本发明涉及微藻代谢过程研究技术领域，尤其涉及一种基于红外光谱显微成像技术的雨生红球藻虾青素合成过程研究方法。
背景技术
雨生红球藻(haematococcuspluvialis)是一种淡水生的单细胞绿藻，隶属绿藻门、团藻目、红球藻科、红球藻属。细胞为圆形到椭圆形，直径在20-40μm。在整个生命周期中它出现3种典型的细胞形态：绿色营养细胞、黄色中间期细胞和红色孢囊细胞。在合适的生长条件下，雨生红球藻以绿色游动细胞的形式存在进行快速生长，此时细胞内主要含有叶绿素a、叶绿素b以及初级类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素和叶黄素。在环境条件不利时(如强光照、高盐、营养缺乏、低温、干燥、辐射、活性氧诱生剂等)，雨生红球藻以黄色和红色不动细胞为主并伴随着细胞体积的增大和细胞壁的加厚，此时细胞体内的光合速率下降并且各类代谢不平衡，导致碳水化合物的迅速积累，脂肪酸和类胡萝卜素含量增加，特别是虾青素迅速在细胞内积累。与细菌、酵母等其它微生物相比，雨生红球藻被认为是天然虾青素生产的最好来源。虾青素具有抗辐射和防紫外线的功能，可以预防心脑血管疾病、缓解机体疲劳、防癌抗癌等功效，还可以提高饲养动物的免疫力、促进繁殖能力、加快个体生长、预防疾病，它已经成为食(药)品、化妆品、动物和水产养殖的重要添加剂。天然虾青素产品日益受到消费者的青睐，并且已经实现了大规模商业化生产，然而由于国际市场上虾青素供不应求导致价格不断攀升，这就使得利用雨生红球藻进行天然虾青素的生产具备了广阔的市场前景。
虽然雨生红球藻是天然虾青素的最好生物来源，但是野生型的雨生红球藻存在着生长速率低、对培养温度要求苛刻、单位虾青素产量低等缺点。近年来，国内外科研工作者尝试了大量物理、化学和生物的诱变方法，期望得到生长速率快、环境适应能力强和虾青素产量高的新型雨生红球藻株。除了采用微藻育种的方式提高虾青素的产量，还可以通过对雨生红球藻合成虾青素的路径进行分析和研究，掌控好诱导藻细胞内虾青素积累的最适条件，提高虾青素的单位产量，进而降低虾青素的生产成本。
目前有关雨生红球藻细胞内合成虾青素路径的研究主要方法有：①抑制剂阻断类胡萝卜素合成过程中的关键酶的活性，提取和分离中间产物，液相色谱定量分析；②类胡萝卜素合成过程中关键基因表达水平的研究。然而此类方法具有操作复杂、步骤繁琐、检测过程中大量化学试剂的使用易造成环境污染、只能单一组分的分析、无法观测细胞内成分的分布情况等缺点。相比之下，红外显微光谱成像检测具有多方面的优势，适于雨生红球藻虾青素合成过程中各类组分变化的快速分析。
红外光谱(infraredspectroscopy，ir)是依据分子吸收红外辐射后发生能级的跃迁过程中光谱的振动情况来确定物质基团的结构和化合物的含量等信息。尤其是近十几年随着光谱显微镜技术的快速发展，红外光谱显微成像技术在分类鉴定、生长代谢监测、育种、水环境、食品医药等与微藻相关的领域取得了显著地进展。
可见，随着红外光谱仪的技术进步，基于红外光谱显微成像的检测分析方法日趋成熟。且由于其具有简单、快速、实时动态和无损检测等优势，同时也能够对生物体进行多组分、微观空间的分析的特点，今后一定会受到越来越广泛的关注。
技术实现要素：
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种基于红外光谱显微成像技术的雨生红球藻虾青素合成过程研究方法，实现了在单细胞水平和微空间尺度上对虾青素积累过程中各类细胞组分变化的研究和分析。
本发明提出一种基于红外光谱显微成像技术的雨生红球藻虾青素合成过程研究方法，包括以下步骤：
s1、雨生红球藻的接种和培养；
s2、抑制剂对雨生红球藻株处理；
s3、虾青素、β-胡萝卜素和番茄红素标准品的红外光谱采集；
s4、藻细胞红外显微光谱的检测；
s5、显微红外光谱成像的比较和分析。
优选地，s1中雨生红球藻的接种和培养采用如下工艺：将雨生红球藻接种于无菌的bbm培养基中培养制得雨生红球藻株。
优选地，s1中雨生红球藻在无菌bbm培养基中的接种重量比为10-20％。
优选地，培养条件为：光照强度2000-3000lx，温度23-26℃，光暗周期12h/12h，手摇频率2-3次/天。
