专利名称：一种聚苯乙烯微球定量检测人血清中gfap浓度的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种定量检测血清中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)浓度的试剂盒，尤其涉及一种应用抗-GFAP抗体特异性包被聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒。
背景技术：
流行病学调查研究表明，目前脑血管疾病与心脏病、恶性肿瘤构成人类疾病死亡的三大原因。与西方发达国家相比，我国脑血管病的发病率和死亡率明显高于心血管病。据估算，全国每年新发脑卒中患者约为200万人；每年死于脑卒中的患者约150万人；存活患者人数600万 700万，且70% 80%的存活者遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来沉重负担。目前我国脑卒中的分型比例中，脑出血约占35% 45%，农村高于城市，贫穷地区高于富裕地区，脑出血的病死率远较脑梗塞高，是一种致死率和致残率均高的常见病、多发病，严重危害人类特别是老年人的健康，威胁病人的生命，严重影响病人生活质量。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是一种分子量为 50 52KDa的酸性蛋白，是脑内星形胶质细胞(astrocyte，AST)中间纤维的结构蛋白组成成分，是星形胶质细胞的标志蛋白。正常生理条件下，AST对神经元起到营养、支持、保护作用，并积极参与神经元的电生理活动；脑损伤后AST活化数量增多由常态转变为反应态，其标志蛋白GFAP表达增加。脑出血后神经元和神经胶质细胞受到损害，大量的胞浆蛋白质漏出细胞进入细胞间液，可溶性的GFAP通过细胞间液进入脑脊液，穿过破坏的血脑屏障进入血液循环。研究表明GFAP在伤后6小时开始增高，在伤后1 4天期间，脑皮质的星形细胞GFAP阳性表达明显增加。因此GFAP可作为急性脑出血的生物学标志物。有研究表明，脑出血患者发病6小时内血清GFAP水平即明显升高，而缺血性脑卒中患者6小时内血清GFAP 水平与正常对照组无明显差异，因此GFAP在发病6小时以内对出血性及缺血性卒中患者具有早期鉴别诊断意义。还有研究表明，急性脑出血患者血清中的GFAP与脑出血体积之间有着密切的正相关关系。因此GFAP水平在出血后早期判断脑损伤的程度及患者的预后具有重要的临床意义。目前，对GFAP的检测主要是ELISA实验方法，且大多仅应用于科学研究，不适用于临床诊断，而且ELISA方法实验过程繁琐，一般需要2 池才能完成检测，不利于实现对脑出血患者早期的快速诊断及鉴别诊断的效率的提高。近年来免疫微粒技术广泛应用于免疫诊断中，免疫微粒技术是指利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体，包被上具有特异性亲和力的抗原或抗体，来检测样本中的生物大分子的一种技术。乳胶、聚苯乙烯、金胶体或顺磁性材料均可制成微粒，与抗原或抗体经过物理吸附、化学偶联及生物素亲和桥联法形成免疫微粒。但在检索的结果中，目前尚未见应用聚苯乙烯微球为固相载体， 以液相杂交为反应模式，制备检测人血清中GFAP浓度的试剂盒以定量检测血清中GFAP浓度的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种应用抗-GFAP抗体特异性包被聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒，以实现快速高效、准确、可靠的定量检测人血清中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)浓度。本发明所述聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒，由96孔过滤板、 标准品、样品稀释液、表面已偶联有抗-GFAP抗体的聚苯乙烯微球、微球储存液、酶结合物、 底物A、底物B、20X洗涤液组成，其特征在于所述96孔过滤板是底部有渗透性的滤膜并能通过抽真空进行洗涤的一种微孔板；所述标准品为浓度为lOOng/ml的GFAP蛋白冻干粉； 所述样品稀释液为每升含IOg牛血清白蛋白(BSA)、lml Proclin 300,0. 