一种阿托伐他汀钙中杂质的分离和/或检测方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种阿托伐他汀钙对映异构体和阿托伐他汀钙内酯(杂质h)的分离或检测方法。

背景技术：

阿托伐他汀钙是第三代他汀类调血脂药，是hmg-coa还原酶的选择性、竞争性抑制剂，通过抑制肝脏内hmg-coa还原酶(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶a还原酶)和胆固醇的合成，从而降低血浆中胆固醇和脂蛋白水平，并通过增加细胞表面的肝脏ldl受体，以增强ldl的摄取和代谢。

阿托伐他汀钙是临床中广泛应用的一种降血脂药物，它可以通过抑制hmg-coa还原酶，从而抑制体内低密度脂蛋白和胆固醇的合成，达到降血脂的目的。阿托伐他汀钙分子结构中有两个手性中心，因此有两对光学异构体。药物活性成分中的杂质、特别是光学异构体杂质常对药物的质量和安全性造成影响，因此，必须加以控制和研究。阿托伐他汀的光学异构体既可用于质量研究，也是阿托伐他汀钙生产中日常用到的指控对照品。在质控中，一般只需要合成阿托伐他汀钙的对映异构体和任何一种形式的非对映异构体。

阿托伐他汀钙中容易含有阿托伐他汀内酯(杂质h)，药品中含有上述杂质易对药物的质量和安全性带来不利影响，可能引起不良反应，该分析方法提高了对杂质的检出和识别能力，提高了质量控制水平，从而更有效的保证产品的安全性。现有技术中已经报道了几种阿托伐他汀钙有关物质的测定方法，如专利201110197172.9阿托伐他汀钙胶囊有关物质的检测方法，专利201310239929.5阿托伐他汀钙制剂溶出度的测定方法，专利200910087797.2一种用高效液相色谱法测定阿托伐他汀钙有关物质的方法，专利201510178001.x公开了一种如何测定阿托伐他汀钙中杂质e的方法。在现有技术中均没有涉及到阿托伐他汀钙中阿托伐他汀钙对映异构体和杂质h的分离和检测方法，在参考质量标准：usp40atorvastatincalcium(p2898)和阿托伐他汀进口注册标准(jx20120157)中，采用高效液相色谱进行分离，流动相均为正己烷-无水乙醇-酸性化合物，按一定比例混合，制得，按照上述标准中的方法，阿托伐他汀钙中杂质h与对映异构体不能有效分离，检测结果的准确性不能得到保证。

技术实现要素：

发明要解决的问题

本发明的目的是提供一种可以将阿托伐他汀钙对映异构体和阿托伐他汀钙内酯(杂质h)有效分离和/或检测的方法。

用于解决问题的方案

本发明提供一种阿托伐他汀钙片中杂质的分离和/或检测方法，所述杂质为阿托伐他汀钙对映异构体和/或阿托伐他汀钙内酯，所述方法采用高效液相色谱进行分离或检测，其特征在于：高效液相色谱的流动相为正己烷-c1-c6的一元醇-有机酸-有机碱，所述正己烷-醇-有机酸-有机碱的体积比为85～98:2～15:0.05～0.5:0.05～0.5。

进一步的，所述c1-c6的一元醇为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或多种。

进一步的，所述的有机酸为c1-c6羧酸或者卤代c1-c6羧酸，优选的，为甲酸、乙酸、丙酸或卤代乙酸或丙酸中的一种或多种，所述卤代为氟代、氯代或溴代，更优选的，所述的有机酸为甲酸或乙酸中的一种或其混合物。

进一步的，所述的有机碱为式ⅰ所示结构：

其中，r1、r2以及r3分别独立地选自氢或碳原子数1～12的链式烃基，且r1、r2以及r3至少一个不为氢，优选为r1、r2以及r3分别独立地选自氢或碳原子数1～3的链式烃基，且r1、r2以及r3至少两个不为氢，更优选为二乙胺或三乙胺。

进一步的，所述正己烷-有机醇-有机酸-有机碱的体积比为90～95:4～12:0.1～0.3:0.1～0.3，优选为90～95:5～10:0.1～0.2:0.1～0.2。

进一步的，所述阿托伐他汀钙以原料药、固体制剂、半固体制剂或液体制剂形式存在。优选所述固体制剂包括片剂、胶囊剂、栓剂、颗粒剂、膜剂、糊剂或丸剂，所述半固体制剂包括凝胶剂和软膏剂，所述液体制剂包括注射剂、合剂和溶液剂。

