一种鲜霍山米斛中特征生物碱组成的分析方法与流程

本发明涉及中药材组份分析
技术领域：
，尤其涉及一种鲜霍山米斛中特征生物碱组成的分析方法。
背景技术：
：石斛具有益胃生津，滋阴清热等功效，《中国药典》2010版、2015版均有所收载。现代药理学研究表明，石斛具有增强免疫、抗疲劳、抗氧化、预防辐射型损伤等多种作用，其主要活性成分为多糖、生物碱及挥发性成分等。石斛自古以来，讲究“鲜品为上”，著名方剂如“三鲜汤”、“叶氏养胃汤”等，均以鲜石斛入方。近代鲜药研究专家郝近大教授也发现：鲜干石斛的主要活性成分含量存在明显差别，如：还原糖含量鲜品(16.20％)＞干品(5.129％)；总生物碱含量鲜品(1.226％)＞干品(0.65％)，这也从物质基础方面证实鲜石斛的药用物质普遍高于干石斛2-3倍。近年来，随着人工培植石斛技术日臻完善与成熟，石斛鲜品供应和销售规模扩大，除供中医临床使用外，自制鲜汁也备受消费者青睐。霍山石斛(学名：dendrobiumhuoshanense)主产于大别山区的安徽省霍山县，是药用石斛中的极品。霍山石斛中最名贵的就是霍山米斛，其生长周期长，对生长环境要求苛刻，被国家列为二级濒危保护植物，也是国家地理标志保护品种，加之加工工艺复杂、生长过程缓慢，所以价格也是最贵的。2013年霍山当地物价部门规定霍山所产三种石斛的指导价格：霍山米斛480元/克，霍山铁皮石斛68元/克，霍山铜皮石斛45元/克。截至2018年3月，霍山米斛特级品龙头凤尾的零售价格仍然在200-300元/克。鉴于霍山米斛价格普遍高于铁皮或铜皮石斛7-11倍，对霍山米斛中药用物质组成解析对于阐述种属特异性及其组效关系具有重大意义。对不同种属石斛的指纹图谱研究主要集中在液相特征图谱和红外光谱，如：魏刚等比较鲜铁皮石斛茎、叶不同部位高效液相色谱(hplc)特征图谱的差异，分别标示出33、17个特征共有峰，同批次茎、叶有类似成分，且有较高相似度；(鲜铁皮石斛茎、叶高效液相色谱特征图谱比较[j].广州中医药大学学报,2012，29(5)：561-565.)；并从霍山米斛hplc特征图谱中标示出24个黄酮类特征共有峰，10批样品的相似度较高(0.918-0.990)(霍山石斛hplc特征图谱研究[j].中成药，2014，36(12)：2642-2644.)；孟海涛建立了霍山产霍山石斛、铁皮石斛、铜皮石斛的hplc指纹图谱体系，指认了三种石斛的柚皮素、毛兰素和总酚含量在1-12月份及茎、叶、花之间的变化情况(安徽霍山产三种石斛hplc化学指纹研究[d].合肥工业大学，2015.)；刘文杰对霍山石斛和铁皮石斛的红外光谱解析发现：两者指纹特征区主要在1000-700cm-1具有显著差别(铁皮石斛的红外光谱定性定量研究[d].北京中医药大学，2014.)。对于不同石斛属的理化鉴别主要集中在对其多糖和生物碱定性/定量鉴别，如：李秀芳对五种石斛粗多糖gc分析，其中霍山石斛粗多糖的单糖成分及其摩尔比为ara：glu：gal＝11：176：137；铁皮石斛多糖的单糖成分及其摩尔比为ara：man：glu：gal＝22：29：272：174(霍山石斛和四种药典石斛多糖降血糖活性比较研究[d].合肥工业大学，2012.)；陈乃富等采用hpsec法及柱前衍生化hplc法测定霍山石斛、细茎石斛和铁皮石斛多糖分子量呈连续分布状态，其多糖水解产物中检出葡萄糖(glc)、甘露糖(man)、半乳糖(gal)等共7种单糖，且都以甘露糖和葡萄糖为主要单糖组分，但铁皮石斛中的甘露糖和葡萄糖的相对峰面积比值最大(安徽霍山产3种石斛多糖组成的比较研究[j].中药材，2017(6)：1300-1304.)。