一种测定LCZ696有关物质的方法与流程

本发明属于医药化工领域，更具体地涉及一种用hplc方法测定lcz696有关物质的方法。
背景技术：
：lcz696化学名为六(4-{[(1s,3r)-1-([1,1'-联苯基]-4-甲基)-4-乙氧基-3-甲基-4-氧代丁基]氨基}-4-氧代丁酸)六(n-戊酰基-n-{[2'-(1h-四氮唑-5-基)[1,1'-联苯基]-4-基]甲基}-l-缬氨酸)—十八钠盐十五水合物。lcz696是一种由sacubitril(代号sac)与缬沙坦(代号vst)1:1形成的超分子钠盐复合物；其配制成供试液进样hplc分析时会转变为2个部分，分别是vst和sac，其中sac部分有2个手性中心，存在3个异构体杂质，缬沙坦部分有1个手性中心，存在1个对映异构体，故目前采用别的色谱柱分离的难度比较大。lcz696结构式如下：分子式：c288h330n36o48na18·15h2o分子量：5747.96cas号：936623-90-4为了保证药品的质量，保证用药的安全需要开发出一种有效检测lcz696手性杂质的方法。技术实现要素：发明概述现有技术中没有公开能够有效测定lcz696有关物质的分析方法。本发明将提供一种采用hplc测定lcz696有关物质的分析方法。lcz696因其本身化合物构造特点，存在多个手型中心，造成分离难度较大。本发明人通过多次的实验尝试，最终开发出一种有效测定lcz696有关物质的分析方法。所述方法采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱，硅胶表面涂敷有纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)，适合在反相流动相中使用。同时采用三氟乙酸和乙腈为流动相进行梯度洗脱，在反相色谱系统中对lcz696原料药及有关物质进行分离测定。本发明所述的分析方法能够有效分离测定lcz696原料药及有关物质，具有分离度好，灵敏度高，操作方便等优点。发明详述本发明的方法简单、快捷、准确地分离检测出lcz696的2个主成分(sac、vst)及相应4个光学异构体杂质(杂质a、杂质c是sac的非对映异构体，杂质b是sac的对映异构体；杂质e是vst的对映异构体)，各相关化合物的结构如下示：本发明提供的一种用hplc测定lcz696原料药及有关物质的方法，其特征是采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱；流动相由a相和b相组成，其中以酸性溶剂作为a相，以有机溶剂作为b相。本发明所述的多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱可以选自不同厂家的色谱柱，在一些实施例中所述色谱柱是chiralceloj-rh(4.6*150mm，5μm)。本发明所述有机溶剂可以是选自甲醇、乙醇、乙腈的至少一种，或加入一定比例甲酸、乙酸、三氟乙酸或磷酸的甲醇、乙醇、乙腈或其组合。在一些实施例中有机溶剂为乙腈，或加入0.05％～0.5％体积比三氟乙酸的乙腈。本发明所述的酸性溶剂可以是选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、磷酸和磷酸盐中的至少一种。在一些实施例中酸性溶剂为三氟乙酸。在一些实施例中，酸性溶剂为0.05％～0.5％体积比的三氟乙酸溶液。在一些实施例中，所述酸性溶剂为0.1％的体积比的三氟乙酸。在一些实施例中，a相和b相的体积比为1:20～10:1。在一些实施例中，本发明所述的分析方法是采用梯度洗脱程序进行的，其中梯度洗脱程序如下表1所示。表1在一些实施例中，本发明提供的一种用hplc测定lcz696有关物质的方法，其特征是：采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱；流动相a相是0.05％～0.5％(体积比)三氟乙酸溶液，其中0.05％～0.5％(体积比)三氟乙酸溶液与乙腈的体积比是约1:20～10:1；b相是乙腈，含0.05％～0.5％(体积比)三氟乙酸；其中梯度程序如上表1所示；色谱柱柱温：约20℃～40℃；流速：约0.5ml/min～1.5ml/min；检测器：dad检测器，检测波长约210nm～280nm。在一些实施例中，本发明提供的一种用hplc测lcz696有关物质的方法，其特征是：采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱；流动相a相是0.1％(体积比)三氟乙酸溶液；b相是乙腈，含0.1％(体积比)的三氟乙酸；梯度洗脱程序如上表1所示；色谱柱柱温：约25℃；流速：约0.7ml/min；检测器：dad检测器，检测波长约254nm。本发明所述的分析方法，其中，待检测的供试品溶液可通过以下方法配制：取lcz696供试品约50mg，精密称定，置25ml容量瓶中，用稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。在一些实施例中，供试品溶液的进样量可以是1～100μl；在一些实施例中供试品溶液的进样量可以是15μl。术语定义术语“峰纯度”是指hplc检测中，用于判断某一色谱峰是否只是由一个物质引起的一个考察参数，一般认为峰纯度在0.990～1.000之间即认为所考察的某一色谱峰纯净，该色谱峰是某单一物质的色谱峰。术语“不对称因子”是指在hplc检测中，用于考察峰型对称性的参数，体现色谱柱效能；在液相色谱法中，当不对称因子在0.8～1.2之间认为峰型较好。术语“r”在hplc检测中是指分离度，用于考察色谱峰之间分离情况的参数；通常两个峰型峰高相当的色谱峰，其分离度大于等于1.5则认为两峰的分离达到99％以上；r值越大分离情况越好。术语“约”在本发明中是指在所述数值的±10％以内。谱图中各出峰结构对应发明详述表格中所示化合物结构。