用于检测血清或者血浆中油酸浓度的试剂盒及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物检测领域，涉及一种检测试剂盒，具体来是一种用于检测血清或者血浆中油酸(oleicacid,oa)浓度的试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术：

油酸(oleicacid,oa)是一种单不饱和omega-9脂肪酸,分子式c18h34o2。人体血液内的油酸分为外源性油酸和内源性油酸，外源性油酸来源于饮食摄取，内源性油酸通过硬脂酰辅酶a去饱和酶(stearoyl-coenzymeadesaturase,scd)催化饱和脂肪酸生成。油酸是游离脂肪酸(freefattyacid，ffa)中的主要成分，肝糖耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪成为游离脂肪酸来充当能源使用。正常情况下，ffa是三大能源物质，糖、蛋白质和脂肪代谢的重要一环，与非酒精性脂肪肝(nonalcoholicfattyliverdisease，nafld)、动脉粥样硬化和糖尿病等代谢性疾病的发生发展密切相关。研究发现在肝细胞中oa可通过干扰胰岛素受体底物磷酸化、激活磷脂酰肌醇3等，导致葡萄糖摄取或糖原合成下降，即产生肝细胞胰岛素抵抗。在动物实验中证实血浆脂肪酸短期升高能引起大鼠肝脏和外周胰岛素抵抗，其中以oa为代表的单不饱和脂肪酸，诱导肝胰岛素抵抗的作用显著强于多不饱和脂肪酸。几年来发表的相关学术论文中，多数以oa来诱导来制备肝细胞/大鼠胰岛素抵抗模型。

胰岛素抵抗(insulinresistance，ir)是指胰岛素靶组织，包括肝脏、肌肉和脂肪组织对胰岛素的敏感性降低，是多种代谢性疾病，包括血脂异常、高血压、中心性肥胖、2型糖尿病(type2diabetes,t2d)、非酒精性脂肪肝(nafld)的共同病理生理基础。在我国及欧美nafld诊疗指南中均明确指出，nafld是一种与ir和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤，除了心脑血管病、2型糖尿病，nafld也是2l世纪全球重要的公共健康问题之一，亦是我国愈来愈重视的慢性肝病问题。但遗憾的是nafld至今没有有效的实验室诊断指标。

oa是体内甘油三酯水解产物，是诱导胰岛素抵抗、特别是肝胰岛素抵抗的重要因素，表明血浆/血清oa水平可能成为机体出现ir和/或nafld的早期预警、早期诊断的标志物。oa是一种单不饱和脂肪酸，常规方法难以定量检测。目前在国内外基于超高效液相色谱串联质谱(uhplc-ms/ms)定量检测oa的方法和试剂盒尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种超高效液相色谱串联质谱(uhplc-ms/ms)技术用于检测血清或者血浆中oa浓度的试剂盒和方法，所述的这种用于检测血清或者血浆中oa浓度的试剂盒和方法要解决现有技术中检测血清或者血浆中oa浓度的方法复杂，准确性不高的技术问题。

本发明提供了一种用于检测血清或者血浆中油酸浓度的试剂盒，包括流动相a、流动相b、标准物储备液、同位素内标物储备液、样本萃取液和稀释液，所述的流动相a为超纯水，所述的流动相b为甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，所述的标准物储备液为20mg/ml的油酸溶液，所述的同位素内标物储备液为20mg/ml的oa-[¹³c5]溶液，所述的样本萃取液为甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，所述的稀释液为不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白的浓度为50mg/ml。

本发明还提供了上述的一种检测血清或者血浆中油酸浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)一个制备流动相a的步骤，将超纯水超声脱气备用；

2)一个制备流动相b的步骤，将甲醇加入到乙腈中，甲醇和乙腈的体积比为1：1，混合均匀并超声脱气备用；

3)一个制备标准物储备液的步骤，称取油酸标准品，用自动取样器加入甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，加入后油酸的浓度为20mg/ml，完全溶解后放置于-20℃冰箱中保存备用；

