本发明属于医药领域，涉及药物分析，具体涉及一种高效液相色谱手性流动相法分离盐酸达卡他韦及其五种光学异构体。
背景技术：
盐酸达卡他韦(daclatasvirdihydrochloride，1)，化学名为n,n'-[[1,1'-联苯]-4,4'-二基双[1h-咪唑-5,2-二基-(2s)-2,1-吡咯烷二基[(1s)-1-(1-甲基乙基)-2-氧代-1,2-乙烷二基]]]二氨基甲酸二甲酯二盐酸盐，是一种非结构蛋白5a(ns5a)抑制剂，为抗丙型肝炎病毒药物。
1(as,bs,cs,ds型)含有4个手性中心。据文献报道(中国专利，cn101778841a，用于合成用于治疗丙型肝炎的化合物的方法)，1的制备过程中会产生5个手性异构体，分别为2(ar,bs,cs,ds型)、3(as,bs,cr,ds型)、4(ar,bs,cs,dr型)、5(as,br,cr,ds型)和6(ar,br,cr,dr型)。根据相关技术要求(美国fda关于开发立体异构体新药的政策简介，中国新药杂志，2010年第9卷第9期)，须严格控制药物的所有光学异构体，以确保终产品的安全性、有效性和质量可控性。1-6化学结构式如下。
郭凤等提供了一种测定盐酸达卡他韦中5种光学异构体的hplc法(盐酸达卡他韦中5种光学异构体的hplc法测定，中国医药工业杂志，2016年第47卷第10期)，其采用chiralpakic手性色谱柱，以甲基叔丁醚(含0.1％二乙胺)：甲醇(88：12)为流动相，盐酸达卡他韦及其5个光学异构体均分离完全。
关于手性化合物的分离，彭红等主编的《药物分析》(全国普通高等中医药院校药学类“十二五”规划教材，出版时间为2015年03月)于320页详细介绍了本领域常用的手性高效液相色谱法。320页记载，“引入适宜的手性环境使对映体间呈现理化特征差异，是hplc法进行光学异构体拆分的关键。目前，手性hplc法通常分为直接法和间接法。间接法又称柱前衍生化法，是指药物对映体在分离前先与具有高光学纯度的手性衍生化试剂反应，使药物对映体形成一对非对映异构体，再以常规固定相进行分离，也称cdr法。用手性流动相(cmp)或手性固定相(csp)为载体进行拆分的方法是直接法。”cdr法、cmp法和csp法各有优缺点，《药物分析》322页进行了归纳，如下表所示。
可见，郭凤等提供的方法需要借助于昂贵的手性柱，成本高，且适用性不如普通hplc法。因此，开发一种手性流动相hplc法分离盐酸达卡他韦及其五种光学异构体极具意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效液相色谱手性流动相法分离盐酸达卡他韦及其五种光学异构体。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
方法a：
一种分离盐酸达卡他韦及其五种光学异构体的高效液相色谱手性流动相法，流动相添加剂为l-天门冬氨酸。
进一步地，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶填料。
进一步地，流动相添加剂在流动相中的浓度为8-12mm。
进一步地，流动相添加剂在流动相中的浓度为10mm。
进一步地，色谱参数如下：
色谱柱：c18色谱柱；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mml-天门冬氨酸；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mml-天门冬氨酸；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：0.8-1.2ml/min；
柱温：35-45℃；
检测波长：300-310nm。
优选地，柱温为40℃。
优选地，流速为1.0ml/min。
优选地，检测波长为305nm。
优选地，色谱柱为agilentzorbaxextend-c18液相色谱柱。
优选地，色谱柱规格为250×4.6mm，5μm。
方法b：
一种分离盐酸达卡他韦及其五种光学异构体的高效液相色谱手性流动相法，流动相添加剂为(2r,3r)-双正丙基酒石酸。
进一步地，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶填料。
进一步地，流动相添加剂在流动相中的浓度为8-12mm。
进一步地，流动相添加剂在流动相中的浓度为10mm。
进一步地，色谱参数如下：
色谱柱：c18色谱柱；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mm(2r,3r)-双正丙基酒石酸；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mm(2r,3r)-双正丙基酒石酸；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：0.8-1.2ml/min；
柱温：35-45℃；
检测波长：300-310nm。
优选地，柱温为40℃。
优选地，流速为1.0ml/min。
优选地，检测波长为305nm。
优选地，色谱柱为agilentzorbaxextend-c18液相色谱柱。
优选地，色谱柱规格为250×4.6mm，5μm。
方法c：
一种分离盐酸达卡他韦及其五种光学异构体的高效液相色谱手性流动相法，流动相添加剂为d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸。
进一步地，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶填料。
进一步地，流动相添加剂在流动相中的浓度为8-12mm。
进一步地，流动相添加剂在流动相中的浓度为10mm。