附图说明图1实施例1空白溶液供试品溶液色谱图。图2实施例1供试加标溶液色谱图。图3实施例1供试品溶液色谱图。图4实施例2供试加标溶液色谱图。图5实施例3供试加标溶液色谱图。图6实施例4供试加标溶液色谱图。图7实施例5供试加标溶液色谱图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。本发明所使用的分析试剂及溶液符合中国药典2010版附录的要求，除另有说明外。实施例1色谱条件：色谱系统：美国agilent1260型高效液相色谱系统及工作站；色谱柱：chiralceloj-rh(4.6×150mm，5μm)；检测器：dad检测波长：254nm；流速：0.7ml/min柱温：25℃进样量：15μl运行时间：45min流动相配制：a相：0.1％(体积比)三氟乙酸溶液：取三氟乙酸1.0ml，加水1000ml稀释，摇匀，过0.2μm滤膜，超声脱气，即得；b相：乙腈(0.1％的体积比的三氟乙酸)：取三氟乙酸1.0ml，加乙腈1000ml稀释，摇匀，即得。流动相采用梯度洗脱，洗脱程序如下表所示：时间(min)a相(％)b相(％)0703016703021653540604040.17030457030实验步骤稀释剂/空白溶液：乙腈:水＝3:7(v/v)的混合溶液；取lcz696供试品约50mg，精密称定，置25ml容量瓶中，用稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取杂质a、b、c对照品分别约6mg、6mg、6mg，称定，置于100ml的容量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质a、b、c对照储备液；取杂质e对照品约6mg，称定，置于25ml的容量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质e对照储备液；取lcz696供试品约50mg，精密称定，置于25ml的容量瓶中；再精密移取杂质a、b、c对照储备液1ml，及杂质e对照储备液1ml至上述25ml的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为供试加标溶液。分别取空白溶液、供试加标溶液和供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图1、附图2及附图3。附图2中保留时间14.1分钟的色谱峰为vst的色谱峰，保留时间15.8分钟的色谱峰为杂质e的色谱峰，保留时间29.5分钟的色谱峰为sac的色谱峰，保留时间31.7分钟的色谱峰为杂质c的色谱峰，保留时间32.8分钟的色谱峰为杂质b的色谱峰，保留时间37.1分钟的色谱峰为杂质a的色谱峰。附图3证明，lcz696各异构体达到原料药要求，本法可以用于lcz696的质量监测。实施例2色谱条件色谱柱：chiralceloj-rh(4.6×150mm，5μm)；检测器：dad检测波长：254nm；流速：0.77ml/min柱温：25℃进样量：15μl运行时间：45min流动相配制：a相：0.1％(体积比)三氟乙酸溶液：取三氟乙酸1.0ml，加水1000ml稀释，摇匀，过0.2μm滤膜，超声脱气，即得；b相：乙腈(0.1％的体积比的三氟乙酸)：取三氟乙酸1.0ml，加乙腈1000ml稀释，摇匀，即得。流动相采用梯度洗脱，洗脱程序如下表所示：时间(min)a相(％)b相(％)0703016703021653540604040.17030457030实验步骤稀释剂/空白溶液：乙腈:水＝3:7(v/v)的混合溶液；取杂质a、b、c对照品分别约6mg、6mg、6mg，称定，置于100ml的容量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质a、b、c对照储备液；取杂质e对照品约6mg，称定，置于25ml的容量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质e对照储备液；取lcz696供试品约50mg，精密称定，置于25ml的容量瓶中；再精密移取杂质a、b、c对照储备液1ml，及杂质e对照储备液1ml至上述25ml的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为供试加标溶液。取供试加标溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图4。附图4中保留时间12.9分钟的色谱峰为vst的色谱峰，保留时间14.5分钟的色谱峰为杂质e的色谱峰，保留时间28.0分钟的色谱峰为sac的色谱峰，保留时间30.1分钟的色谱峰为杂质c的色谱峰，保留时间31.1分钟的色谱峰为杂质b的色谱峰，保留时间35.3分钟的色谱峰为杂质a的色谱峰；附图4证明，lcz696中主成分与其各异构体在流速为0.77ml/min时，分离度均大于1.5，该条件能用于lcz696的质量监测。实施例3色谱条件色谱柱：chiralceloj-rh(4.6×150mm，5μm)；检测器：dad检测波长：254nm；流速：0.77ml/min柱温：27℃进样量：15μl运行时间：45min流动相配制：a相：0.1％(体积比)三氟乙酸溶液：取三氟乙酸1.0ml，加水1000ml稀释，摇匀，过0.2μm滤膜，超声脱气，即得；b相：乙腈(0.1％的体积比的三氟乙酸)：取三氟乙酸1.0ml，加乙腈1000ml稀释，摇匀，即得。