本发明属于兽医医疗检测技术领域，具体涉及一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
隐孢子虫(cryptosporidium)是重要的食源性和水源性人兽共患原虫之一，属内种类和基因型较多，多数具有宿主适应性，对宿主的致病性存在差异，同时其基因型分布存在地理特征。隐孢子虫病被认为是人类最常见的6种腹泻疾病之一，免疫功能正常者呈自限性感染，而对儿童、hiv感染者及免疫缺陷疾病患者则引起急性、迁延性和慢性腹泻，甚至导致死亡。
近年来基于分子生物学检测，马感染的隐孢子虫种类/基因型呈现多样性，以微小隐孢子虫和隐孢子虫基因型为主要感染种类/基因型，世界范围内，马隐孢子虫感染率为0-37％，为快速准确检测出马属隐孢子虫病，可以通过抗原与抗体的特异性结合，根据循环外周血中马属隐孢子虫病的抗体的数量，可判断是否感染马属隐孢子虫病，用于马属隐孢子虫病感染的临床辅助诊断，可以快速、敏感的检测出人体的感染情况。寄生于马属动物的隐孢子虫不仅可导致幼龄动物严重腹泻甚至死亡，而且可引起人体感染，具有重要的公共卫生意义。目前还没有比较有效的专门针对马属隐孢子虫病的精确检测手段。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒及其检测方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒，其包括氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽，分别为：
seqidno.1：glugluglyalaglualaalavalleuleualaalaalaglyileglnglyserthrala；
seqidno.2：glngluleugluserglualaglyglyileargvalthralaseralaargthrglygly；
seqidno.3：thrmetglyalaglyilegluargarggluthralaalaproalathralathrglyala；
seqidno.4：glualametaspleuleuserglualaglualathrilealaserthrglyglyalaala；
seqidno.5：glyleuthrilevalglygluglyserleulysalaglyalaalathralaileglyglu；
seqidno.6：thralailegluglyaspseralathrglyleuglualaalametseralaileglyala。
本发明中，氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽在试剂盒中作为tb刺激物，用于检测反应。
优选地，在所述马属隐孢子虫病的检测试剂盒中，氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽中的每一条的含量为10mg。
优选地，所述马属隐孢子虫病的检测试剂盒还包括无血清培养基。
优选地，所述马属隐孢子虫病的检测试剂盒还包括分离液。
优选地，所述马属隐孢子虫病的检测试剂盒还包括高特异性鼠抗人igg抗体和/或马属隐孢子虫病感染阳性刺激物。
优选地，所述马属隐孢子虫病的检测试剂盒还包括用于酶联免疫斑点法的显色试剂，如nbt/bcip显色系统，最终显色蓝紫色斑点，或aec显色系统，最终显色红色斑点。
本发明还提供利用前述马属隐孢子虫病的检测试剂盒对马属隐孢子虫病进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；
(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列如进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人igg抗体进行抗原抗体反应；
(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。
步骤(1)中，所述将分离好的细胞重悬于无血清培养基中优选保持细胞浓度为1.0×105～3.0×105细胞/ml。
步骤(2)中，所述重悬后的细胞优选加入96孔板中，所述加入氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽优选加入96孔板中与重悬后的细胞混合以进行共孵育。所述重悬后的细胞的添加量更优选每个反应孔为100μl，所述氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽的添加量优选每个反应孔中的终浓度为5μl。所述共孵育的时间优选16～20小时。
如本领域常规，步骤(2)在操作时，优选设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为马属隐孢子虫病阳性刺激物；所述阴性对照为无血清培养基留白，即反应孔中只添加无血清培养基，不添加任何其他试剂。
必须要指出的是，本发明所述的对马属隐孢子虫病进行检测的方法属于针对体外分离样本进行鉴定定性的检测方法，仅以获得待测样本中是否被马属隐孢子虫病刺激而感染的数量为直接结果和目的，并不涉及对人体健康状况的判断，不属于与疾病诊断相关的方法。
本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明除特别说明之外，所用的百分比都是体积百分比。
本发明的有益效果为：本发明提供的包括氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽的检测试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，且相比传统方法检测的过程大大简化，极大地降低了成本。利用该试剂盒对分离的体外样本进行检测方便快捷，可控性和精确性均非常理想，且试剂盒操作简便。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明基于马属隐孢子虫病的免疫应答机制，设计出能够人工全序列合成的6条多肽作为检测物(即序列表中的多肽1～多肽6，氨基酸编码序列对应为seqidno.1～seqidno.6)，经过大量的实验验证，并经和现有的检测方法对比，具有明显优势，本发明的包括氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6所示的6条多肽的试剂盒及利用其对体外马属隐孢子虫病感染待测样本进行检测的方法具有方便快捷、准确度高、成本低等优势，具有良好的应用前景。