4)一个制备同位素内标物储备液的步骤，称取oa-[¹³c5]加入到甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，加入后oa-[¹³c5]的浓度为20mg/ml，完全溶解后于-20℃冰箱中保存备用；

5)一个制备样本萃取液的步骤，取甲醇和乙腈，按照体积比1:1组成溶液，混匀、备用；

6)一个制备稀释液的步骤，称取牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白不含游离脂肪酸，将牛血清白蛋白加入到磷酸缓冲盐溶液中，使得牛血清白蛋白的浓度为50mg/ml。

本发明还提供了采用上述的试剂盒检测血清或者血浆中oa浓度的方法，包括如下步骤：

1)一个制备标准工作液和质控品的步骤；在稀释液中加入标准物储备液，稀释成10、25、50、100、500、1000μg/ml的标准工作液，另外配制成25、500μg/ml的溶液作为质控品。

2)一个制备同位素内标物工作液的步骤，用样本萃取液将同位素内标物储备液稀释成100μg/ml的工作液，存放于4℃冰箱中备用。

3)一个制备含有同位素内标物的样本萃取液步骤，取同位素内标工作液与样本萃取液按1:14的体积比混匀。

4)一个制备样本的步骤，样本经室温平衡1小时后，使用0.22μm一次性滤器过滤，然后准确移取10μl过滤后的样本加入1.5mlep管中，加入上述3)含同位素内标的样本萃取液100μl，涡旋振荡2min，以10000rpm的转速离心20分钟，转移上清液至液相色谱检测专用96孔板中。所有的标准曲线及质控品均按照样本处理。

5)一个超高效液相色谱分析的步骤，色谱参数为：超纯水组成的流动相a；甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的流动相b溶液；梯度洗脱，b相起始为5％，流速为300μl/min，进样体积为5μl。oa及内标的保留时间均为3.11min，分析时间为12min。

6)一个质谱分析步骤，质谱参数：自动进样器温度为4℃，柱温为40℃，使用电喷雾电离源负离子模式和多反应监测模式分析，oa和同位素内标oa-¹³c5检测的离子质荷比(m/z)为281.3/281.3、286.3/286.3。雾化气、雾化辅助加热气、气帘气和碰撞气分别为55psi、55psi、40psi和6psi，雾化辅助加热气加热温度为450℃。去簇电压、入口电压、出口电压和喷雾电压分别为-100v、-10v、-5v和-4500v。oa和oa-[¹³c5]碰撞能量为-30v。

7)将步骤4)制备的标准品溶液依次从低浓度到高浓度进样，每个混合标准品溶液连续进样3次，采用步骤5)和步骤6)的液相色谱串联质谱的方法分析。以油酸与同位素内标oa-[¹³c5]浓度比为x轴，油酸与同位素内标的峰面积比为y轴，进行线性回归，得到油酸的标准曲线。

8)采用步骤5)和步骤6)的液相色谱串联质谱的方法分析步骤4)的待测样品和质控品，根据标准曲线计算样本浓度。

本发明提供的试剂盒和色谱、质谱分析参数，测定血清或血浆中oa线性范围为10～1000μg/ml，批间精密度≤2.8％、批内cv≤3.5％。试剂盒4℃放置24h、五天和十天后，同一组样本oa的浓度与初始值比较，误差为0～5％，表明试剂盒和样品稳定性良好。经过初步临床检测分析，50例健康成人空腹血清oa参考范围为113.2±58μg/ml，100例nafld患者空腹血清水平分别为328.1±196.7μg/ml,66例单纯t2dm和43例t2dm合并nafld患者分别为407.2±202.9μg/ml、453.8±241.6μg/ml，均显著高于健康对照组，且t2dm、t2dm合并nafld组血清oa水平显著高于单纯nafld组。在50例健康体检者中，血清oa水平与体重、homa-ir呈显著正相关(p<0.05)。按病例组分开分析，血清oa水平与t2dm患者fpg、homa-ir呈显著正相关，与nafld患者fpg、ins、homa-ir均呈正相关。血清oa水平与homa-ir辅助诊断胰岛素抵抗的一致率达65.3％。初步临床分析证实血清oa辅助判断ir的auc值为o.689、联合空腹血糖(fpg)则auc值上升到0.806，血清oa辅助判断nafld的auc值为0.738、联合血清alt值则auc值上升到0.774.表明动态监测血清活血浆oa水平在辅助诊断机体胰岛素抵抗和nafld以及其病情判断中具有重要的临床应用价值。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明是一种快速、稳定、可靠的诊断、治疗及疗效监测油酸代谢异常相关性疾病的有效工具，适用于临床常规和大样本流行病学调查的定量检测方法。

