专利名称：一种检测蛋白质和金属离子的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种检测蛋白质和金属离子的方法。
背景技术：
蛋白质是人体中重要的生物大分子，它不仅对于维持生命是十分重要和必不可少的，同时，它对于生命遗传密码的翻译、信息的转录、DNA的复制等都有密切关系。蛋白质在体液中的含量可作为人体营养健康、疾病诊断的重要指标，如尿蛋白的含量是诊断肾炎和糖尿病的依据之一，正常人24h尿中蛋白质的含量在20 80mg，超过了这一限度为不正常值，是发病的征兆。如血清蛋白是人体内的一种重要生命物质，它在体液中的含量可作为人体营养健康、疾病诊断等的重要指标。又如Alzheimer病(AD)是一组原因不明的中枢神经系统原发性变性疾病，目前仍是一种不可治愈的疾病，量化测定脑脊液中的Tau蛋白可能成为AD早期诊断的一项有用指标，生物学测定，如脑脊液Tau蛋白测定，可能帮助临床医生达到早期诊断和预防AD的目的。因此，对特定蛋白质的痕量检测可以实现疾病的早期诊断，从而提早治疗、延长病人生命。金属离子在环境、生物和医学领域扮演着重要的角色，其浓度、种类以及价态对生命活动和环境都有重要影响。比如钾、铁、锌等金属离子是生命体维持正常生理活动的必需元素。而一些重金属离子，由于在环境中不能分解并会通过食物链逐渐在生物链上层富集， 易造成慢性中毒。据《北京青年报》报道自1974年以来，陕西华县龙岭村共死亡58人，死于癌症的四人，死于肺心病、脑血管病的22人，仅1人属于自然死亡。经查该地土壤主要受到铅和砷的污染，而当地村民食用的面粉则受到铅、砷、锌、铬4种元素的严重污染，豆角中镉、铅的含量分别为标准值的5. 3倍及2. 55倍，属严重污染的蔬菜。因此，对金属离子的检测在环境监测和疾病诊断等方面具有重要的意义。目前，对于金属离子检测主要使用原子发光和吸收光谱，该方法虽然具有灵敏度高、准确度高等优点，但是需要使用大型仪器， 检测成本较高，不利于广泛推广。因此，需要开发一种简单、快速、高选择性、高灵敏度的金属离子检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是针对现有的检测方法的缺陷，提供一种操作简单，灵敏度高、选择性强的检测蛋白质和金属离子的方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案一种检测蛋白质和金属离子的方法，提供带报告荧光基团的可以与靶目标特异性结合的探针分子；将所述探针分子与富含π电子的纳米材料溶液混合，然后加入待测样品，检测荧光；其中，所述靶目标为蛋白质和金属离子，所述富含π电子的纳米材料选自单体为苯二胺、3，4_乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共轭聚合物，银(1)-4，4’_联吡啶、铜(11)-4，4’_联吡啶、氯钼酸_3，3’，5，5’ -四甲基联苯二胺、氯钼酸-对苯二胺或四氯合金酸_4，4’ -联吡啶配位聚合物、吓啉簇集体、介孔碳和纳米C6(1。随着DNA体外进化技术的发展，探针DNA分子序列的筛选和合成的成本越来越低，因此基于DNA分子的检测平台具有广阔的应用前景。DNA分子与蛋白质的特异性识别作用是近年来的研究热点，广泛的用于特定蛋白的识别和检测，如瑞典乌普萨拉生物医学中心的Landegren等人用DNA作为探针实现了对PDGF蛋白的高灵敏度和高选择性检测， 其最低检测浓度为 40Xl(T21mol[Fredriksson，S. Gullberg, Μ. Jarvius, J. ；Olsson, C.； Pietras,K. ；Gustafsdottir, S. Μ. ；Ostman,Α. ；Landegren,U. , Nat.Biotechnol,2002,20, 473-477]。特殊筛选的DNA序列能够与金属离子形成稳定的配合物，表现出作用的特异性， 如一种Hg2+离子的比色检测方法，利用Hg2+离子与DNA序列AGR0100中T碱基的作用，检测限为 50nM[Li, Τ. ；Dong, S. J. ；Wang，Ε. K.，Anal Chem，2009，81，2144-2149]。经过体外进化筛选的DNA分子，能够与有机小分子发生特异性识别作用，从而诱导DNA分子构象的变换，如新加坡国立大学的Liu等人利用荧光标记的DNA与ATP的选择作用，实现了对ATP的选择性检测，其检测限为 20 μ M[Wang, Y. ；Liu, B.