记录色谱图。
实验结果表明：
1、空白溶液无干扰硫酸根离子的峰，LOQ为2.0129μg/mL，氯离子与硫酸根分离度为13.4，对照品溶液重复进样6次，峰面积的RSD为0.5％，空白辅料在硫酸根出峰位置有干扰峰出现。
2、采集1针供试品后使用0.1mol/L的氢氧化钠溶液对色谱柱进行再生10min，再使用流动相平衡24min后进第2针供试品溶液，发现从第2针供试品溶液开始，图谱基线噪音变大且有未知杂质峰出现。
3、随着供试品进样次数的增加，供试品溶液中出现的未知杂质峰的个数越多，进对照品溶液后色谱图中也出现多个未知杂质峰，且硫酸根离子峰的保留时间发生较大漂移，最大漂移约1.6min左右。
采用美国药典收载的磺达肝癸钠注射液项下的色谱条件无法实现磺达肝癸钠的完全洗脱，导致磺达肝癸钠在色谱柱中逐渐富集，柱效下降，无法对游离硫酸根进行准确测定。
对比例2
仪器与条件
离子色谱仪：瑞士万通离子色谱仪IC930，电导检测器；
色谱柱：保护柱Waters IC-Pak Anion Guard-Pak Kit，分析柱Waters IC-Pak Anion 4.6X50mm,10μm；
流动相：3mmol/L Na2CO3
再生剂：0.1mol/L NaOH
柱温箱温度：30℃
检测器温度：35℃
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
实验步骤：
空白溶液：水
专属性溶液：辅料溶液
对照品溶液(2μg/mL)：用移取200μL硫酸根溶液标准物质置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀即得。
灵敏度溶液(0.1μg/mL)：用移移取500μL对照品溶液置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀即得。
系统适应性溶液(2μg/mL氯离子、2μg/mL硫酸根)：用移取200μL氯离子溶液标准物质及200μL硫酸根溶液标准物质同置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得。
供试品溶液(0.4mg/mL)：用移取800μL磺达肝癸钠注射液置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取空白溶液、专属性溶液、对照品溶液、灵敏度溶液系统适应性溶液和供试品溶液20ul，按照上述条件进行分析，记录色谱图。
1、空白溶液和空白辅料溶液中无干扰硫酸根离子的峰，LOQ为2.0μg/mL，氯离子与硫酸根分离度为7.9，对照品溶液重复进样6次，峰面积的RSD为0.3％。
2、由于碳酸钠溶液的洗脱能力更强，各色谱峰保留时间均前移。游离硫酸根色谱峰临近空白辅料峰。
本发明的方法比美国药典收载的磺达肝癸钠注射液项下的游离硫酸根测定方法更具有适用性，可以准确的测定磺达肝癸钠注射液中的游离硫酸根的含量，方法稳定可靠，耐用性好，灵敏度高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明保护范围之内。