附图说明：

图1显示了以流动相a、b进行梯度洗脱，oa及内标的保留时间均为3.11min，分析时间为12min。

图2为空白样本检测图，可见在oa及内标通道均无干扰峰存在。

图3显示了油酸(oa)的检测线性范围。

图4.显示油酸单独及联合空腹血糖辅助判断胰岛素抵抗的roc曲线

图5显示油酸单独及联合血清转氨酶辅助判断nafld的roc曲线

具体实施方式：

实施例1血清或者血浆油酸(oa)含量的超高效液相色谱串联质谱(uhplc-ms/ms)检测方法的建立

一、仪器：高效液相色谱仪agilent1290uplc(agilent，usa)、串联三重四极杆质谱仪abapi5000(absciex,usa)，mettlertoledo天平(max＝220g，d＝0.1mg)(mettler，germany)、sb-c18快速分离高通量窄径柱(2.1mm*100mm*1.8μm)(agilent，usa)，eppendorf5424r低温高速离心机(eppendorf,germany)。

二、商购试剂：油酸标准品购自sigma公司，纯度为98.0％；油酸同位素标记物oa-[¹³c5]购自isosciences公司，同位素浓度为1030±1μg/ml；甲醇(lc//ms/ms级)、乙腈(lc//ms/ms级)、甲酸(lc//ms/ms级)均购自美国fisher公司。试验用水由milli-qintegral超纯水机(德国，默克密理博，merckmillipore)制备。

三、流动相配制：

1.流动相a：超纯水

2.流动相b：(体积比)50％甲醇：50％乙腈溶液

四、储备液和工作标准液的配制

1.20mg/mloa纯物质储备液的配制：称取oa200mg，准确称量至0.1mg。将其转移至10ml容量瓶中，用自动取样器加入10ml，0.1％叠氮钠水溶液。轻轻摇动锥形瓶，使其完全溶解。用封口膜密封瓶口，置于冰箱4小时，取出后将储备液分别装入1.5mlep管中，密封并保存于-20℃冰箱中。

2.20mg/mloa-[¹³c5]同位素内标物储备液的配制：方法同oa纯物质储备液的配制。

五、标准工作液和质控品的制备：

在不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白(50mg/mlinpbs)中加入标准品储备液，稀释成10、25、50、100、500、1000μg/ml的标准工作液作标准曲线，另外配制成25，500μg/ml的溶液作为质控品。甲醇：乙腈(1:1)溶液将同位素内标物储备液稀释成100μg/ml的工作液，然后再与甲醇:乙腈(1:1)以体积比1:14比例混合，制备含有内标物的样本提取液。

六、实验步骤：

1.血清样品的制备

取10ul待测血清或血浆样本、标准工作液、质控品，室温平衡1h后，加入100ul含有同位素内标的样本萃取液，涡旋振荡2min，以10000g的转速离心10分钟，转移上层清液至液相色谱检测专用96孔板中。所有的标准曲线及质控品均按照样本处理。

2.色谱条件

流动相a组成为超纯水溶液，b为甲醇乙腈溶液(体积比1：1)，梯度洗脱，b相起始为5％，流速为300μl/min，进样体积为5μl。oa及内标的保留时间均为3.11min，分析时间为12min。