优选地，s2中抑制剂对雨生红球藻株处理采用如下工艺：将抑制剂加入雨生红球藻株培养基中，在5500-6500lx的强光照条件进行2天、5天及10天的培养，诱导虾青素的积累。
优选地，s2中抑制剂为尼古丁和/或二苯胺。
优选地，尼古丁在雨生红球藻株培养基中的浓度为60-90μm，二苯胺在雨生红球藻株培养基中的浓度为0.1-0.3mm。
优选地，s3中虾青素、β-胡萝卜素和番茄红素标准品的红外光谱采集采用如下工艺：将虾青素、β-胡萝卜素及番茄红素样品分别经红外光谱仪检测测得红外图谱；将红外谱图进行数据获取和处理分析。
优选地，s3中红外光谱仪为傅立叶变换红外光谱仪，检测条件为：扫描次数64次，测量范围4000-400cm-1，分辨率4cm-1。
优选地，红外谱图采用brukeropus6.5软件进行数据的获取和处理分析。
优选地，s4中藻细胞红外显微光谱的检测采用如下工艺：将雨生红球藻株经离心洗涤去除培养基，在温度40-50℃下干燥20-28h制得藻样，将藻样经红外显微光谱仪和显微镜检测测得红外显谱和显微镜图谱；将红外显谱和显微镜图谱进行数据获取和处理分析。
优选地，s4红外显微光谱仪为bruker66v/sfourier，扫描次数256次，测量范围4000-900cm-1，分辨率4cm-1，显微镜为brukerhyperion3000；优选地，红外显谱和显微镜图谱采用brukeropus6.5软件进行数据的获取和处理分析。
优选地，s5中显微红外光谱成像的比较和分析如下：～3040-3000cm-1归属于类胡萝卜素中β胡萝卜素和虾青素的ch＝ch的光谱振动，～2980-2880cm-1归属于脂类和类胡萝卜素中的ch非对称振动，～1780-1700cm-1为脂类的c＝o的振动，～1700-1580cm-1归属于蛋白质的amidei和虾青素的c＝o的振动，～1050-950cm-1归属于来自于细胞壁中的多糖的c-o-c振动。
本发明利用红外显微光谱成像技术，结合类胡萝卜素合成的抑制剂对雨生红球藻细胞进行处理，实现了在细胞和亚细胞尺度上对虾青素积累过程中藻细胞各类组分含量进行高空间分辨原位观测，能够很好的观察到脂类、类胡萝卜素、蛋白质和多糖等组分在虾青素合成路径的作用，这在一定程度上解决了许多常规的检测分析技术在微藻代谢调控研究中不能同时兼顾高通量测量和高空间分辨率观察之间的矛盾。本发明方法步骤简便、成本低、分析耗时短，将对藻细胞内类胡萝卜素合成路径的研究以及雨生红球藻的规模化养殖生产虾青素有重要意义。
附图说明
图1虾青素、β-胡萝卜素和番茄红素标准品的红外光谱；
图2虾青素合成路径及关键酶抑制剂及其作用的位点；
图3雨生红球藻的红外光谱显微成像图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种基于红外光谱显微成像技术的雨生红球藻虾青素合成过程研究方法，包括以下步骤：
s1、将雨生红球藻按10％的重量比接种于无菌的bbm培养基中，在光照强度2000lx、温度23℃、光暗周期12h/12h、手摇频率3次/天的条件下培养制得雨生红球藻株；
s2、将尼古丁加入雨生红球藻株培养基中制得含尼古丁浓度为60μm的处理液，在5500lx的强光照条件进行2天、5天及10天的培养，诱导虾青素的积累；
s3、将虾青素、β-胡萝卜素及番茄红素样品分别经红外光谱仪在扫描次数64次、测量范围4000-400cm-1、分辨率4cm-1的条件下测得红外图谱；再经brukeropus6.5软件对红外谱图进行数据的获取和处理得到虾青素、β-胡萝卜素和番茄红素标准品的红外光谱采集；
s4、将雨生红球藻株经离心洗涤去除培养基，在温度40℃下干燥20h基制得藻样，将藻样经bruker66v/sfourier红外显微光谱仪和显微镜，在扫描次数256次、测量范围4000-900cm-1、分辨率4cm-1的条件下测得红外显谱和显微镜图谱；将红外显谱和显微镜图谱采用brukeropus6.5软件进行数据获取和处理分析；
s5、显微红外光谱成像的比较和分析如下：～3015cm-1归属于类胡萝卜素中β胡萝卜素和虾青素的ch＝ch的光谱振动，～2930cm-1归属于脂类和类胡萝卜素中的ch非对称振动，～1750cm-1为脂类的c＝o的振动，～1655cm-1归属于蛋白质的amidei和虾青素的c＝o的振动，～1045cm-1归属于来自于细胞壁中的多糖的c-o-c振动。