进一步地，色谱参数如下：
色谱柱：c18色谱柱；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mmd-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mmd-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：0.8-1.2ml/min；
柱温：35-45℃；
检测波长：300-310nm。
优选地，柱温为40℃。
优选地，流速为1.0ml/min。
优选地，检测波长为305nm。
优选地，色谱柱为agilentzorbaxextend-c18液相色谱柱。
优选地，色谱柱规格为250×4.6mm，5μm。
方法d：
一种分离盐酸达卡他韦及其五种光学异构体的高效液相色谱手性流动相法，流动相添加剂为(1r,2r)-(-)-n-(对甲基苯磺酰基)-1,2-二苯基乙二胺。
进一步地，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶填料。
进一步地，流动相添加剂在流动相中的浓度为8-12mm。
进一步地，流动相添加剂在流动相中的浓度为10mm。
进一步地，色谱参数如下：
色谱柱：c18色谱柱；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mm(1r,2r)-(-)-n-(对甲基苯磺酰基)-1,2-二苯基乙二胺；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mm(1r,2r)-(-)-n-(对甲基苯磺酰基)-1,2-二苯基乙二胺；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：0.8-1.2ml/min；
柱温：35-45℃；
检测波长：300-310nm。
优选地，柱温为40℃。
优选地，流速为1.0ml/min。
优选地，检测波长为305nm。
优选地，色谱柱为agilentzorbaxextend-c18液相色谱柱。
优选地，色谱柱规格为250×4.6mm，5μm。
方法e：
一种分离盐酸达卡他韦及其五种光学异构体的高效液相色谱手性流动相法，流动相添加剂为l-缬氨酰-l-酪氨酸。
进一步地，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶填料。
进一步地，流动相添加剂在流动相中的浓度为8-12mm。
进一步地，流动相添加剂在流动相中的浓度为10mm。
进一步地，色谱参数如下：
色谱柱：c18色谱柱；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mml-缬氨酰-l-酪氨酸；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mml-缬氨酰-l-酪氨酸；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：0.8-1.2ml/min；
柱温：35-45℃；
检测波长：300-310nm。
优选地，柱温为40℃。
优选地，流速为1.0ml/min。
优选地，检测波长为305nm。
优选地，色谱柱为agilentzorbaxextend-c18液相色谱柱。
优选地，色谱柱规格为250×4.6mm，5μm。
有益效果：
本发明发现，将l-天门冬氨酸、(2r,3r)-双正丙基酒石酸、d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸、(1r,2r)-(-)-n-(对甲基苯磺酰基)-1,2-二苯基乙二胺或l-缬氨酰-l-酪氨酸作为添加剂添加到流动相中使用普通的c18液相色谱柱即可有效分离盐酸达卡他韦及其五种光学异构体，两两均达到基线分离。该方法不依赖于手性填料色谱柱，不仅成本低廉，而且适用性、重复性高。本领域技术人员知道，手性流动相法非常局限，仅仅可以分离有限的化合物，而且没有系统的理论指导何种化合物可以通过手性流动相法进行分离，只能通过“试错法”反复尝试和毫无章法的摸索。因此，本发明提供的方法对于本领域技术人员而言是非显而易见的。
附图说明
图1为实施例1高效液相色谱方法分离图；
图2为实施例2高效液相色谱方法分离图；
图3为实施例3高效液相色谱方法分离图；
图4为实施例4高效液相色谱方法分离图；
图5为实施例5高效液相色谱方法分离图；
图6为实施例6(对比实施例1)高效液相色谱方法分离图；
图7为实施例7(对比实施例2)高效液相色谱方法分离图；
图8为实施例8(对比实施例3)高效液相色谱方法分离图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：
1(as,bs,cs,ds型)、2(ar,bs,cs,ds型)、3(as,bs,cr,ds型)、4(ar,bs,cs,dr型)、5(as,br,cr,ds型)和6(ar,br,cr,dr型)对照品自制或购买，纯度不低于98％。
混合对照品溶液的配制：分别精密称取1-6对照品各10mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀，即得1-6浓度均为0.5mg/ml的混合对照品溶液。
hplc色谱参数：
色谱仪：waters2695型高效液相色谱仪；
色谱柱：agilentzorbaxextend-c18(250×4.6mm，5μm)；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mml-天门冬氨酸；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mml-天门冬氨酸；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：1.0ml/min；