3ml Tween20的 0. OlM ρΗ7· 4PBS ；所述微球储存液为每升含0. 1%BSA,0. 02%Tween,0. 1% Proclin 300 的 0. OlM pH7. 4PBS ；所述酶结合物为辣根过氧化酶标记的GFAP 二抗；所述底物A为3mmol/L 鲁米诺与lmmol/L对碘苯酚的混合液；所述底物液B为3mmol/L的双氧化脲溶液；所述20X 洗涤液为每升含160g氯化钠、72. 64g十二水合磷酸氢二钠、4g磷酸二氢钾、氯4. Sg化钾、 IOml Tween 20的水溶液。上述聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒中所述表面已偶联有抗-GFAP抗体的聚苯乙烯微球上的抗-GFAP抗体优选为单克隆抗体；所述辣根过氧化酶标记的GFAP 二抗为多克隆抗体。上述聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒，优选由1块96孔过滤板、2瓶标准品、1瓶样品稀释液、表面已偶联有抗-GFAP抗体的聚苯乙烯微球、1瓶微球储存液、1瓶酶结合物、1瓶底物A 1瓶、底物B 1瓶、20X洗涤液、20片不干胶封片和1份使用说明书构成。上述聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒的应用，步骤是(1)标准品的稀释每瓶标准品临用前以样品稀释液稀释至1ml，静置IOmin后， 反复颠倒混勻，浓度为100ng/ml,做系列稀释，分别为:100ng/ml、50ng/ml、12· 5ng/ml、 3. 12ng/ml、0. 78ng/ml、0. 05ng/ml，样品稀释液作为 0ng/ml ；(2)加样微球使用前中速振荡混勻，每孔加入10μ1微球储存液，其中含 50000 士400个表面已偶联有抗-GFAP抗体的聚苯乙烯微球，用100 μ 1洗涤液真空抽滤洗涤 2-3次后，每孔分别加标准品或待检测样本50μ 1，另设一空为空白，混勻，37°C振荡30min ；(3)洗板使用真空泵抽滤，洗涤液洗涤3-4次；(4)加酶结合物加入50 μ 1酶结合物，混勻，37°C振荡30min ；(5)洗板同(3)洗涤3-4次；(6)加底物每孔先后加入底物液A、底物液B各50 μ 1，避光显色IOmin ；(7)测定避光显色IOmin后在化学发光仪上读出各孔相对发光度(RLU)；(8)标准曲线的制作以标准品的浓度为横坐标，RLU值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的相对发光度(RLU)由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数； 或计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的相对发光度(RLU)代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。本发明所述的聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度试剂盒的应用原理是 将抗GFAP抗体交联在聚苯乙烯微球上，在液相环境中与被测样本反应以后，再与辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)标记的抗GFAP 二抗反应，形成抗体-抗原-抗体复合物(双抗体夹心复合物)，然后再同发光底物反用，通过化学发光检测仪检测其相对发光强度(RLU)，根据标准曲线确定被检测样本中GFAP的浓度，即测知急性脑出血患者血清中的GFAP浓度。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点(1)耗时短本发明的固相载体是颗粒极其微小的聚苯乙烯微球，其比表面积大， 表面偶联容量大；悬浮反应克服了传统ELISA模式在检测时存在的表面张力和空间障碍对抗原抗体反应动力学的影响，而且液相环境更有利于保持抗原抗体的天然构像和活性，更有利于抗原抗体间的充分反应，从而有效的缩短了反应时间，减少了洗涤次数；(2)灵敏度高本发明的最低检出限为17pg/ml，优于目前市场上的GFAP ELISA试剂盒(其灵敏度一般为50pg/ml 200pg/ml)；(3)检测线性范围宽标准曲线的线性范围在0. 