进一步的，所述的色谱条件为：色谱柱为多糖衍生物类手性色谱柱，检测波长为240-250nm，优选为244nm，色谱柱温为30-40℃，优选为35℃，流速为0.5-2ml/min，优选为1ml/min。

进一步的，将所述阿托伐他汀钙配制成待处理溶液，所述配制方法为：将阿托伐他汀钙加入到有机溶剂中，然后加有机溶剂定容，过滤，得到待处理溶液。

进一步的，所述有机溶剂为c1-c6的一元醇与正己烷的混合物，优选为体积比为1:1-2:1-3的甲醇-乙醇-正己烷的混合溶剂，加溶剂定容后阿托伐他汀钙浓度为0.5-2mg/ml。

发明的效果

本发明采用多糖衍生物类手性色谱柱，在本发明的色谱条件下，阿托伐他汀钙、阿托伐他汀钙对映异构体和阿托伐他汀钙杂质h三者能够实现有效的分离，拥有很好的分离效果；同时本发明的方法可以用于阿托伐他汀钙对映异构体和杂质h的检测，能够有效提高阿托伐他汀钙的药品质量和安全性。

附图说明

图1是阿托伐他汀钙杂质h的色谱图；

图2是阿托伐他汀钙对映异构体的色谱图；

图3是实施例1系统适用性溶液的色谱图；

图4是实施例2阿托伐他汀钙空白辅料溶液的色谱图；

图5是实施例2阿托伐他汀钙供试品溶液的色谱图；

图6是实施例2系统适用性溶液的色谱图；

图7是实施例3系统适用性溶液的色谱图；

图8是实施例4系统适用性溶液的色谱图；

图9是实施例5系统适用性溶液的色谱图；

图10是实施例6系统适用性溶液的色谱图；

图11是实施例7系统适用性溶液的色谱图；

图12是实施例8系统适用性溶液的色谱图；

图13是实施例9系统适用性溶液的色谱图。

具体实施方式

首先，本发明提供了一种阿托伐他汀钙片中杂质的分离和/或检测方法，所述杂质为阿托伐他汀钙对映异构体和/或阿托伐他汀钙内酯，所述方法采用高效液相色谱进行分离或检测，其特征在于：高效液相色谱的流动相为正己烷-c1-c6的一元醇-有机酸-有机碱，所述正己烷-c1-c6的一元醇-有机酸-有机碱的体积比为85～98:2～15:0.05～0.5:0.05～0.5。

在本发明的上下文中，术语“阿托伐他汀钙”的分子式为c66h68caf2n4o10，英文名为atorvastatincalcium，cas号为134523-03-8。

在本发明的上下文中，术语“分离和/或检测方法”，包括分离方法，检测方法以及分离和检测方法。

在本发明的上下文中，术语“阿托伐他汀钙内酯”为阿托伐他汀钙中的杂质h，是阿托伐他汀钙降解的杂质。

在本发明的上下文中，术语“流动相”，是指色谱过程中携带待测组分向前移动的物质。

在本发明的上下文中，术语“c1-c6的一元醇”，是指具有1-6个碳原子的一元醇，优选为甲醇、乙醇或丙醇，所述的c1-c6的一元醇可以是单一的醇，也可以是多种不同的有机醇的混合物，可以是含水的醇，也可以是无水的醇，优选是无水的醇。

在一项优选的实施方案中，所述的有机酸为甲酸、乙酸、丙酸或卤代乙酸或丙酸中的一种或多种，所述卤代为氟代、氯代或溴代，优选的，所述的有机酸为甲酸或乙酸中的一种或其混合物。

在一项优选的实施方案中，所述阿托伐他汀钙以原料药、固体制剂、半固体制剂或液体制剂形式存在。优选所述固体制剂包括片剂、胶囊剂、栓剂、颗粒剂、膜剂、糊剂或丸剂，所述半固体制剂包括凝胶剂和软膏剂，所述液体制剂包括注射剂、合剂和溶液剂。

在一项优选的实施方案中，所述的有机碱为

所述的有机碱为式ⅰ所示结构：

其中，r1、r2以及r3分别独立地选自氢或碳原子数1～12的链式烃基，且r1、r2以及r3至少一个不为氢，优选为r1、r2以及r3分别独立地选自氢或碳原子数1～3的链式烃基，且r1、r2以及r3至少两个不为氢，更优选为二乙胺或三乙胺。

