专利名称：一种dna烷化损伤的红外光谱快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA烷化损伤的红外光谱快速检测方法。
背景技术：
DNA损伤是癌症等重大疾病发生的重要原因之一，导致DNA损伤的因素非常复杂， 如体内代谢过程中产生的自由基和其它活泼中间体，DNA复制和重组过程中的自发错误，环境中的紫外线和离子辐射以及内源和外源化学物质等。在诸多 导致DNA损伤的因素中，活泼亲电烷化剂作为一类重要的化学物质能够通过与细胞内靶DNA作用，将单个烷基或复合的烷基基团转移到DNA碱基的特殊位置上，引起碱基烷化损伤，并可进一步导致碱基丢失、 核苷酸结构变异以及DNA链发生断裂、交联，造成基因突变，从而诱发细胞凋亡或癌变。多种致癌物质和临床应用的抗癌药物都能够导致DNA的烷基化损伤。环境中广泛存在的亚硝胺、食品高温加工过程中生成的丙烯酰胺以及汽车尾气和卷烟烟气中存在的1，3-丁二烯， 经过代谢活化后均能够生成烷基正离子与DNA碱基发生反应，导致DNA损伤并最终诱发癌症。临床上常用的烷化剂类抗癌药物也是通过导致DNA碱基的烷基化而发挥抗癌作用，如用于治疗脑瘤等的亚硝基脲类烷化剂、用于治疗恶性淋巴瘤等的氮芥类烷化剂、用于治疗白血病的甲基磺酸酯类烷化剂和用于治疗卵巢癌的乙烯亚胺类烷化剂等。研究表明，烷化剂经过代谢或分解生成的烷基正离子与DNA中碱基分子电子云密度较高的部位发生亲电反应，比如在鸟嘌呤的06或N7位形成烷化损伤，进而导致DNA交联或断链。DNA烷化损伤作为癌症发病的一种重要的分子标志物，其检测分析是癌症防治、 分子生物学和生物化学等领域的研究热点。目前，针对烷化剂导致DNA损伤的检测方法主要包括荧光光谱、核磁共振和液相色谱-质谱联用等分析化学方法，以及凝胶电泳、彗星电泳和Southern印记杂交等生物化学和分子生物学方法。Bathaie等人(S. Z. Bathaie, et al. Spectrochim. Acta, Part A, 2008, 71 (3) :803 808)报道了链脲霉素导致的 DNA 烷化物的研究方法，该方法对抗癌药物链脲霉素产生的DNA甲基化产物及其二级结构变化进行了分析。Zhou 等人(Q. Zhou，et al. Chem. Res. Toxicol. ,2011,24(3) :402 411) 报道了苯醌甲基化物导致DNA甲基化损伤的检测方法，该方法使用凝胶电泳、质谱和核磁对具有高至变性的苯醌甲基化物产生的DNA甲基化损伤产物进行了研究。Garaguso等人(I.Garaguso，et al. Anal. Chem.，2010，82 (20) :8573 8582)报道了多环芳烃代谢物对DNA鸟嘌呤烷化损伤的质谱分析方法，该方法使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法对 DNA鸟嘌呤的烷化损伤产物进行了定量检测。Kakadiya等人(R. Kakadiya，et al. Bioorg. Med. Chem. ,2010,18(6) :2285 2299)报道了氮芥-喹啉结合物的DNA烷化产物的研究方法，该方法使用彗星电泳法对DNA的烷化损伤产物进行了检测。Janka等人(V. Janka， et al. Acta Histochemica，2011，113 :423 427)报道了甲基亚硝基脲(MNU)所导致的 DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测法，该方法对DNA损伤的程度进行了定量分析。Penkenth 等人(P. G. Penkenth, et al, Biochem Pharmacol. ,2000,59(3) :283 291)报道了利用荧光光谱法对氯乙基亚硝基脲(CENU)导致的DNA损伤产物的研究，该方法证实CENU能够通过多种途径分解成活泼亲电试剂，进而导致DNA碱基烷化。Bodell等人(W.J.Bodell，et al. J. Neurooncol.，2009，91 257 264)报道了利用高效液相色谱-质谱联用技术检测 CENU烷基化产物，该方法检测到CENU和DNA反应后生成至少13种DNA烷化损伤产物。综上所述，现有技术中报道的DNA烷化损伤检测方法虽然被广泛应用于致癌物和抗癌药的毒理、药理研究中，但均不适用于DNA烷化损伤的快速检测，此外还各自仍存在以下不足之处(1)质谱方法检测DNA烷化损伤，样品需经过脱盐、浓缩等复杂的前处理过程，而且质谱仪器价格昂贵、操作复杂、对分析环境要求高，实验成本高，无法实现样品的回收利用；(2)荧光方法检测DNA烷化损伤，需要特殊的荧光染料，易受样品杂质干扰，实验结果重现性低，不能确定烷化位点，实验过程不易于操作；(3)电泳方法检测DNA烷化损伤，最显著的缺点是灵敏度低、专属性差，不能确定烷化位点，需要溴化乙锭等具有致癌性的染料，容易对人体产生危害且不符合环保要求；(4) Southern印迹杂交方法检测DNA烷化损伤，灵敏度低、专属性差，对DNA的样品量和纯度要求高，不能确定烷化位点，分析速度慢。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、专属性强，实验过程简单且安全环保，样品便于回收且能够直接测定DNA烷化损伤位点及损伤程度的红外光谱快速检测方法。本发明所提供的一种DNA烷化损伤的红外光谱快速检测方法，包括以下步骤(1)称取小牛胸腺DNA，溶于1 20mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成浓度为4 10mg/mL的DNA溶液，pH值为7 8，向DNA溶液中加入烷化剂乙醇溶液，烷化剂的摩尔浓度为0. 25 15mmol/L，在37°C下反应4 IOh ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定设定扫描范围4000 400CHT1，分辨率2 4CHT1，扫描次数100 500，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将Tris-HCl溶液滴于非水溶性窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于非水溶性窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)将与烷化剂反应后的DNA样品采用与步骤⑵中DNA空白溶液相同的方法进行测定，得到DNA样品溶液的红外光谱图，将得到的所有红外谱图使用大气补偿将空气中 CO2和H2O的吸收峰扣除，最后进行基线校正；(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较，根据峰位和峰强比的变化确定DNA烷化损伤的位点和程度。