一种微量油茶种仁油脂含量和脂肪酸同时测定的方法与流程

本发明提供一种微量油茶种仁油脂含量和脂肪酸同时测定的方法。具体涉及一种微量油茶油脂快速提取，甲酯化后gc-ms内标法定量测定油脂含量和组成的测定方法。

背景技术：

油茶是我国特有的木本油料树种，广泛分布于我国南方14个省市区，对增加优质食用油供给，维护国家粮油和耕地安全，促进当地经济，帮助林农脱贫致富，改善生态环境具有重要意义，是经济效益、社会效益和生态效益兼备的经济林树种。茶油是油茶的最主要产品，品质优良，被联合国粮农组织作为健康型食用油进行重点推荐。

传统油茶种仁含油率测定主要采用索氏抽提法、核磁共振法、近红外光谱法。索氏抽提法测定结果精度高，但操作繁琐，耗时长，消耗大量试剂。为了保证取样的均一性，一般都是取较大量的油茶仁样品(>50g)进行粉碎，混匀后取5g进行索式抽提测定，提取温度一般为65℃，提取时间一般是6h。

核磁共振法要求样品含油率必须控制在2％以内，标样和被测样品必须在同一室温下进行测定；近红外光谱法可以同时检测油分、蛋白质和水分含量等多个指标，但核磁共振法和近红外光谱法都需要利用索氏抽提法测定标准样品的油分含量。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种微量油茶种仁油脂含量和脂肪酸同时测定的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述微量油茶种仁油脂含量和脂肪酸同时测定的方法是采用三元溶剂体系提取油茶种仁中的油脂成分，得到油脂样品，同时加入茶油中不含的脂肪酸为内标，所述内标物浓度为10g/l(用油脂的提取溶剂配制)，内标物与油茶种仁的体积质量比为(1.5—2.5)ml：1g，优选为2ml：1g，将油脂样品甲酯化后采用gc-ms内标法，以单个脂肪酸甲酯的浓度为横坐标，以各种脂肪酸甲酯与内标的峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立内标标准曲线，通过内标曲线将总脂肪酸的含量折算为油脂含量，从而确定油茶种仁中的油脂含量和脂肪酸组成。

其中，所述三元溶剂体系选自正己烷-正丁醇-水，二氯甲烷-乙醇-水，二氯甲烷-正定醇-水溶剂体系中的至少一种。

优选地，所述正己烷-正丁醇-水溶剂体系中正己烷、正丁醇和水的体积比为(3:6:1)—(6:3:1)；所述二氯甲烷-乙醇-水溶剂体系中二氯甲烷、乙醇和水的体积比为(3:6:1)—(6:3:1)；所述二氯甲烷-正定醇-水溶剂体系中二氯甲烷、正定醇和水的体积比为(3:6:1)—(6:3:1)。

优选地，提取油茶种仁中的油脂成分时提取时间为2—10min，提取温度为25—35℃。

优选地，所述内标物选自十一烷酸，十三烷酸、十五烷酸、十七烷酸、十九烷酸或二十一烷酸。

下面对本发明作进一步说明：

本发明包括以下步骤：

1)油茶种仁机械破壁。称取一定质量(10μg≤m≤200μg)干燥到恒重的油茶种仁于mm400冷冻混合球磨仪配套的钢管中，同时加入3颗钢珠，液氮冷却到-20℃后，用冷冻混合球磨仪在10000r/min的条件下震荡破碎2min；

2)油茶种仁中油脂快速提取。按照一定液料比(5:1～30:1)ml/g在钢管中分多次加入脂肪提取试剂盒，并将液体部分转移到脂肪提取装置中，同时加入0.2ml浓度为10g/l的内标物(用油脂的提取溶剂配制)，提取油脂，挥发溶剂，得到油脂样品；

3)油脂甲酯化。将油脂样品按照国标gb5009.168—2016对油脂进行甲酯化处理，得到的甲酯用于后续gc-ms分析；

4)油脂的gc-ms分析。将购自sigma的37种脂肪酸甲酯的混标标准品分别调配成浓度为0.05mg/l、0.10mg/l、0.20mg/l、0.50mg/l和1.00mg/l的5个梯度，加入十七碳酸甲酯的浓度为0.02mg/l，设置色谱条件如下：毛细管柱(1000m×0.25mm×0.25μm)hp-88，进样量1μl，分流比1:20，进样器温度：250℃，he流速：1ml/min，升温程序50℃保持1min，10℃/min升到170℃，再以3℃/min的升温速度升到230℃，保温23min。

数据分析。对脂肪酸甲酯混标进行采集，以单个脂肪酸甲酯的浓度为横坐标(x)，以各种脂肪酸甲酯与十七碳酸甲酯的峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归。在0.05-1.00mg/l范围内，以单个脂肪酸甲酯的浓度与其对应的峰面积与十七碳酸甲酯的峰面积的比值为横纵坐标作图，得到单个脂肪酸的含量，进而得到总的脂肪酸的含量。

本发明以不同油脂含量的油茶种仁为对象，以sigma公司生产的脂肪提取试剂盒为提取剂，以碳十七烷酸为内标物，快速提取油脂，并进行甲酯化，进而采用gc-ms内标法测定油茶种仁中油脂含量和脂肪酸组成。