氨基酸序列为seqidno.1～seqidno.6的6条多肽，具体分别为：
seqidno.1：glugluglyalaglualaalavalleuleualaalaalaglyileglnglyserthrala；
seqidno.2：glngluleugluserglualaglyglyileargvalthralaseralaargthrglygly；
seqidno.3：thrmetglyalaglyilegluargarggluthralaalaproalathralathrglyala；
seqidno.4：glualametaspleuleuserglualaglualathrilealaserthrglyglyalaala；
seqidno.5：glyleuthrilevalglygluglyserleulysalaglyalaalathralaileglyglu；
seqidno.6：thralailegluglyaspseralathrglyleuglualaalametseralaileglyala。
下面是具体的实施例，用于进一步阐述本发明的技术方案及技术效果。
实施例1
马外周血样本来源于马属隐孢子虫病感染性家马及非感染家马，数量为127个待测样本。
每个采样个体用肝素钠收集管采集10ml血液，室温条件下6小时内运至实验室。
各待测样本的检测步骤如下：
(1)用分离液将pbmc分离，分离好的细胞重悬于无血清培养基中，细胞浓度为1.5×105细胞/ml；将重悬的细胞加入pvdf96孔板中，每个反应孔加入100μl，每个样品加入10孔中，即做10个重复；
(2)向各反应孔中加入由无血清培养基和终浓度分别达到5μm的6条多肽组成的混合物50μl，混合均匀进行共孵育；设置阳性对照和阴性对照，向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人igg抗体进行抗原抗体反应；
(3)6％二氧化碳培养箱36℃孵育16小时；
(4)对抗原抗体反应后的体系用pbs缓冲液进行洗涤；
(5)再加入显色底物进行显色反应，室温孵育25分钟，孵育过程中观察斑点形成，计数反应生成的斑点数。
使用斑点分析仪计数斑点形成细胞的数量，根据阴性和阳性判定标准的判定，分别统计检测阴性和阳性例数，如下表所示。
阳性符合率：73/(73+6)＝92.41％
阴性符合率：44/(44+4)＝91.67％
实施例2
马外周血样本来源于马属隐孢子虫病感染性家马及非感染家马，数量为127个待测样本。
每个采样个体用肝素钠收集管采集10ml血液，室温条件下6小时内运至实验室。
各待测样本的检测步骤如下：
(1)用分离液将pbmc分离，分离好的细胞重悬于无血清培养基中，细胞浓度为3.5×105细胞/ml；将重悬的细胞加入pvdf96孔板中，每个反应孔加入100μl，每个样品加入10孔中，即做10个重复；
(2)向各反应孔中加入由无血清培养基和终浓度分别达到5μm的6条多肽组成的混合物50μl，混合均匀进行共孵育；设置阳性对照和阴性对照，向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人igg抗体进行抗原抗体反应；
(3)5％二氧化碳培养箱36℃孵育20小时；
(4)对抗原抗体反应后的体系用pbs缓冲液进行洗涤；
(5)再加入显色底物进行显色反应，室温孵育30分钟，孵育过程中观察斑点形成，计数反应生成的斑点数。
使用斑点分析仪计数斑点形成细胞的数量，根据阴性和阳性判定标准的判定，分别统计检测阴性和阳性例数，如下表所示。
阳性符合率：75/(75+5)＝93.75％
阴性符合率：43/(43+4)＝91.49％
实验结果表面，与现有使用相同方法的产品相比较，有相类似的灵敏度及特异性，可以作为一种马属隐孢子虫病检测试剂盒使用，且成本低廉，操作简单。
综上所述，本发明的多肽混合物、检测试剂盒及其相应的检测方法用于检测马属隐孢子虫病，具有方便快捷、稳定性高、特异性强的特点，且极大地降低了成本。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110>边学静、殷玉芹、夏召莲、夏召亮
<120>一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒及其检测方法
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
glugluglyalaglualaalavalleuleualaalaalaglyilegln
151015
glyserthrala
20
<210>2
<211>20
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
glngluleugluserglualaglyglyileargvalthralaserala
151015
argthrglygly
20
<210>3
<211>20
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
thrmetglyalaglyilegluargarggluthralaalaproalathr
151015
alathrglyala
20
<210>4
<211>20
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
glualametaspleuleuserglualaglualathrilealaserthr
151015
glyglyalaala
20
<210>5
<211>20
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
glyleuthrilevalglygluglyserleulysalaglyalaalathr
151015
alaileglyglu
20
<210>6
<211>20
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
thralailegluglyaspseralathrglyleuglualaalametser
151015
alaileglyala
20