在一项优选的实施方案中，所述正己烷-有机醇-有机酸-有机碱的体积比为90～95:4～12:0.1～0.3:0.1～0.3，优选为90～95:5～10:0.1～0.2:0.1～0.2。

在一项优选的实施方案中，所述的色谱条件为：色谱柱为多糖衍生物类手性色谱柱，检测波长为244nm，色谱柱温为30-40℃，优选为35℃，流速为0.5-2ml/min，优选为1ml/min。

在本发明的上下文中，术语“多糖衍生物类手性色谱柱”，是以多糖及其衍生物作为担体的能够分离手性化合物的液相色谱柱，主要包括纤维素类和淀粉类，其中纤维类包括chiralcelod、chiralceloj，淀粉类包括chiralpakad、chiralpakas。

在一项优选的实施方案中，将所述阿托伐他汀钙配制成待处理溶液，所述配制方法为：将阿托伐他汀钙加入到有机溶剂中，然后加有机溶剂定容，过滤，得到待处理溶液。

在一项更优选的实施方案中，所述有机溶剂为甲醇-乙醇-正己烷的混合溶剂，优选为体积比为1:1-2:1-3的甲醇-乙醇-正己烷的混合溶剂，加溶剂定容后阿托伐他汀钙浓度为0.5-2mg/ml，优选为1mg/ml。

本发明还提供了一种阿托伐他汀钙片中阿托伐他汀钙对映异构体的高效液相色谱检测方法，其色谱条件为：

色谱柱：多糖衍生物类手性色谱柱

流动相：正己烷-甲醇-无水乙醇-乙酸-三乙胺(95：1.5：3.5：0.1：0.1)；

检测波长：244nm；

柱温：35℃

流速：1.0ml/min

供试样品溶液配制

(1)供试品溶液制备

将阿托伐他汀钙片研细后的细粉加入占供试样品溶液总体积50％的溶剂中，充分振摇使阿托伐他汀溶解，加溶剂定容，使得阿托伐他汀钙浓度为1mg/ml，滤过，其中溶剂为甲醇-无水乙醇-正己烷(1∶1∶3)；

(2)自身对照溶液制备

精密量取上述供试样品溶液，用溶剂稀释500倍，滤过，其中溶剂为甲醇-无水乙醇-正己烷(1∶1∶3)；

(3)空白溶液制备

取甲醇-无水乙醇-正己烷(1∶1∶3)，备用；

检测：取空白溶剂、系统适用性溶液和供试样品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，按所述的色谱条件测定，记录色谱图，完成手性异构体的测定。

下面通过具体实施例对本发明的发明内容做进一步的详细说明，但并不因此限定本发明的发明内容。

实施例1

检测仪器与色谱条件

检测仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为多糖衍生物类手性色谱柱，色谱柱柱温为35℃，采用紫外检测器，检测波长设置为244nm；流动相流速为1ml/min；以体积比为850∶150∶1的正己烷-无水乙醇-三氟乙酸为流动相等度洗脱。

配制阿托伐他汀钙杂质h定位溶液：称取阿托伐他汀钙杂质h适量，加溶剂溶解并稀释至刻度，使得阿托伐他汀钙杂质h浓度为0.002mg/ml，滤过，其中溶剂为体积比为1∶1∶3的甲醇-无水乙醇-正己烷；

配制阿托伐他汀钙对映异构体定位溶液：称取阿托伐他汀钙对映异构体适量，加溶剂溶解并稀释至刻度，使得阿托伐他汀钙对映异构体浓度为0.002mg/ml，滤过，其中溶剂为体积比为1∶1∶3的甲醇-无水乙醇-正己烷；

系统适用性溶液的制备：将质量比为500:1:1的阿托伐他汀钙对照品、阿托伐他汀钙对映异构体对照品、阿托伐他汀钙杂质h对照品加入占系统适用性试验溶液总体积50％的溶剂中，充分振摇使溶解，加溶剂稀释至刻度，使得阿托伐他汀钙浓度为1.0mg/ml，阿托伐他汀钙对映异构体浓度为0.002mg/ml，阿托伐他汀钙杂质h浓度为0.002mg/ml，滤过，其中溶剂为体积比为1∶1∶3的甲醇-无水乙醇-正己烷；