流动相采用梯度洗脱，洗脱程序如下表所示：时间(min)a相(％)b相(％)0703016703021653540604040.17030457030实验步骤稀释剂/空白溶液：乙腈:水＝3:7(v/v)的混合溶液；取杂质a、b、c对照品分别约6mg、6mg、6mg，称定，置于100ml的容量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质a、b、c对照储备液；取杂质e对照品约6mg，称定，置于25ml的容量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质e对照储备液；取lcz696供试品约50mg，精密称定，置于25ml的容量瓶中；再精密移取杂质a、b、c对照储备液1ml，及杂质e对照储备液1ml至上述25ml的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为供试加标溶液。取供试加标溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图5。附图5中保留时间15.1分钟的色谱峰为vst的色谱峰，保留时间16.9分钟的色谱峰为杂质e的色谱峰，保留时间30.1分钟的色谱峰为sac的色谱峰，保留时间32.3分钟的色谱峰为杂质c的色谱峰，保留时间33.7分钟的色谱峰为杂质b的色谱峰，保留时间38.2分钟的色谱峰为杂质a的色谱峰；附图5证明，lcz696中主成分与其各异构体在柱温为27℃时，分离度均大于1.5，该条件能用于lcz696的质量监测。实施例4色谱条件色谱柱：chiralceloj-rh(4.6×150mm，5μm)；检测器：dad检测波长：254nm；流速：0.77ml/min柱温：25℃进样量：15μl运行时间：45min流动相配制：a相：0.09％(体积比)三氟乙酸溶液：取三氟乙酸0.09ml，加水1000ml稀释，摇匀，过0.2μm滤膜，超声脱气，即得；b相：乙腈(0.1％的体积比的三氟乙酸)：取三氟乙酸1.0ml，加乙腈1000ml稀释，摇匀，即得。流动相采用梯度洗脱，洗脱程序如下表所示：时间(min)a相(％)b相(％)0703016703021653540604040.17030457030实验步骤稀释剂/空白溶液：乙腈:水＝3:7(v/v)的混合溶液；取杂质a、b、c对照品分别约6mg、6mg、6mg，称定，置于100ml的容量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质a、b、c对照储备液；取杂质e对照品约6mg，称定，置于25ml的容量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质e对照储备液；取lcz696供试品约50mg，精密称定，置于25ml的容量瓶中；再精密移取杂质a、b、c对照储备液1ml，及杂质e对照储备液1ml至上述25ml的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为供试加标溶液。取供试加标溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图6。附图6中保留时间14.2分钟的色谱峰为vst的色谱峰，保留时间15.9分钟的色谱峰为杂质e的色谱峰，保留时间29.5分钟的色谱峰为sac的色谱峰，保留时间31.6分钟的色谱峰为杂质c的色谱峰，保留时间32.7分钟的色谱峰为杂质b的色谱峰，保留时间37.1分钟的色谱峰为杂质a的色谱峰；附图6证明，lcz696中主成分与其各异构体在流动相a相为0.09％(体积比)三氟乙酸溶液时，分离度均大于1.5，该条件能用于lcz696的质量监测。实施例5色谱条件色谱柱：chiralceloj-rh(4.6×150mm，5μm)；检测器：dad检测波长：254nm；流速：0.77ml/min柱温：25℃进样量：15μl运行时间：45min流动相配制：a相：0.09％(体积比)三氟乙酸溶液：取三氟乙酸1.0ml，加水1000ml稀释，摇匀，过0.2μm滤膜，超声脱气，即得；b相：乙腈(0.11％的体积比的三氟乙酸)：取三氟乙酸1.1ml，加乙腈1000ml稀释，摇匀，即得。流动相采用梯度洗脱，洗脱程序如下表所示：时间(min)a相(％)b相(％)0703016703021653540604040.17030457030实验步骤稀释剂/空白溶液：乙腈:水＝3:7(v/v)的混合溶液；取杂质a、b、c对照品分别约6mg、6mg、6mg，称定，置于100ml的容量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质a、b、c对照储备液；取杂质e对照品约6mg，称定，置于25ml的容量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质e对照储备液；取lcz696供试品约50mg，精密称定，置于25ml的容量瓶中；再精密移取杂质a、b、c对照储备液1ml，及杂质e对照储备液1ml至上述25ml的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为供试加标溶液。取供试加标溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图7。附图7中保留时间14.0分钟的色谱峰为vst的色谱峰，保留时间15.7分钟的色谱峰为杂质e的色谱峰，保留时间29.5分钟的色谱峰为sac的色谱峰，保留时间31.6分钟的色谱峰为杂质c的色谱峰，保留时间32.7分钟的色谱峰为杂质b的色谱峰，保留时间37.1分钟的色谱峰为杂质a的色谱峰；附图7证明，lcz696中主成分与其各异构体在流动相b相为乙腈(含0.11％的体积比的三氟乙酸)时，分离度均大于1.5，该条件能用于lcz696的质量监测。因此，本发明的一种用hplc测定lcz696有关物质的方法，能够有效分离测定lcz696有关物质，具有分离度好，灵敏度高，操作方便等优点。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。当前第1页1 2 3