对于石斛生物碱的研究，陈乃东等在霍山石斛组培植株、野生植株分别检出2个和4个生物碱显色斑，且其总生物碱含量测定结果分别为(0.29±0.11)‰、(0.43±0.15)‰(不同种源霍山石斛生物碱比较研究[j].中药材，2014，37(6)：953-956.)。目前对不同种属石斛中多糖含量、结构组成及活性差异等研究相对深入，而对石斛生物碱的研究多集中在总生物碱含量差异方面，对其生物碱组成研究仍停留在以金钗石斛为主，如：nie等采用95％乙醇提取金钗石斛生物碱，以lc-ms/ms分析其包含92.6％石斛碱，3.3％石斛碱-氮氧化物，2.0％石斛次碱，0.9％石斛星，0.32％6-羟基石斛碱以及0.07％13-羟基-14-氧杂石斛碱(dendrobiumalkaloidspreventaβ25–35-inducedneuronalandsynapticlossviapromotingneurotrophicfactorsexpressioninmice[j].peerj，2016，4(5594)：e2739.)；wang等以70％甲醇提取金钗石斛生物碱，采用lc-qtof检测到其含有石斛碱、石斛次碱等9种生物碱(tandemmassspectrometryforstructuralidentificationofsesquiterpenealkaloidsfromthestemsofdendrobiumnobileusinglc-qtof.[j].plantamedica，2016，82(07)：662-670.)，但在其它市售金钗石斛以及云南其他品种的流苏石斛、齿瓣石斛及铁皮石斛中则检测不到这9种生物碱。此外，对其它种属石斛生物碱组成方面的报道，如：专利申请号“201310526400.1”，名称为“一种石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱构建方法及应用”通过恒温水浴回流萃取，利用氨水浸渍-氯仿萃取的粗品用于高效液相检测，得到三种霍山石斛组培苗的生物碱指纹图谱，但未能得出特征峰所对应的成分；申请号“201611221950.2”，名称为“基于uplc_ltq-orbitrap+velos+ms检测石斛生物碱成分的方法”，通过纯甲醇提取，依次通过酸水-碱化-二氯甲烷萃取处理，将分离的生物碱利用uplc/ltq-orbitrapvelosms技术鉴定铁皮石斛中含有裘波树碱、颠茄次碱等22种生物碱。综上所述，金钗石斛中生物碱组成以石斛碱占绝对优势(92.6％)；铁皮石斛中生物碱则以裘波树碱、颠茄次碱等22种新物质为主，与金钗石斛中生物碱组成差异较大。上述报道的提取、分离及检测方法对于解析同种属的金钗石斛或铁皮石斛生物碱组成有借鉴或帮助，对于霍山米斛中特征生物碱组成研究并不适用或借鉴意义非常有限。因此，有必要开发一种适合鲜霍山米斛中生物碱提取、分离及其物质组成的分析方法，以此解析米斛中含有哪些特定生物碱，这将对霍山米斛道地性、种属特异性提供科学依据，同时为后续深入的组效关系研究奠定理论基础。技术实现要素：本发明目的在于提供一种鲜霍山米斛中生物碱组成分析方法，本方法既保证霍山米斛中总生物碱有效提取，又突出了生物碱组成分析的全面性、特征性和重复性。本发明是通过以下技术方案实现的：一种鲜霍山米斛中特征生物碱组成的分析方法，包括以下步骤：(1)将霍山米斛鲜条洗净并沥去表面水分，切成长度1cm米斛段，置于真空冷冻干燥机中进行冻干处理，冻干后粉碎至90-110目；(2)将冻干米斛粉，加入20-40倍质量提取溶剂，75-85℃加热提取3-5次，合并提取液，减压浓缩至原体积1/3-1/5，得到米斛粗提液；(3)将上述粗提液加盐酸调ph为0.5-4，二氯甲烷提取2-3次脱脂，脱脂后提取液加氨水调ph9-10，氯仿反复萃取3-5次，合并氯仿提取液，经水洗、减压浓缩后得霍山米斛生物碱粗提物，分别进行液相色谱、气质联用、液质联用初步分析生物碱组成；(4)将步骤(3)所得霍山米斛生物碱粗提物，2％h3po4溶液溶解、过滤上样，过pcx固相萃取柱，依次以甲醇/乙腈溶液及不同浓度的含碱溶液洗脱，分别收集洗脱液，经脱盐处理，浓缩干燥得到霍山米斛特征生物碱组分，再次进行液质联用分析确认。