柱温：40℃；
检测波长：305nm。
精密量取10μl混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，如图1所示。
从图1可见，盐酸达卡他韦及其五种光学异构体分离度良好，均达到基线分离。
实施例2：
1(as,bs,cs,ds型)、2(ar,bs,cs,ds型)、3(as,bs,cr,ds型)、4(ar,bs,cs,dr型)、5(as,br,cr,ds型)和6(ar,br,cr,dr型)对照品自制或购买，纯度不低于98％。
混合对照品溶液的配制：分别精密称取1-6对照品各10mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀，即得1-6浓度均为0.5mg/ml的混合对照品溶液。
hplc色谱参数：
色谱仪：waters2695型高效液相色谱仪；
色谱柱：agilentzorbaxextend-c18(250×4.6mm，5μm)；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mm(2r,3r)-双正丙基酒石酸；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mm(2r,3r)-双正丙基酒石酸；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：1.0ml/min；
柱温：40℃；
检测波长：305nm。
精密量取10μl混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，如图2所示。
从图2可见，盐酸达卡他韦及其五种光学异构体分离度良好，均达到基线分离。
实施例3：
1(as,bs,cs,ds型)、2(ar,bs,cs,ds型)、3(as,bs,cr,ds型)、4(ar,bs,cs,dr型)、5(as,br,cr,ds型)和6(ar,br,cr,dr型)对照品自制或购买，纯度不低于98％。
混合对照品溶液的配制：分别精密称取1-6对照品各10mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀，即得1-6浓度均为0.5mg/ml的混合对照品溶液。
hplc色谱参数：
色谱仪：waters2695型高效液相色谱仪；
色谱柱：agilentzorbaxextend-c18(250×4.6mm，5μm)；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mmd-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mmd-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：1.0ml/min；
柱温：40℃；
检测波长：305nm。
精密量取10μl混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，如图3所示。
从图3可见，盐酸达卡他韦及其五种光学异构体分离度良好，均达到基线分离。
实施例4：
1(as,bs,cs,ds型)、2(ar,bs,cs,ds型)、3(as,bs,cr,ds型)、4(ar,bs,cs,dr型)、5(as,br,cr,ds型)和6(ar,br,cr,dr型)对照品自制或购买，纯度不低于98％。
混合对照品溶液的配制：分别精密称取1-6对照品各10mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀，即得1-6浓度均为0.5mg/ml的混合对照品溶液。
hplc色谱参数：
色谱仪：waters2695型高效液相色谱仪；
色谱柱：agilentzorbaxextend-c18(250×4.6mm，5μm)；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mm(1r,2r)-(-)-n-(对甲基苯磺酰基)-1,2-二苯基乙二胺；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mm(1r,2r)-(-)-n-(对甲基苯磺酰基)-1,2-二苯基乙二胺；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：1.0ml/min；
柱温：40℃；
检测波长：305nm。
精密量取10μl混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，如图4所示。
从图4可见，盐酸达卡他韦及其五种光学异构体分离度良好，均达到基线分离。
实施例5：
1(as,bs,cs,ds型)、2(ar,bs,cs,ds型)、3(as,bs,cr,ds型)、4(ar,bs,cs,dr型)、5(as,br,cr,ds型)和6(ar,br,cr,dr型)对照品自制或购买，纯度不低于98％。
混合对照品溶液的配制：分别精密称取1-6对照品各10mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀，即得1-6浓度均为0.5mg/ml的混合对照品溶液。
hplc色谱参数：
色谱仪：waters2695型高效液相色谱仪；