上述步骤(1)中烷化剂为甲基亚硝基脲、乙基亚硝基脲、甲烷磺酸甲酯、甲烷磺酸乙酯、碘甲烷、碘乙烷、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、甲基亚硝基胍或丙基亚硝基胍。上述步骤(2)中非水溶性窗片为AgBr、CaF2, ZnSe或KRS-5。上述步骤(2)中DNA空白溶液是指未加入烷化剂的DNA溶液。上述步骤(4)中特征峰的变化包括 (a)鸟嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699 1701CHT1，表明鸟嘌呤发生了烷化损伤；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608 1609CHT1，表明腺嘌呤发生了烷化损伤；(c) 1088cm"1处和1228CHT1处磷酸基团特征峰的峰强比1_/11228减小，表明磷酸基团发生了烷化损伤。本发明方法与现有 方法相比，具有以下有益效果(1)操作方法简单，无需复杂的样品处理过程，可将反应完的溶液直接进行红外光谱检测，不需要对待测物质进行分离纯化，便于推广使用，而现有技术中的液质联用方法需要对样品进行酶解、离心过滤、色谱分离等复杂的前处理步骤；(2)检测速度快，每次样品扫描只需5分钟即可完成，而现有技术中的液质联用方法需要8小时以上才能完成；(3)特异性强，灵敏度高，不同种类的DNA烷化损伤均可进行检测，而现有技术中的电泳方法灵敏度低、不能检测损伤的位点，荧光方法只能检测能够与荧光探针特异结合的部分DNA烷化损伤；(4)本发明无需使用放射性元素和致癌性化学染料，消除了对实验人员的伤害，安全环保，而现有技术中的电泳方法需要使用溴化乙锭等致癌性化学染料，液质联用方法需要使用放射性同位素标记；(5)该方法为无损检测，样品能够回收利用，而现有技术中的电泳方法和荧光方法由于加入了化学染料，样品不能直接回收利用，液质联用方法则对待测物质的化学结构进行了破坏，无法回收利用。
图1是DNA空白溶液的红外光谱图；图2是与甲基亚硝基脲反应后的DNA样品溶液的红外光谱图；图3是与乙基亚硝基脲反应后的DNA样品溶液的红外光谱图；图4是与甲烷磺酸甲酯反应后的DNA样品溶液的红外光谱图；图5是与甲烷磺酸乙酯反应后的DNA样品溶液的红外光谱图；图6是与碘甲烷反应后的DNA样品溶液的红外光谱图；图7是与碘乙烷反应后的DNA样品溶液的红外光谱图；图8是与硫酸二甲酯反应后的DNA样品溶液的红外光谱图；图9是与硫酸二乙酯反应后的DNA样品溶液的红外光谱图；图10是与甲基亚硝基胍反应后的DNA样品溶液的红外光谱图；图11是与丙基亚硝基胍反应后的DNA样品溶液的红外光谱图。
具体实施例方式实施例1(1)称取50mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL浓度为10mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成浓度为5mg/mL的DNA溶液，pH值为7. 3，将甲基亚硝基脲(N-methyl-N_nitrosourea，MNU) 固体3mg溶于100 μ L乙醇中，配制成摩尔浓度为30mmol/L的MNU乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入25 μ L MNU乙醇溶液，此时反应体系中MNU的摩尔浓度为7. 5mmol/L，在37°C下反应4h ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定
设定扫描范围4000 400cm-1，分辨率4cm—1，扫描次数128次，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将所配制浓度为lOmmol/L的Tris-HCl溶液滴于KRS-5 窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于KRS-5窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)将与烷化剂反应后的DNA样品溶 液采用与步骤(2)中DNA空白溶液相同的方法进行测定，得到DNA样品溶液的红外光谱图，将得到的所有红外谱图使用大气补偿将空气中CO2和H2O的吸收峰扣除，最后进行基线校正。经处理的DNA空白溶液的红外光谱图如图1所示，经处理的与MNU反应的DNA样品溶液的红外光谱图如图2所示；(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较， 特征峰的变化包括(a)鸟嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1，表明鸟嘌呤发生了烷化损伤；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1，表明腺嘌呤发生了烷化损伤； (c) 1088cm—1处和1228cm-1处磷酸基团特征峰的峰强比I1088A1228由1. 879减小为1. 469，表明磷酸基团发生了烷化损伤。实施例2(1)称取50mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL浓度为lmmol/L Tris-HCl溶液中，配制成浓度为5mg/mL的DNA溶液，pH值为7，将乙基亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea，ENU)固体7mg溶于600 μ L乙醇中，配制成摩尔浓度为60mmol/L的ENU乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入10 μ L ENU乙醇溶液，此时反应体系中ENU的摩尔浓度为lmmol/L，在37°C下反应 6h ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定设定扫描范围4000 400cm—1，分辨率2cm—1，扫描次数256次，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将所配制浓度为lmmol/L的Tris-HCl溶液滴于KRS-5 窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于KRS-5窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)同实施例1中步骤(3)，经处理的与ENU反应的DNA样品溶液的红外谱图如图 3所示；(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较， 特征峰的变化包括(a)鸟嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1，表明鸟嘌呤发生了烷化损伤；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1，表明腺嘌呤发生了烷化损伤； (c) 1088cm—1处和1228cm-1处磷酸基团特征峰的峰强比I1088A1228由1. 