025ng/ml lOOng/ml，可以达到 3 5个数量级，而一般的ELISA试剂盒检测范围仅有1 2个数量级，比常规的ELISA方法高10倍以上；(4)成本低本发明所用的检测试剂、消耗品价格不高，此外可以利用临床现有的化学发光检测仪的资源，无需再增加新的设备，有利于其普及与推广。本发明的临床诊断意义(1)可用于对脑出血后早期甚至超早期的诊断，并区别与脑缺血及健康人员；(2)可用于脑出血预后评价动态观察患者血清中GFAP含量，及时准确评估脑组织破坏程度，提示疾病转归情况，对医生指导脑出血患者治疗具有重要意义；(3)联合影像学检查，可提高诊断效率，具有重要的临床意义。
图1本发明GFAP检测试剂盒检测原理图。其中1 聚苯乙烯微球；2 —抗抗-GFAP单克隆抗体；3 被检测物GFAP ；4 二抗抗-GFAP多克隆抗体；5 标记的辣根过氧化物酶(HRP) ；6 底物。
具体实施例方式实施例1步骤一微球储存液的制备(1)微球的活化将聚苯乙烯微球分散均勻后，取5. OX IO6微球加入ΙΟΟμΙ洗涤缓冲液(PBS，0. 05% Tween)，高速振荡15s，清洗后用80 μ 1活化缓冲液悬浮微球，加入 10 μ 1 碳二亚胺(EDC, 50mg/ml)，再迅速加入 10 μ L Sulfo-NHS (50mg/ml)，高速振荡 30s,室温避光振摇20min，然后用500μ 1 0. OlM pH7. 4PBS洗涤2次，每次12000r/min离心!3min， 弃上清，最后用100 μ L 0. OlM pH7. 4PBS悬浮微球。(2)微球的交联取抗-GFAP单克隆抗体IOOyg加入到活化后的微球中，用 0. 01MpH7. 4PBS定容至500 μ 1，锡箔纸包裹，室温避光振摇4h，15000r/min离心5min，弃上清，再用500 μ 1 PBS洗1次，15000r/min离心5min，弃上清。用Iml封闭液(PBS，1 % BSA, 0. 1% Proclin 300)悬浮微球，中速振荡15s，室温避光振摇45min, 15000r/min离心5min，弃上清；加入 1. 5ml 微球储存液(0. OlM pH7. 4PBS，0. 1% BSA，0. 02% Tween,0. 1% Proclin300)，洗涤微球2次，每次15000r/min离心7min，弃上清，最后用Iml微球储存液悬浮包被上了 GFAP单抗的微球，计数后4°C避光保存。步骤二酶结合物的制备取5mgHRP溶于Iml NaHCO3,搅拌过程中加入含1 % 2，4_ 二硝基氟苯的无水乙醇 0. 1ml，室温避光搅拌Ih ；加入Iml 0. 06M NaIO4室温下避光轻搅30min ；加入Iml 0. 16M的乙二醇，室温下继续搅拌lh，用0. OlM pH9. 6的碳酸盐缓冲液4°C透析过夜。透析袋中加入 5mg抗-GFAP多克隆抗体，用0. 05mol/L,pH9. 6碳酸盐缓冲液4°C透析20小时，中间换液3 次。取透析后结合液加入5mg/mL NaHB4O. 2mL，搅拌30min后，4°C放置4h ；加50%饱和硫酸铵溶液6mL沉淀结合物，置4°C 30min后，4°C 3000r/min离心30min，取沉淀，将沉淀溶于 0.01M !17.4 85中，用0.0说pH7. 4PBS 4°C透析过夜，最后将透析袋中的酶结合物收集，分装，-20°C保存。使用ELISA法测定其效价。步骤三标准品的制备标准品为lOOng/ml的GFAP重组抗原冻干粉。使用前用样品稀释液溶解并稀释至设定浓度。步骤四样品稀释液、底物A、底物B、洗涤液的配制(1)样品稀释液牛血清白蛋白(BSA) IOgProclin 300ImlTween 200. 3ml0. OlM pH7. 4PBS 定容至 1000ml，过滤除菌，4°C保存。(2)底物 A 鲁米诺0. 53g对碘苯酚 0. 22g0. OlM pH7. 4PBS 定容至 1000ml，过滤除菌，4°C保存。(3)底物 B 过氧化脲 0. 282g0. OlM pH7. 4PBS 定容至 1000ml，过滤除菌，4°C保存。(4) 2O X 洗涤液纯化水定容至1000ml，并调pH至7. 4，过滤除菌，4°C保存。实施例21.聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒，由1块96孔过滤板、2瓶