测定方法：量取阿托伐他汀钙杂质h定位溶液、阿托伐他汀钙对映异构体定位溶液、系统适用性溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，完成测定；所得色谱图如图1～3所示。

结果显示：阿托伐他汀钙对映异构体与托伐他汀钙杂质h保留时间基本一致，系统适用性中重叠成一个峰，杂质h干扰对映异构体检测，参考方法存在严重缺陷。

表1

实施例2

检测仪器与色谱条件

检测仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为多糖衍生物类手性色谱柱，色谱柱柱温为35℃，采用紫外检测器，检测波长设置为244nm；流动相流速为1ml/min；以体积比为95：2：3：0.2：0.2的正己烷-甲醇-无水乙醇-甲酸-二乙胺为流动相等度洗脱。

空白辅料溶液：将阿托伐他汀钙空白辅料加入占供试样品溶液总体积50％的溶剂中，充分振摇使阿托伐他汀溶解，加溶剂定容，使得空白辅料浓度相当于阿托伐他汀钙1mg/ml，滤过，其中溶剂为体积比为1∶1∶3的甲醇-无水乙醇-正己烷。

供试品溶液：将阿托伐他汀钙加入占供试样品溶液总体积50％的溶剂中，充分振摇使阿托伐他汀溶解，加溶剂定容，使得阿托伐他汀钙浓度为1mg/ml，滤过，其中溶剂为体积比为1∶1∶3的甲醇-无水乙醇-正己烷。

系统适用性溶液的制备：将质量比为500:1:1的阿托伐他汀钙对照品、阿托伐他汀钙对映异构体对照品、阿托伐他汀钙杂质h对照品加入占系统适用性试验溶液总体积50％的溶剂中，充分振摇使溶解，加溶剂稀释至刻度，使得阿托伐他汀钙浓度为1.0mg/ml，阿托伐他汀钙对映异构体浓度为0.002mg/ml，阿托伐他汀钙杂质h浓度为0.002mg/ml，滤过，其中溶剂为体积比为1∶1∶3的甲醇-无水乙醇-正己烷；

测定方法：量取空白辅料、供试品溶液、系统适用性溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，完成测定；所得色谱图如图4～6所示。

结果显示：阿托伐他汀钙对映异构体、托伐他汀钙杂质h和阿托伐他汀钙依次流出，分离度良好，空白辅料、其他杂质不干扰对映异构体检测，从供试品溶液的色谱图中可以准确的看出溶液中含有托伐他汀钙杂质h，结果准确。

实施例3

检测仪器与色谱条件

检测仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为多糖衍生物类手性色谱柱，色谱柱柱温为35℃，采用紫外检测器，检测波长设置为244nm；流动相流速为1ml/min；以体积比为95：2：3：0.1：0.1的正己烷-甲醇-无水乙醇：三氟乙酸：三乙胺为流动相等度洗脱。

本实施例中系统适用性溶液的制备同实施例1。

取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，按所述的色谱条件测定，记录色谱图，完成测定；所得色谱图如图7所示。

结果显示：阿托伐他汀钙对映异构体、托伐他汀钙杂质h和阿托伐他汀钙依次流出，分离度良好，阿托伐他汀钙对映异构体峰型略差，其他杂质不干扰对映异构体检测，结果准确。

实施例4

检测仪器与色谱条件

检测仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为多糖衍生物类手性色谱柱，色谱柱柱温为35℃，采用紫外检测器，检测波长设置为244nm；流动相流速为1ml/min；以体积比为95：2：3：0.1：0.1的正己烷-甲醇-无水乙醇-乙酸-三乙胺为流动相等度洗脱。

本实施例中系统适用性溶液的制备同实施例1。

取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，按所述的色谱条件测定，记录色谱图，完成测定；所得色谱图如图8所示。

结果显示，阿托伐他汀钙对映异构体、托伐他汀钙杂质h和阿托伐他汀钙分离度良好，达到了基线分离，其他杂质不干扰对映异构体检测，结果准确。

实施例5

检测仪器与色谱条件

检测仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为多糖衍生物类手性色谱柱，色谱柱柱温为35℃，采用紫外检测器，检测波长设置为244nm；流动相流速为1ml/min；以体积比为96：1.5：2.5：0.1：0.1的正己烷-甲醇-无水乙醇-乙酸-三乙胺为流动相等度洗脱。