879减小为1. 664，表明磷酸基团发生了烷化损伤。实施例3(1)称取70mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL浓度为10mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成浓度为7mg/mL的DNA溶液，pH值为7. 4，将甲烷磺酸甲酯(methane sulfonic acid methyl ester,MMS)液体10 μ L稀释于190 μ L乙醇中，配制成摩尔浓度为100mmol/L的MMS乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入20 μ LMMS乙醇溶液，此时反应体系中MMS的摩尔浓度为IOmmol/ L，在37°C下反应5h ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定设定扫描范围4000 400cm-1，分辨率4cm—1，扫描次数192次，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将所配制浓度为lOmmol/L的Tris-HCl溶液滴于CaF2窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于CaF2窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)同实施例1中步骤(3)，经处理的与匪S反应的DNA样品溶液的红外谱图如图 4所示；
(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较， 特征峰的变化包括(a)鸟嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1700CHT1，表明鸟嘌呤发生了烷化损伤；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1，表明腺嘌呤发生了烷化损伤； (c) 1088cm—1处和1228cm-1处磷酸基团特征峰的峰强比I1088A1228由1. 879减小为1. 746，表明磷酸基团发生了烷化损伤。实施例4(1)称取40mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL浓度为5mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成浓度为4mg/mL的DNA溶液，pH值为7. 8，将甲烷磺酸乙酯(methane sulfonic acid ethyl ester, EMS)液体10 μ L稀释于190 μ L乙醇中，配制成摩尔浓度为100mmol/L的EMS乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入10 μ L EMS乙醇溶液，此时反应体系中EMS的摩尔浓度为5mmol/ L，在37°C下反应7h ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定设定扫描范围4000 400cm—1，分辨率2cm—1，扫描次数384次，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将所配制浓度为5mmol/L的Tris-HCl溶液滴于CaF2窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于CaF2窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)同实施例1中步骤(3)，经处理的与EMS反应的DNA样品溶液的红外谱图如图 5所示；(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较， 特征峰的变化包括(a)鸟嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1，表明鸟嘌呤发生了烷化损伤；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1，表明腺嘌呤发生了烷化损伤； (c) 1088cm—1处和1228cm-1处磷酸基团特征峰的峰强比I1088A1228由1. 879减小为1. 725，表明磷酸基团发生了烷化损伤。实施例5(1)称取60mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL浓度为20mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成浓度为6mg/mL的DNA溶液，pH值为7. 5，将碘甲烷(iodo methane,MeI)液体10 μ L稀释于190 μ L乙醇中，配制成摩尔浓度为160mmol/L的MeI乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入 10 μ L MeI乙醇溶液，此时反应体系中MeI的摩尔浓度为8mmol/L，在37°C下反应6h ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定设定扫描范围4000 400cm—1，分辨率4cm—1，扫描次数320次，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将所配制浓度为20mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe 窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)同实施例1中步骤(3)，经处理的与MeI反应的DNA样品溶液的红外谱图如图6所示；(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较， 特征峰的变化包括(a)鸟嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1，表明鸟嘌呤发生了烷化损伤；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1，表明腺嘌呤发生了烷化损伤； (c) 1088cm—1处和1228cm-1处磷酸基团特征峰的峰强比I1088A1228由1. 