进一步的，所述步骤(2)中提取溶剂可选择ph为3的70％乙醇溶液、氨水-氯仿以及95％乙醇。优选的，所述步骤(2)中提取溶剂为ph为3的70％乙醇溶液。优选的，所述步骤(3)中粗提液加盐酸调ph为1-2。所述步骤(3)中氯仿提取液合并后水洗至中性。进一步的，所述步骤(4)中洗脱液选择1：1甲醇/乙腈溶液或2-7％nh3·h2o的1：1甲醇/乙腈溶液。优选的，所述步骤(4)中洗脱液选择5-7％nh3·h2o的1：1甲醇/乙腈溶液。本发明的优点是：1、与金钗石斛或铁皮生物碱提取常用的氨水浸润-氯仿或95％乙醇等提取方法相比，本发明采用70％乙醇(ph3)提取的总生物碱含量较氨水浸润-氯仿法普遍提高4-6.5倍，比95％乙醇提取法也提高1.5倍左右。利用此溶剂提取米斛生物碱，从而保证了米斛中总生物碱的有效提取。2、与目前金钗或铁皮石斛生物碱组成分析的液质联用技术相比，本发明在粗提物分析一步组合采用液相色谱、气质联用及液质联用技术，这保证了米斛生物碱组成分析的全面性和互补性。本发明中采用液相色谱对霍山米斛、霍山铁皮石斛及贵州金钗石斛的生物碱特征指纹图谱进行全面分析，总体明确了三个种属生物碱在物质组成上的显著差异；采用气质联用分析初步明确特征生物碱分子量组成；最后又借助液质连用分析生物碱组成，这又与气质联用分析结果互相佐证或补充。3、与分离生物碱常用的阳离子交换树脂相比，本发明所得米斛生物碱粗提物采用pcx固相萃取柱分离，既保证了含量甚微的特征生物碱的分离损失，同时又使米斛生物碱组分得以净化，提高液质联用分析结果的准确性。另外，净化后组分液质分析结果可与粗提物中的推测结果互相印证，从而也验证了该方法的重复性或重现性。附图说明图1所示为米斛在酸性乙醇中提取的总生物碱与(霍山)铁皮石斛、(贵州)金钗石斛总生物碱hplc指纹叠加图谱。图2所示为米斛生物碱粗提物在气质联用分析图谱。图3所示为米斛生物碱粗提物的液质联用分析图谱。图4所示为米斛特征性生物碱中未知结构物质的提取离子流及质谱分析图，其中，a、b、c三幅图为正离子模式下分子离子峰为274.2740的物质提取离子流图、一级质谱图及二级质谱图；d、e、f三幅图为正离子模式下分子离子峰为256.2414的物质提取离子流图、一级质谱图及二级质谱图；h、i、j三幅图为正离子模式下分子离子峰为246.2418的物质提取离子流图、一级质谱图及二级质谱图。具体实施方式下面通过实施例详细说明本发明实施例1霍山米斛粗提液制备霍山石斛鲜条300g，剪成1cm小段，冷冻干燥、粉碎得冻干粉50g。称取2g霍山米斛冻干粉，以1：25料液比加入提取溶剂，溶剂分别为70％乙醇(ph3)或95％乙醇或氯仿(氨水浸润后)，80℃提取三次，每次2小时，合并提取液减压浓缩至30ml左右，得霍山米斛粗提液。粗提液中总生物碱含量测定采用溴甲酚绿酸性染料-紫外可见分光光度法进行。总生物碱含量以1g冻干粉中溶出总生物碱的毫克数计算，以(‰)表示，结果见表1所示。表1.不同提取溶剂中米斛总生物碱含量比较提取溶剂总生物碱含量(‰)氨水浸润-氯仿提取0.0695％乙醇0.2670％乙醇(ph3)0.37从表1中可以看出，霍山米斛中总生物碱提取以70％乙醇或95％乙醇提取的总生物碱含量相对较高，普遍高于氨水-氯仿提取所得4-6.5倍，故本发明中霍山米斛总生物碱提取溶剂优选70％乙醇(ph3)。