本实施例中系统适用性溶液的制备同实施例1。

取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，按所述的色谱条件测定，记录色谱图，完成测定；所得色谱图如图9所示。

结果显示，阿托伐他汀钙对映异构体、托伐他汀钙杂质h和阿托伐他汀钙分离度良好，达到了基线分离，其他杂质不干扰对映异构体检测，结果准确。

实施例6

检测仪器与色谱条件

检测仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为多糖衍生物类手性色谱柱，色谱柱柱温为35℃，采用紫外检测器，检测波长设置为244nm；流动相流速为1ml/min；以体积比为95：5：0.1：0.1的正己烷-无水乙醇-乙酸-三乙胺为流动相等度洗脱。

本实施例中系统适用性溶液的制备同实施例1。

取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，按所述的色谱条件测定，记录色谱图，完成测定；所得色谱图如图10所示。

结果显示，阿托伐他汀钙对映异构体、托伐他汀钙杂质h和阿托伐他汀钙分离度良好，达到了基线分离，其他杂质不干扰对映异构体检测，结果准确。

实施例7

检测仪器与色谱条件

检测仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为多糖衍生物类手性色谱柱，色谱柱柱温为35℃，采用紫外检测器，检测波长设置为244nm；流动相流速为1ml/min；以体积比为95：2.5：2.5：0.1：0.1的正己烷-甲醇-无水乙醇-乙酸-三乙胺为流动相等度洗脱。

本实施例中系统适用性溶液的制备同实施例1。

取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，按所述的色谱条件测定，记录色谱图，完成测定；所得色谱图如图11所示。

结果显示：结果显示，阿托伐他汀钙对映异构体、托伐他汀钙杂质h和阿托伐他汀钙分离度良好，达到了基线分离，其他杂质不干扰对映异构体检测，结果准确。

实施例8

检测仪器与色谱条件

检测仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为多糖衍生物类手性色谱柱，色谱柱柱温为35℃，采用紫外检测器，检测波长设置为244nm；流动相流速为1ml/min；以体积比为90：1.5：3.5：5：0.1：0.1的正己烷-甲醇-无水乙醇-异丙醇-乙酸-三乙胺为流动相等度洗脱。

本实施例中系统适用性溶液的制备同实施例1。

取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，按所述的色谱条件测定，记录色谱图，完成测定；所得色谱图如图12所示。

结果显示：结果显示，阿托伐他汀钙对映异构体和阿托伐他汀钙分离度良好，达到了基线分离，其他杂质不干扰对映异构体检测，结果准确。

实施例9

检测仪器与色谱条件

检测仪器：高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱为多糖衍生物类手性色谱柱，色谱柱柱温为35℃，采用紫外检测器，检测波长设置为244nm；流动相流速为1ml/min；以体积比为95：1.5：3.5：0.1：0.1的正己烷-甲醇-无水乙醇-异丙醇-乙酸-三乙胺为流动相等度洗脱。

系统适用性溶液的制备：将质量比为500:1的阿托伐他汀钙对照品、阿托伐他汀钙对映异构体对照品、阿托伐他汀钙杂质h对照品加入占系统适用性试验溶液总体积50％的溶剂中，充分振摇使溶解，加溶剂稀释至刻度，使得阿托伐他汀钙浓度为1.0mg/ml，阿托伐他汀钙对映异构体浓度为0.002mg/ml，阿托伐他汀钙杂质h浓度为0.01mg/ml，滤过，其中溶剂为体积比为1∶1∶3的甲醇-无水乙醇-正己烷溶液；

取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，按所述的色谱条件测定，记录色谱图，完成测定；所得色谱图如图13所示。

结果显示：结果显示，阿托伐他汀钙对映异构体、托伐他汀钙杂质h和阿托伐他汀钙分离度良好，达到了基线分离，其他杂质不干扰对映异构体检测，结果准确。

表2

从实施例2-9的结果中可以看出，采用多糖衍生物类手性色谱柱，在本发明选择的流动相的色谱条件下，阿托伐他汀钙对映异构体、托伐他汀钙杂质h和阿托伐他汀钙三者能够实现有效分离，各组分的保留时间和出峰位置显著不同，本发明的技术方案用于阿托伐他汀钙对映异构体的检测是一行之有效的方法。