879减小为1. 325，表明磷酸基团发生了烷化损伤。实施例6(1)称取40mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL浓度为5mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成浓度为6mg/mL的DNA溶液，pH值为8，将碘乙烷(iodo ethane, EtI)液体15 μ L稀释于485 μ L乙醇中，配制成摩尔浓度为100mmol/L的EtI乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入 10 μ L EtI乙醇溶液，此时反应体系中EtI的摩尔浓度为2mmol/L，在37°C下反应IOh ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定设定扫描范围4000 400cm—1，分辨率2cm—1，扫描次数160次，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将所配制浓度为5mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)同实施例1中步骤(3)，经处理的与EtI反应的DNA样品溶液的红外谱图如图 7所示；(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较， 特征峰的变化包括(a)鸟嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1，表明鸟嘌呤发生了烷化损伤；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1，表明腺嘌呤发生了烷化损伤； (c) 1088cm—1处和1228cm-1处磷酸基团特征峰的峰强比I1088A1228由1. 879减小为1. 322，表明磷酸基团发生了烷化损伤。实施例7(1)称取90mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL浓度为lmmol/L Tris-HCl溶液中，配制成浓度为9mg/mL的DNA溶液，pH值为7，将硫酸二甲酯(dimethyl sulfate, DMS)液体15 μ L 稀释于485 μ L乙醇中，配制成摩尔浓度为150mmol/L的DMS乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入10 μ L DMS乙醇溶液，此时反应体系中DMS的摩尔浓度为3mmol/L，在37°C下反应6h ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定设定扫描范围4000 400cm—1，分辨率4cm—1，扫描次数320次，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将所配制浓度为lmmol/L的Tris-HCl溶液滴于AgBr窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于AgBr窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)同实施例1中步骤(3)，经处理的与DMS反应的DNA样品溶液的红外谱图如图 8所示；(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较， 特征峰的变化包括(a)鸟嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1，表明鸟嘌呤发生了烷化损伤；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1，表明腺嘌呤发生了烷化损伤； (c) 1088cm—1处和1228cm—1处磷酸基团特征峰的峰强比I1088A1228由1. 879减小为1. 355，表明磷酸基团发生了烷化损伤。实施例8(1)称取90mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL浓度为15mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成浓度为9mg/mL的DNA溶液，pH值为7. 5，将硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)液体10 μ L 稀释于1. 5mL乙醇中，配制成摩尔浓度为75mmol/L的DES乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入10 μ L DES乙醇溶液，此时反应体系中DES的摩尔浓度为0. 5mmol/L，在37°C下反应4h ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定设定扫描范围4000 400cm—1，分辨率4cm—1，扫描次数320次，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将所配制浓度为15mmol/L的Tris-HCl溶液滴于AgBr 窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于AgBr窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)同实施例1中步骤(3)，经处理的与DES反应的DNA样品溶液的红外谱图如图 9所示；(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较， 特征峰的变化包括(a)鸟嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1，表明鸟嘌呤发生了烷化损伤；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1，表明腺嘌呤发生了烷化损伤； (c) 1088cm—1处和1228cm-1处磷酸基团特征峰的峰强比I1088A1228由1. 