，Analyst，2008，133，1593-1598]。本发明检测蛋白质和金属离子的方法利用π-π相互作用，将与靶目标特异性结合的探针分子吸附在富含η电子的纳米材料表面，淬灭探针分子的荧光，然后探针分子与待测样品混合，探针分子与靶目标结合，使探针分子从纳米材料表面脱离，荧光淬灭作用消失，通过检测荧光信号实现对待测样品的检测。而且根据荧光强度变化，还可确定待测样品中靶目标的含量。本发明所述检测蛋白质和金属离子的方法成本低廉，所述富含η电子的纳米材料制备方法简单，原材料价格低廉，且能大规模制备；操作简单，检测过程中只需要将富含η电子的纳米材料、探针分子和待测样品混合，使用简单的荧光检测仪器检测荧光，不需要使用价格昂贵的大型分析仪器；检测性能优异，检测时间短、灵敏度高，是一种简便、快速、成本低、应用范围广的检测蛋白质和金属离子的方法。
图1示本发明所述检测方法的原理示意图，其中，球形只代表富含π电子的纳米材料，并不表明材料本身为球形，靶目标包含蛋白质和金属离子；探针DNA折叠代表其构象发生改变，但不仅限于折叠；图2示聚间苯二胺纳米棒检测凝血酶蛋白的结果图。a为探针DNAQOiiMTa)的荧光发射谱；b为探针DNAQOnM Ta)+目标蛋白(IOOnM Tb)的荧光发射谱；c为探针DNAQOnM Ta)+目标蛋白(IOOnM TB)+PMPD纳米棒的荧光发射谱；d为探针DNA QOnM TA)+PMPD纳米棒的荧光发射谱；e为PMPD纳米棒自身的荧光发射谱；图3示聚间苯二胺纳米棒对凝血酶的特异性选择结果图；另外两种干扰蛋白分别为牛血清白蛋白(BSA)和人的免疫球蛋白(IgG)，浓度均为ΙΟΟηΜ。图4示介孔碳微粒检测人血清样本中凝血酶的结果；图5示纳米C6Q(nan0-C6Q)对金属离子Hg2+的检测结果图，探针DNAOV IOOnM)在不同条件下的荧光发射谱(a) PH, (b) PH+Hg2+ (8 μ Μ), (c) PH+nano-C60, (d) PH+nano-C60+Hg2+ (8 μ Μ)；图6示Iian0-C6tl对金属离子Hg2+的选择性结果图。其中，Hg2+浓度为8 μ M图A中其它干扰离子的浓度为5 μ M，图B中其它干扰离子的浓度为50 μ M ；图7示Iian0-C6tl检测湖水中金属离子Hg2+的结果图。a为湖水的荧光发射谱，b为湖水+30nM Hg2+的荧光发射谱。
具体实施例方式本发明实施例公开了一种检测蛋白质和金属离子的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案提供带报告荧光基团的可以与靶目标特异性结合的探针分子；将所述探针分子与富含π电子的纳米材料溶液混合，然后加入待测样品，检测荧光；其中，所述靶目标为蛋白质和金属离子，所述富含π电子的纳米材料选自单体为苯二胺、3，4_乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共轭聚合物，银(1)-4，4’_联吡啶、铜(11)-4，4’_联吡啶、氯钼酸_3，3’，5，5’ -四甲基联苯二胺、氯钼酸-对苯二胺或四氯合金酸_4，4’ -联吡啶配位聚合物、吓啉簇集体、介孔碳和纳米C6(1。本发明所述检测蛋白质和金属离子的方法将与靶目标特异性结合的探针分子与富含η电子的纳米材料混合，由于η-η相互作用，探针分子吸附在材料表面，之后探针分子上报告荧光基团同富含η电子的纳米材料间发生能量转移可将荧光基团发射的荧光淬灭。加入待测样品后，待测样品中的靶目标与探针分子结合，使探针分子从纳米材料表面脱离，荧光淬灭作用消失，探针分子恢复荧光，通过检测荧光信号实现对待测样品的检测。而且根据荧光强度变化，还可确定待测样品中靶目标的含量。本发明所述探针分子带有报告荧光基团，可以在探针分子3’端或5’端标记报告荧光基团，也可以在3’端和5’端同时标记报告荧光基团，以提高荧光强度，提高检测的灵敏度。探针标记的报告荧光基团包括但不限于以下荧光物质FAM、TET、J0E、VIC、HEX、R0X、 TAMRA, CY3、CY3. 5、CY5、CY5. 5、Oregon Green、CAL Red、Red640 和 iTexas Red。本发明所述富含π电子的纳米材料选自单体为苯二胺、3，4_乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共轭聚合物。