实施例2
一种基于红外光谱显微成像技术的雨生红球藻虾青素合成过程研究方法，包括以下步骤：
s1、将雨生红球藻按20％的重量比接种于无菌的bbm培养基中，在光照强度3000lx、温度26℃、光暗周期12h/12h、手摇频率3次/天的条件下培养制得雨生红球藻株；
s2、将尼古丁加入雨生红球藻株培养基中制得含尼古丁浓度为90μm的处理液，在6500lx的强光照条件进行2天、5天及10天的培养，诱导虾青素的积累；
s3、将虾青素、β-胡萝卜素及番茄红素样品分别经红外光谱仪在扫描次数64次、测量范围4000-400cm-1、分辨率4cm-1的条件下测得红外图谱；再经brukeropus6.5软件对红外谱图进行数据的获取和处理得到虾青素、β-胡萝卜素和番茄红素标准品的红外光谱采集；
s4、将雨生红球藻株经离心洗涤去除培养基，在温度50℃下干燥28h制得藻样，将藻样经bruker66v/sfourier红外显微光谱仪和显微镜，在扫描次数256次、测量范围4000-900cm-1、分辨率4cm-1的条件下测得红外显谱和显微镜图谱；将红外显谱和显微镜图谱采用brukeropus6.5软件进行数据获取和处理分析；
s5、显微红外光谱成像的比较和分析如下：～3000cm-1归属于类胡萝卜素中β胡萝卜素和虾青素的ch＝ch的光谱振动，～2915cm-1归属于脂类和类胡萝卜素中的ch非对称振动，～1730cm-1为脂类的c＝o的振动，～1645cm-1归属于蛋白质的amidei和虾青素的c＝o的振动，～1025cm-1归属于来自于细胞壁中的多糖的c-o-c振动。
实施例3
一种基于红外光谱显微成像技术的雨生红球藻虾青素合成过程研究方法，包括以下步骤：
s1、将雨生红球藻按10％的重量比接种于无菌的bbm培养基中，在光照强度2000lx、温度25℃、光暗周期12h/12h、手摇频率3次/天的条件下培养制得雨生红球藻株；
s2、将二苯胺加入雨生红球藻株培养基中制得含二苯胺浓度为0.2mm的处理液，在6000lx的强光照条件进行2天、5天及10天的培养，诱导虾青素的积累；
s3、将虾青素、β-胡萝卜素及番茄红素样品分别经红外光谱仪在扫描次数64次、测量范围4000-400cm-1、分辨率4cm-1的条件下测得红外图谱；再经brukeropus6.5软件对红外谱图进行数据的获取和处理得到虾青素、β-胡萝卜素和番茄红素标准品的红外光谱采集；
s4、将雨生红球藻株经离心洗涤去除培养基，在温度45℃下干燥24h制得藻样，将藻样经bruker66v/sfourier红外显微光谱仪和显微镜，在扫描次数256次、测量范围4000-900cm-1、分辨率4cm-1的条件下测得红外显谱和显微镜图谱；将红外显谱和显微镜图谱采用brukeropus6.5软件进行数据获取和处理分析；
s5、显微红外光谱成像的比较和分析如下：～3010cm-1归属于类胡萝卜素中β胡萝卜素和虾青素的ch＝ch的光谱振动，～2925cm-1归属于脂类和类胡萝卜素中的ch非对称振动，～1740cm-1为脂类的c＝o的振动，～1650cm-1归属于蛋白质的amidei和虾青素的c＝o的振动，～1035cm-1归属于来自于细胞壁中的多糖的c-o-c振动。
图1为虾青素、β-胡萝卜素和番茄红素三种色素标准品的红外光谱。可以看出，与β-胡萝卜素和番茄红素，虾青素在1740cm-1具有特征的红外光谱吸收峰。
图2为虾青素合成的简要路径。尼古丁作为番茄红素环化酶(lcy)的抑制剂可以有效地抑制番茄红素到β-胡萝卜素的转变；二苯胺作为β-胡萝卜素酮化酶的抑制剂可以有效地抑制β-胡萝卜素到虾青素的转变。
图3为6000lx高光照培养2、5和10天的雨生红球藻的红外光谱显微成像图。分别对细胞内的脂类、类胡萝卜素、虾青素、蛋白质和糖类进行成像，可以看出在不同时间各类组分含量具有明显差异即在虾青素的合成和积累过程中各类成分处于动态的变化过程中。尤其是在加入尼古丁和二苯胺两类抑制剂进行的红外光谱显微成像，能够很好用于研究虾青素的具体合成路径以及各类组分在其合成过程中的相关作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。