879减小为1. 559，表明磷酸基团发生了烷化损伤。实施例9(1)称取80mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL浓度为15mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成浓度为8mg/mL的DNA溶液，pH值为7. 2，将甲基亚硝基胍(N-methyl-N，-nitro-N-nitr oso-guanidine, MNNG)固体3mg溶于100 μ L乙醇中，配制成摩尔浓度为20mmol/L的MNNG 乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入25 μ L MNNG乙醇溶液，此时反应体系中MNNG的摩尔浓度为5mmol/L，在37°C下反应9h ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定设定扫描范围4000 400cm—1，分辨率2cm—1，扫描次数326次，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将所配制浓度为15mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe 窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)同实施例1中步骤(3)，经处理的与MNNG反应的DNA样品溶液的红外谱图如图10所示；(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较， 特征峰的变化包括(a)鸟嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1，表明鸟嘌呤发生了烷化损伤；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1，表明腺嘌呤发生了烷化损伤； (c) 1088cm—1处和1228cm-1处磷酸基团特征峰的峰强比I1088A1228由1. 879减小为1. 523，表明磷酸基团发生了烷化损伤。实施例10(1)称取40mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL浓度为5mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成浓度为8mg/mL的DNA溶液，pH值为7. 7，将丙基亚硝基胍(N-propyl-N，-nitro-N-nitrosoguanidine,PNNG)固体9mg溶于2mL乙醇中，配制成摩尔浓度为125mmol/L的PNNG乙醇溶液， 向ImL DNA溶液中加入4 μ LPNNG乙醇溶液，此时反应体系中PNNG的摩尔浓度为0. 25mmol/ L，在37°C下反应8h ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定设定扫描范围4000 400cm—1，分辨率2cm—1，扫描次数326次，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将所配制浓度为5mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)同实施例1中步骤(3)，经处理的与PNNG反应的DNA样品溶液的红外谱图如图11所示；(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较， 特征峰的变化包括(a)鸟嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1，表明鸟嘌呤发生了烷化损伤；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1，表明腺嘌呤发生了烷化损伤； (c) 1088cm—1处和1228cm-1处磷酸基团特征峰的峰强比I1088A1228由1. 879减小为1. 596，表明磷酸基团发生了烷化损伤。
权利要求
1.一种DNA烷化损伤的红外光谱快速检测方法，包括以下步骤(1)称取小牛胸腺DNA，溶于1 20mmol/LTris-HCl溶液中，配制成浓度为4 IOmg/ mL的DNA溶液，pH值为7 8，向DNA溶液中加入烷化剂乙醇溶液，烷化剂的摩尔浓度为 0. 25 15mmol/L，在 37°C下反应 4 IOh ；(2)采用液膜法进行红外光谱测定设定扫描范围4000 400cm-1，分辨率2 4cm—1，扫描次数100 500，采用氘化三甘氨硫检测器(DTGS)和KBr分束器，首先将Tris-HCl溶液滴于非水溶性窗片上，干燥后作为背景扫描，再将DNA空白溶液滴于非水溶性窗片上，采用差减法扣除背景后扫描即可得到DNA 空白溶液的红外光谱图，重复测定三次取平均值；(3)将与烷化剂反应后的DNA样品采用与步骤(2)中DNA空白溶液相同的方法进行测定，得到DNA样品溶液的红外光谱图，将得到的所有红外谱图使用大气补偿将空气中CO2和 H2O的吸收峰扣除，最后进行基线校正；(4)将步骤(3)中所得的DNA空白溶液和DNA样品溶液的特征谱峰进行比较，根据峰位和峰强比的变化确定DNA烷化损伤的位点和程度。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤(1)中所述烷化剂为甲基亚硝基脲、乙基亚硝基脲、甲烷磺酸甲酯、甲烷磺酸乙酯、碘甲烷、碘乙烷、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、甲基亚硝基胍或丙基亚硝基胍。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤(2)中所述非水溶性窗片为AgBr、CaF2, ZnSe 或 KRS-5。
全文摘要
本发明涉及一种DNA烷化损伤的红外光谱快速检测方法。该方法是利用红外光谱法检测DNA与烷化剂反应后的红外光谱图，并与空白DNA溶液的红外光谱图进行比较，得到峰位和峰强比发生变化的特征基团，从而确定DNA烷化损伤位点及程度。本发明方法具有操作方法简单且样品便于回收、专属性强、灵敏度高、检测速度快以及安全环保等突出特点，可直接对DNA损伤进行快速检测。
文档编号G01N21/35GK102353647SQ20111030678
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者李莉莉, 赵丽娇, 郑大威, 钟儒刚 申请人:北京工业大学