一种在低压状态下采用电导检测器进行检测的氨基酸分析方法与流程

本发明属于氨基酸的分析方法,特别涉及一种在低压状态下采用电导检测器进行检测的氨基酸分析方法。

背景技术：

有关氨基酸的分析始于二十世纪三、四十年代。四十年代后期,moore和stein将离子交换树脂用于氨基酸分析中,并于1958年研制出了世界上第一台采用离子交换色谱法和柱后節三酮衍生检测法的自动专用氨基酸分析仪,自此,上述方法与配套仪器一直在氨基酸分析中占主导地位:七十年代以来,高效液相色谱特别是键合反相色谱及柱前衍生技术的发展,为氨基酸分析提供了新的方法,并开发了除節三酮外的一系列衍生剂。以上方法虽然解决了氨基酸的定量分析,但都需要利用衍生反应才能进行检测,而且其工艺步骤中包括梯度洗脱,操作十分烦琐:此外,都需在2000～4000psi高压下操作完成检测。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的不足,提供一种在低压状态下采用电导检测器进行检测的氨基酸分析方法的新方法,此种方法既能保证分析效果,又能简化工艺流程和降低分析成本。

本发明的技术方案是:根据氨基酸分子中既有氨基又有據基的两性电离特征、分子側链基团的性质和等电点的ph范围,采用阳离子交换色谱法设计工艺步骤,工艺步骤依次包括基线测绘、进样和离子交换、洗脱分析。

1、基线测绘

将洗脱液用工作压力为30～40psi的低压泵输送入色谱分离柱使其达到平衡,从色谱分离柱输出的洗脱液流过电导流通池时由电导检测器转化为电信号,从而形成基线被测绘。

含有氨基酸的被测试样在洗脱液的推动下进入色谱分离柱产生离子交换,带正电荷的氨基酸置换下色谱分离柱上的氢离子并保留在色谱分离柱上。

3、洗脱分析

将洗脱液连续输送入色谱分离柱不断将各种氨基酸在色谱分离柱上展开,各种氨基酸离子产生差速迁移而相互分离,在不同的保留时间被洗脱,从色谱分离柱输出的含氨基酸离子的溶液流过电导流通池时由电导检测器转化为电信号,从而形成谱图被测绘。

洗脱液按照氨基酸的酸碱性选择,分析酸性和中性氨基酸时,洗脱液采用浓度为0.5x10-3mol/l～2.0xl0-3mo1/l的hn03溶液,分析碱性氨基酸时,洗脱液采用浓度为6x10-3mol/l～10x10-3mol/l的柠據酸钾溶液,以便使被测氨基酸均带正电荷,以阳离子形式存在a

色谱分离柱的填料为低交换容量的表面离子交换树脂,最好选用苯乙烯_二乙烯基苯高分子聚合物并将交换容量控制在0.01～0.04mmo1/g。色谱分离柱的填料粒度一般为10～30μm,色谱分离柱的截面直径一般为3～6mm,柱长一般为40～200mm。

本发明具有以下有益效果:1、对多种常见氨基酸能进行良好的分离,变异系数为1～5％,检测限可达10-6g1mol,在10-3～10-5mol/l的浓度范围内,峰高对浓度呈良好的线性关系。

2、由于采用电导检测器进行检测,不需要对被测试样进行梯度洗脱,因而简化了工艺流程。

3、分析时,将试样直接注入色谱分离柱并经电导检测器检测就能获得谱图,去除了现有分析方法中的柱前或柱后衍生步骤,使工艺流程大为简化。

4、采用低压泵输送,所需配套分析仪器的成本大为降低,工艺简化,既节约了试剂又可缩短分析时问,因而分析成本低,便于普及推广。

附图说明

图1是根据本发明提供的方法获得的常见酸性、中性氨基酸色谱图；

图2是根据本发明提供的方法获得的常见碱性氨基酸色谱图；

图3是根据本发明提供的方法获得的所测氨基酸his、ala、phe、pro在10-3～10-4mo1/l的浓度范围内浓度与峰高的关系图；

图4是根据本发明提供的方法获得的所测氨基酸met、pro、glu在10-4～10-5mol/l的浓度范围内浓度与峰高的关系图。

具体实施方式

实施例1:

本实施例是对常见酸性、中性、碱性氨基酸进行分析,所用试样为已知浓度的氨基酸标样。

1)酸性、中性氨基酸的分析

使用的仪器:按本发明提供的方法设计的氨基酸分析仪,其工作压力为30～40psi。

洗脱液:1.0x10-3mol/l硝酸溶液,流速1.2mol/min。

色谱分高柱:填料为苯乙烯一二乙烯基苯高分子聚合物,交换容量0.02mmol/g,填料粒度25～301'm,柱截面直径5mm,柱长200mm。

分析步要:

a、基线测绘

操作氨基酸分析仪,将洗脱液输送入色谱分离柱使其达到平衡,从色谱分离柱输出的洗脱液流过电导流通池时由电导检测器转化为电信号,从而形成基线被测绘。

b、谱图测绘

将含有氨基酸的被测试样注入氨基酸分析仪的液体流路中,操作氨基酸分析仪,使洗脱液推动被测试样进入色谱分离柱产生离子交换,带正电荷的氨基酸置换下色谱分离柱上的氢离子并保留在色谱分离柱上；

将洗脱液连续输送入色谱分离柱不断将各种氨基酸在色谱分离柱上展开,各种氨基酸离子产生差速迁移而相互分离,在不同的保留时问被洗脱,从色谱分离柱输出的含氨基酸离子的溶液流过电导流通池时由电导检测器转化为电信号,从而形成谱图被测绘。所测绘的谱图见图1。

2)碱性氨基酸的分析

使用的仪器:按本发明提供的方法设计的氨基酸分析仪,其工作压力为30～40psl。

洗脱液:9.0x10-3mol/l柠様酸钾溶液,流速1.3m1/min。

色谱分离柱:填料为苯乙烯一二乙烯基苯高分子聚合物,交换容量0.02mmol/g,填料粒度20～25μm,柱截面直径5mm,柱长40mm。

分析步環与酸性、中性氨基酸的分析步環相同。所测绘的谱图见图2。

实施例2:

本实施例是对蛋白质水解注射液中的酸性、中性、碱性氨基酸进行分析。

1)酸性、中性氨基酸的分析

使用的仪器:按本发明提供的方法设计的氨基酸分析仪,其工作压力为30～40psi。

洗脱液:1.5x10-3mol/l硝酸溶液,流速l.2mol/min。

色谱分高柱:填料为苯乙烯一二乙烯基苯高分子聚合物,交换容量0.015mmol/g,填料粒度25～30l'm,柱截面直径6mm,柱长150mm。

分析步環与实施例1相同。

2)碱性氨基酸的分析

使用的仪器:按本发明提供的方法设计的氨基酸分析仪,其工作压力为30～40psi。

洗脱液:8.0x10-3mol/l柠様酸钾溶液,流速1.3m/min。

色谱分离柱:填料为苯乙烯一二乙烯基苯高分子聚合物,交换容量0.015mmol/g,填料粒度20～251'm,柱截面直径6mm,柱长50mm。

分析步骤与酸性、中性氨基酸的分析步環相同。

分析结果如下(mol/l):

asp7.29x10-4pro1.16x10-3ya9.75x10-4phe3.12x10-3

his2.20x10-3lys1.88x10-4arg8.06x10-4

实施例3:

本实施例是对氨基酸口服液中的酸性、中性、碱性氨基酸进行分析。

1)酸性、中性氨基酸的分析

使用的仪器:按本发明提供的方法设计的氨基酸分析仪,其工作压力为30～40psl。

洗脱液:0.8x10-3mo1/l硝酸溶液,流速1.2mol/min。

色谱分离柱:填料为苯乙烯一二乙烯基苯高分子聚合物,交换容量0.03mmol/g,填料粒度25～30l,m,柱截面直径5mm,柱长180mm。

分析步環与实施例1相同。

2)碱性氨基酸的分析

使用的仪器:按本发明提供的方法设计的氨基酸分析仪,其工作压力为30～40psi。

洗脱液:8.5x10-3mo1/l柠様酸钾溶液,流速l.3murnin。

色谱分离柱:填料为苯乙烯一二乙烯基苯高分子聚合物,交换容量0.03mmol/g,填料粒度20～25μm,柱截面直径5mm,柱长45mm。

分析步環与酸性、中性氨基酸的分析步骤相同。

分析结果如下(mol/l):

asp8.33x10-4glu5.48xl0-4ya5.00xl0-4met3.50x10-4

phe6.60xl0-3his3.48x10-3lys2.50x10-4arg7.64x10-4

上述实施例中所测的部分氨基酸的浓度与峰高的关系见图3、图4。