色谱柱：agilentzorbaxextend-c18(250×4.6mm，5μm)；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mml-缬氨酰-l-酪氨酸；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mml-缬氨酰-l-酪氨酸；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：1.0ml/min；
柱温：40℃；
检测波长：305nm。
精密量取10μl混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，如图5所示。
从图5可见，盐酸达卡他韦及其五种光学异构体分离度良好，均达到基线分离。
实施例6(对比实施例1)：
1(as,bs,cs,ds型)、2(ar,bs,cs,ds型)、3(as,bs,cr,ds型)、4(ar,bs,cs,dr型)、5(as,br,cr,ds型)和6(ar,br,cr,dr型)对照品自制或购买，纯度不低于98％。
混合对照品溶液的配制：分别精密称取1-6对照品各10mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀，即得1-6浓度均为0.5mg/ml的混合对照品溶液。
hplc色谱参数：
色谱仪：waters2695型高效液相色谱仪；
色谱柱：agilentzorbaxextend-c18(250×4.6mm，5μm)；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mml-脯氨酸；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mml-脯氨酸；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：1.0ml/min；
柱温：40℃；
检测波长：305nm。
精密量取10μl混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，如图6所示。
从图6可见，盐酸达卡他韦及其五种光学异构体不能达到两两基线分离。
实施例7(对比实施例2)：
1(as,bs,cs,ds型)、2(ar,bs,cs,ds型)、3(as,bs,cr,ds型)、4(ar,bs,cs,dr型)、5(as,br,cr,ds型)和6(ar,br,cr,dr型)对照品自制或购买，纯度不低于98％。
混合对照品溶液的配制：分别精密称取1-6对照品各10mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀，即得1-6浓度均为0.5mg/ml的混合对照品溶液。
hplc色谱参数：
色谱仪：waters2695型高效液相色谱仪；
色谱柱：agilentzorbaxextend-c18(250×4.6mm，5μm)；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mm万古霉素；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mm万古霉素；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：1.0ml/min；
柱温：40℃；
检测波长：305nm。
精密量取10μl混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，如图7所示。
从图7可见，盐酸达卡他韦及其五种光学异构体不能达到两两基线分离。
实施例8(对比实施例3)：
1(as,bs,cs,ds型)、2(ar,bs,cs,ds型)、3(as,bs,cr,ds型)、4(ar,bs,cs,dr型)、5(as,br,cr,ds型)和6(ar,br,cr,dr型)对照品自制或购买，纯度不低于98％。
混合对照品溶液的配制：分别精密称取1-6对照品各10mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀，即得1-6浓度均为0.5mg/ml的混合对照品溶液。
hplc色谱参数：
色谱仪：waters2695型高效液相色谱仪；
色谱柱：agilentzorbaxextend-c18(250×4.6mm，5μm)；
流动相a相：体积百分浓度为20％的乙腈水溶液，含有10mm羟丙基-β-环糊精；
流动相b相：体积百分浓度为80％的乙腈水溶液，含有10mm羟丙基-β-环糊精；
洗脱程序：0-10min，30％b；10-60min，30％→100％b；
流速：1.0ml/min；
柱温：40℃；
检测波长：305nm。
精密量取10μl混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，如图8所示。
从图8可见，盐酸达卡他韦及其五种光学异构体不能达到两两基线分离。
本发明发现，将l-天门冬氨酸、(2r,3r)-双正丙基酒石酸、d-(+)-二对甲基苯甲酰酒石酸、(1r,2r)-(-)-n-(对甲基苯磺酰基)-1,2-二苯基乙二胺或l-缬氨酰-l-酪氨酸作为添加剂添加到流动相中使用普通的c18液相色谱柱即可有效分离盐酸达卡他韦及其五种光学异构体，两两均达到基线分离。该方法不依赖于手性填料色谱柱，不仅成本低廉，而且适用性、重复性高。本领域技术人员知道，手性流动相法非常局限，仅仅可以分离有限的化合物，而且没有系统的理论指导何种化合物可以通过手性流动相法进行分离，只能通过“试错法”反复尝试和毫无章法的摸索。因此，本发明提供的方法对于本领域技术人员而言是非显而易见的。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。