本发明建立的微量油茶种仁油脂含量和脂肪酸组成测定方法操作简单，油脂提取不需要专业设备；测定结果精确度高，油脂含量与实际油脂含量线性相关系数r²达到0.9991，稳定(99.70≤回收率≤103.63)，且重复性良好(rsd<1.24％)。与传统的油脂含量分析方法相比，提取时间短(从6h减少到20min以内)，测定所需样品量更少(10μg～200μg)，更快速高效。可以实现油脂含量和组成的同步测定，尤其对于微量种仁中的油脂的提取具有优势明显，非常适合微量油茶种仁中油脂的精确提取和脂肪酸的准确测定。对研究单颗种仁生理生化指标，以及研究不同父母本控制授粉条件下的种仁含油率和脂肪酸组成，对品质育种和栽培时品种配置提供理论基础。

附图说明

图1为本发明实施的37中脂肪酸标准品的gc-ms谱图；

图2为碳十七烷酸甲酯的gc-ms谱图。

具体实施方式

1.系统适应性试验

以hp-88型色谱柱，长度为100m，载气流速1.0ml/min，进样量1.0μl，进样口250℃，分流/不分流进样。柱温程序升温程序50℃(1min)，以10℃/min升温到170℃，以3℃/min升温到220℃(23min)。各组分分离度不低于3，信噪比s/n大于10。在该相同条件下各成分分离良好，灵敏度高，检测线为3ng。

2.线性

将购自sigma的37种脂肪酸甲酯的混标标准品分别调配成浓度为0.05mg/l，0.10mg/l，0.20mg/l，0.50mg/l和1.00mg/l的几个梯度，加入十七碳酸的浓度为0.02mg/l，在以下色谱条件下：毛细管柱(1000m×0.25mm×0.25μm)hp-88，进样量1μl，分流比1:20，进样器温度：250℃，he流速：1ml/min，升温程序50℃保持1min，10℃/min升到170℃，再以3℃/min的升温速度升到230℃，保温23min。对脂肪酸甲酯混标进行采集，以单个脂肪酸甲酯的浓度为横坐标(x)，以各种脂肪酸甲酯与十七碳酸甲酯的峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归。结果表明在0.05-1.00mg/l范围内，单个脂肪酸甲酯的浓度与其对应的峰面积与十七碳酸甲酯的峰面积的比值呈良好的线性关系。

表1脂肪酸甲酯标准曲线与相关系数

3.重复性试验

取油茶种子6份，每份0.1g，精确量取，分别以2ml脂肪提取液对其进行提取，同时加入用脂肪提取试剂配制的浓度为10g/l的十七烷酸0.2ml内标震荡提取3次，合并滤液在60℃下皂化10min，100℃下甲酯化3min，趁热用n2吹干，正己烷定容至5ml。各取1μl注入气相色谱仪进行测定，记录血液脂肪酸与c17:0甲酯的峰面积的比值，即：

表2茶油提取重复性

4.回收率实验

取油茶种子6份，每份0.1g，精确量取，分别以2ml脂肪提取液对其进行提取，同时加入浓度为10g/l的碳十七烷酸0.2ml内标震荡提取3次，分别加入1000μg，1500μg，2000μg，2500μg，3000μg，5000μg的碳十七酸三甘酯，合并滤液在60℃下皂化10min，100℃下甲酯化3min，趁热用n2吹干，正己烷定容至5ml。各取1μl注入气相色谱仪进行分析，记录c17:0的峰面积，即：

表3茶油提取回收率

5.稳定性试验

取油茶种子6份，每份0.1g，精确量取，分别以2ml脂肪提取液对其进行提取，同时加入浓度为10g/l的碳十七烷酸0.2ml内标震荡提取3次，合并滤液在60℃下皂化10min，100℃下甲酯化3min，趁热用n2吹干，正己烷定容至5ml。合并正己烷，取2ml分别于0，60，120，180，240，300min进样分析，各取1μl注入气相色谱仪进行分析，记录各脂肪酸甲酯峰面积的总和，测定脂肪酸甲酯在溶剂中的稳定性，即：

表4茶油提取稳定性

6.样品加入量

取油茶种子8份，每份依次为0.2000g，0.1000g，0.0750g，0.0500g，0.0250g，0.0100g，0.0075g，0.0050g精确量取，分别以2ml脂肪提取液对其进行提取，同时加入浓度为10g/l的碳十七烷酸0.2ml内标震荡提取3次，同时加入内标震荡提取3次，合并滤液在60℃下皂化10min，100℃下甲酯化3min，趁热用n2吹干，正己烷定容至5ml。用气相色谱仪进样分析。

表5种仁加入量的影响

7.样品测定

取油茶种子6份，每份0.1g，精确量取，分别以2ml脂肪提取液对其进行提取，同时加入浓度为10g/l的碳十七烷酸0.2ml内标震荡提取3次，同时加入内标震荡提取3次，合并滤液在60℃下皂化10min，100℃下甲酯化3min，趁热用n2吹干，正己烷定容至5ml。用气相色谱仪进样分析。

表6不同来源油茶样品验证