氯化钠
十二水合磷酸氢二钠磷酸二氢钾氯化钾
4g
4.8g
IOml
160g 72.64g
Tween 20标准品、1瓶样品稀释液、表面已偶联有抗-GFAP抗体的聚苯乙烯微球、1瓶微球储存液、1瓶酶结合物、1瓶底物A 1瓶、底物B 1瓶、20X洗涤液、20片不干胶封片和1份使用说明书构成。2.聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒的应用(1)标准品的稀释每瓶临用前以样品稀释液稀释至lml，静置IOmin后，反复颠倒混勻，浓度为 100ng/ml，做系列稀释，分别为:100ng/ml、50ng/ml、12. 5ng/ml、3. 12ng/ml、 0. 78ng/ml、0. 05ng/ml，样品稀释液为 Ong/ml。(2)加样微球使用前中速振荡混勻，每孔加入10 μ 1约含50000个包被GFAP单抗的微球，用100 μ 1洗涤液真空抽滤洗涤2次后，每孔分别加标准品或待检测样本50 μ 1， 另设一孔为空白，混勻，37°C振荡30min。(3)洗板使用真空泵抽滤，洗涤液洗涤3次。(4)加酶结合物加入50 μ 1酶结合物，混勻，37°C振荡30min。(5)洗板同⑶洗涤3次。(6)加底物每孔先后加入底物液A、底物液B各50 μ 1，避光显色IOmin。(7)测定避光显色IOmin后在化学发光仪上读出各孔相对发光度(RLU)。(8)标准曲线的制作以标准品的浓度为横坐标，RLU值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的RLU由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的RLU代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。实施例3对聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的检测试剂盒的评价(1)线性范围用样品稀释液将GFAP抗原以2倍梯度稀释以下系列浓度100ng/ ml、50ng/ml、12.5ng/ml、6. 25ng/ml、3. 13ng/ml、l.56ng/ml、0. 39ng/ml、0. 10ng/ml、 0. 025ng/ml、0. 013ng/ml,Ong/ml进行检测，每个浓度样本重复检测3次，以样本浓度为横坐标，相对发光强度为纵坐标作图，经过统计学分析，线性范围在0. 025ng/ml lOOng/ml。(2)最低检出限将去除GFAP的零值血清分成20份进行检测，测定其浓度，计算平均值及标准差，计算平均值与标准差的2倍之和，在标准曲线上查出本发明的最低检测线为 17pg/ml。(3)精密度a 每10 μ 1微球的精密度评价微球储存液中速振荡混勻后，使用微量移液器连续20次吸取微球，每次10 μ 1，计数，计算其平均值和方差，计算精密度CV为0. 7%，即若每次混勻后，准确取样，则每10 μ 1储存液中微球数为49940士352个。b 本发明试剂盒精密度评价测定GFAP浓度为0. 78ng/ml、3. 12ng/ml、12. 5ng/ml 的质控血清，重复检测3次，每次重复10孔，进行批内精密度测定。结果见表1。3份样本每日测定1次，连续测定20天，进行批间精密度测定。结果见表2.表1批内精密度测定结果
权利要求