其中，所述共轭聚合物的制备方法为将单体和氧化剂的溶液按照摩尔比1 0.1 20混合，放置Imin Mh，制得。所述单体为苯二胺、3，4-乙烯二氧噻吩或苯乙烯，所述氧化剂优选为过硫酸铵或三氯化铁。本发明所述配位聚合物为银(1)-4，4’_联吡啶、铜(11)-4，4’_联吡啶、氯钼酸-3， 3’，5，5’-四甲基联苯二胺、氯钼酸-对苯二胺或四氯合金酸_4，4’-联吡啶配位聚合物，由含η电子的4，4’_联吡啶和四甲基联苯二胺分子作为单体，过渡金属离子银、铜、钼或金作为引发剂，聚合而成。所述配位聚合物的制备方法为将过渡金属离子和含η电子的有机分子的溶液按照摩尔比1 0. 1 20混合，放置Imin Mh，制得。有机分子簇集体是在水或水与有机溶剂的混合体系中，有机分子在疏水亲脂作用驱动下，相互靠近形成的简单分子集合体。本发明所述卟啉簇集体是由含η电子的卟啉分子在水与有机溶剂的混合溶液中相互靠近簇集而成。其中，所述卟啉簇集体的制备方法为含η电子的卟啉分子溶解在有机溶剂中获得浓度为lmmol/L 0.5mol/L的溶液，然后按照体积比为0. 001 1 1与水混合，放置Imin Mh，制得。其中，所述有机溶剂优选为甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、二甲基亚砜、四氢呋喃或N-甲基吡咯烷酮。本发明所述介孔碳和纳米C6tl均属于碳材料，其中，所述介孔碳的制备方法为通过浸渍法将碳源前驱物引入介孔氧化硅的孔道中，在酸催化下使前驱物热分解并沉积在模板介孔材料的孔道内，煅烧碳化制得碳硅复合物，然后移除硅模板，制得介孔碳。其中，所述碳源前驱物优选为葡萄糖、蔗糖乙炔、中间相浙青、呋喃甲醇、苯酚/甲醛树脂。本发明所述纳米C6tl的制备方法为将C6tl粉末溶解在丙酮中，然后与乙腈混合，收集土黄色沉淀，然后均勻分散在水中制得。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。其中，本发明在实施例中以人凝血酶蛋白为检测的目标蛋白(TB)，将荧光团(FAM) 修饰的对人凝血酶蛋白有特异性识别能力的单链DNA序列作为荧光检测蛋白的荧光探针 (TA)。在实施例中以Hg2+和Ag+分别作为检测的目标金属离子，将荧光团(FAM)修饰的富含 T碱基的对Hg2+有特异性结合能力的单链DNA序列作为荧光检测Hg2+的探针DNA (Ph)，将荧光团(FAM)修饰的富含C碱基的对Ag+有特异性结合能力的单链DNA序列作为荧光检测Ag+ 的探针DNA (PAg)。各探针序列详见表1。表1相关探针序列
权利要求
1. 一种检测蛋白质和金属离子的方法，其特征在于， 提供带报告荧光基团的可以与靶目标特异性结合的探针分子； 将所述探针分子与富含η电子的纳米材料溶液混合，然后加入待测样品，检测荧光； 其中，所述靶目标为蛋白质和金属离子，所述富含η电子的纳米材料选自单体为苯二胺、3，4-乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共轭聚合物，银(I)-4，4’ -联吡啶、铜(II)-4，4’ -联吡啶、氯钼酸_3，3’，5，5’ -四甲基联苯二胺、氯钼酸-对苯二胺或四氯合金酸_4，4’ -联吡啶配位聚合物、吓啉簇集体、介孔碳和纳米C6(1。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种检测蛋白质和金属离子的方法，该方法为提供带报告荧光基团的可以与靶目标特异性结合的探针分子；将所述探针分子与富含π电子的纳米材料溶液混合，然后加入待测样品，检测荧光；其中，所述富含π电子的纳米材料选自单体为苯二胺、3，4-乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共轭聚合物，银(I)-4，4’-联吡啶、铜(II)-4，4’-联吡啶、氯铂酸-3，3’，5，5’-四甲基联苯二胺、氯铂酸-对苯二胺或四氯合金酸-4，4’-联吡啶配位聚合物、卟啉簇集体、介孔碳和纳米C60。本发明所述检测方法成本低廉，操作简单，检测时间短、灵敏度高，应用范围广。
文档编号G01N21/64GK102507952SQ20111030663
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者孙旭平, 张瑛洧, 王磊 申请人:中国科学院长春应用化学研究所