实施例2霍山米斛生物碱粗品制备及组成分析实施例1中的霍山米斛粗提液减压浓缩，加2％hcl水溶液调ph2，以二氯甲烷萃取三次(与酸水层同体积)去脂；其后水层加氨水调节至ph10，以三氯甲烷萃取三次(与碱水层同体积)，合并三氯甲烷，水洗至中性；减压浓缩得到霍山米斛生物碱粗提物，以甲醇溶解后，分别进行hplc检测(附图1)、气质联用(附图2)及液质联用分析(附图3)。agilent1260hplc分析条件为：流动相：乙腈-0.1％三乙胺溶液＝50：50(v/v)；色谱柱：sgeprotecolc18(5μm，4.6×250mm)；检测波长：215nm；流速：1.0ml/min；柱温箱：25℃；进样量：20μl。从图1可以看出，霍山米斛生物碱组成与铁皮石斛或金钗石斛差异显著。bruker/scionsq气质分析条件为：db-5毛细管柱，程序升温：初始温度为80℃，以每分钟10℃：的速率升温至250℃，保持13分钟；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，分流比：1：10。从图2可以看出，霍山米斛生物碱在14-26min附近有明显色谱峰，通过质谱推测其特征峰分子量为263.1885(c15h20no3)、249.35(c15h23no2)、255.2562(c16h34no)及309.1941(c17h27no4)。agilentlc-qtof6450液质分析条件为：色谱柱：acquityuplc@behc18column(2.1mm×50mm，1.7μm)流动相：甲醇(a)-0.1％磷酸水溶液(b)；梯度洗脱，0～4min，5％～13％b；4～5min，13％～20％b；5～6min，20％～35％b,6～9min，35％～100％b；9.1～14min，5％b；质谱离子源为电喷雾离子源，正离子模式检测，喷雾电压3.8kv，离子传输毛细管温度350℃，源加热温度350℃。母离子扫描范围：50-1000m/z.从图3可以看出，霍山米斛生物碱在1-10min附近有明显色谱峰，结合质谱(正离子模式)推测其含有物质如下：310.4136(c17h28no4+)、324.4405(c18h30no4+)、294.3709(c16h24no4+)、278.3715(c16h24no3+)、264.3446(c15h22no3+)、296.3867(c16h26no4+)、274.2740(c16h36no2+)、256.2414(c16h34no+)。实施例3米斛生物碱粗提物在固相萃取柱分离及组成分析plexapcx(60mg/3cc)固相萃取柱经5ml甲醇活化、5ml纯水平衡后，2％h3po4溶液溶解霍山米斛生物碱粗品，样品经0.45μm水系滤膜过滤后上样，先用2％甲酸水溶液淋洗，此后分别以1：1甲醇/乙腈溶液洗脱及含3％、5％、7％nh3·h2o的1：1甲醇/乙腈溶液分别洗脱8-10ml(其中，对1：1甲醇/乙腈洗脱液进行液质分析发现没有任何物质)，含氨水的洗脱液分别浓缩脱盐处理得到生物碱组分i、ii、iii，再次进行液质联用分析，分析结果列于表2中，部分未确定结构的物质，如：274.2740、256.2414及246.2418均有133.1碎片，此为倍半萜类生物碱的典型片段，其提取离子流图列于附图4中。从图4可以看出，这些分子离子峰(正离子模式)为274.2740、256.2414及246.2418的物质均有133.1碎片，初步推测其为倍半萜类生物碱。表2组分i、ii、iii中生物碱组成分析当前第1页12