1.一种聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒，由96孔过滤板、标准品、样品稀释液、表面已偶联有抗-GFAP抗体的聚苯乙烯微球、微球储存液、酶结合物、底物A、底物B、20X洗涤液组成，其特征在于所述96孔过滤板是底部有渗透性的滤膜并能通过抽真空进行洗涤的一种微孔板；所述标准品为浓度为lOOng/ml的GFAP蛋白冻干粉； 所述样品稀释液为每升含IOg牛血清白蛋白、Iml Proclin 300,0. 3ml Tween 20的0. OlM pH7. 4PBS ；所述微球储存液为每升含 0. 1% BSA.0. 02% Tween,0. 1% Proclin 300 的 0. OlM pH7. 4PBS ；所述酶结合物为辣根过氧化酶标记的GFAP 二抗；所述底物A为3mmol/L鲁米诺与lmmol/L对碘苯酚的混合液；所述底物液B为3mmol/L的双氧化脲溶液；所述20 X洗涤液为每升含160g氯化钠、72. 64g十二水合磷酸氢二钠、4g磷酸二氢钾、氯4. 8g化钾、IOml Tween 20的水溶液。
2.如权利要求1所述聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒，其特征在于所述表面已偶联有抗-GFAP抗体的聚苯乙烯微球上的抗-GFAP抗体为单克隆抗体。
3.如权利要求1所述聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒，其特征在于所述辣根过氧化酶标记的GFAP 二抗为多克隆抗体。
4.如权利要求1所述聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由1块96孔过滤板、2瓶标准品、1瓶样品稀释液、表面已偶联有抗-GFAP抗体的聚苯乙烯微球、1瓶微球储存液、1瓶酶结合物、1瓶底物A 1瓶、底物B 1瓶、20X洗涤液、20片不干胶封片和1份使用说明书构成。
5.权利要求1所述聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒的应用，步骤是(1)标准品的稀释每瓶标准品临用前以样品稀释液稀释至1ml，静置IOmin后，反复颠倒混勻，浓度为 100ng/ml，做系列稀释，分别为:100ng/ml、50ng/ml、12. 5ng/ml、3. 12ng/ ml、0. 78ng/ml、0. 05ng/ml，样品稀释液作为 Ong/ml ；(2)加样微球使用前中速振荡混勻，每孔加入10μ1微球储存液，其中含50000士400 个表面已偶联有抗-GFAP抗体的聚苯乙烯微球，用100 μ 1洗涤液真空抽滤洗涤2-3次后， 每孔分别加标准品或待检测样本50 μ 1，另设一空为空白，混勻，37°C振荡30min ；(3)洗板使用真空泵抽滤，洗涤液洗涤3-4次；(4)加酶结合物加入50μ 1酶结合物，混勻，37°C振荡30min ；(5)洗板同(3)洗涤3-4次；(6)加底物每孔先后加入底物液A、底物液B各50μ 1，避光显色IOmin ；(7)测定避光显色IOmin后在化学发光仪上读出各孔相对发光度；(8)标准曲线的制作以标准品的浓度为横坐标，RLU值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的相对发光度由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的相对发光度代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
全文摘要
本发明公开了一种聚苯乙烯微球定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒，由96孔过滤板、标准品、样品稀释液、表面已偶联有抗-GFAP抗体的聚苯乙烯微球、微球储存液、酶结合物、底物A、底物B、20×洗涤液、不干胶封片和使用说明书组成。本发明中的试剂盒将固相载体由传统的微孔板改为聚苯乙烯微球，抗原抗体的反应发生在液相中，不仅有利于二者保持生物活性和正确的空间构象，还可消除传统反应模式的表面张力和空间障碍对抗原抗体反应的影响，以上两点均有利于二者之间的反应，可以有效缩短反应时间与洗涤次数，同时本发明具有操作简单、灵敏度高、特异性好、成本低的特点，对急性脑出血早期病情程度的诊断具有重要的临床意义。
文档编号G01N33/577GK102411056SQ201110306638
公开日2012年4月11日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者丁兴龙, 张增丽, 朱之炜, 李夫东, 江长林, 王佳颖, 王恒, 郑祖惠, 韩娟 申请人:山东莱博生物科技有限公司