3.质谱条件

自动进样器温度为4℃，柱温为40℃，使用电喷雾电离源负离子模式和多反应监测模式分析，oa和同位素内标oa-[¹³c5]检测的离子质荷比(m/z)为281.3/281.3、286.3/286.3。雾化气、雾化辅助加热气、气帘气和碰撞气分别为55psi、55psi、40psi和6psi，雾化辅助加热气加热温度为450℃。去簇电压、入口电压、出口电压和喷雾电压分别为-100v、-10v、-5v和-4500v。oa和oa-[¹³c5]碰撞能量为-30v。

4.方法学验证

1)标准曲线和定量限

对于定量限(lowerlimitofquantification,lloq)的要求是准确度在80～120％之间，精密度(变异系数cv)≤20％。考察方法为将标准工作溶液依次从低浓度到高浓度进样，每个标准品溶液连续进样3次，以oa与同位素内标物oa-[¹³c5]浓度比为x轴，oa与同位素内标oa-[¹³c5]的峰面积比为y轴，进行线性回归，得到oa的标准曲线、相关系数(r)和线性范围。

以最低浓度标准工作溶液采用逐步稀释的方法来考察oa的lloq，将信噪比s/n(signal/noise)为10时的标准品浓度作为待测化合物的lloq。

2)精密度(批内、批间)和准确度

一般情况下，不精密度的可接受标准为3倍lloq浓度以内，cv<20％；其余浓度点cv<15％。考察方法为在空白血清中分别配制浓度为25、500μg/ml的oa质控品，重复测定6批，每批每个样品重复测定3次，计算cv以评价批间精密度，计算相对误差以评价准确度。另对两个浓度的血清样本平行处理20管以评价批内精密度。

3)稳定性

样品的稳定性可能影响检测结果，由于实验样本一般保存于4℃冰箱或置于液相进样系统(4℃)中，因此本实验通过检测于4℃保存的样品在保存一天、五天及十天后的浓度，并与初始值比较以观察其稳定性。

4)携带污染

先测定低浓度样本10μg/ml10次，再测定高浓度样本1000μg/ml10次，再测定低浓度样本10μg/ml10次，分析两批次低浓度样本均值间的统计学差异。七、实验结果：

1.uplc-ms/ms技术测定oa方法的建立

检测oa时，离子质荷比(m/z)为281.3/281.3，测定同位素内标oa-[¹³c5]时，选择离子质荷比286.3/286.3。利用超水溶液和50％甲醇:50％乙腈溶液为流动相，oa的保留时间为3.11min，分析时间为12min(见图1)。图2为空白样本检测图，可见在oa及内标通道均无干扰峰存在。

2.方法学评价

1)标准曲线和定量限

以oa与内标的浓度比为x轴，oa与内标的峰面积比为y轴，进行线性回归，得回归方程为y＝0.7009x+0.2158，r＝0.9940，表明oa在10～1000μg/ml血清浓度范围内线性关系良好，方法的lloq为10μg/ml，线性范围和定量限均满足对人体血清样本的检测。见表1、图3。

表1oa的标准曲线和相关系数

2)精密度(批内、批间)和准确度

本方法的批内精密度cv≤3.5％、批间精密度≤2.8％，方法精密度好；相对误差≤3.7％，说明准确度好，适合血清样本的测定。结果见表2、3。

表2批间准确度、精密度

表3批内精密度、仪器精密度

3)稳定性

观察3个浓度血清样本在4℃放置24h、五天和十天后oa的浓度与初始值比较，误差为0～5％，表明样品稳定性良好。结果见表4

表-4稳定性结果

4)携带污染

先测定低浓度样本10μg/ml10次，再测定高浓度样本1000μg/ml10次，再测定低浓度样本10μg/ml10次，两批次低浓度样本均值间无统计学差异。见表-5。

表-5携带污染结果

实施例2oa检测临床初步应用

一、研究对象

血清样本采集于上海市东方医院完成。

nafld组：受试者为2016年12月至2017年2月间在该院中医科脂肪肝专病门诊确诊为nafld的患者100例，其中男42例，女58例，平均年龄55.6岁。

诊断标准：

(1)无饮酒史或饮酒折合乙醇量小于140g/周(女性＜70g/周)；

(2)除外病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性、自身免疫性肝病等可导致脂肪肝的特定疾病；

(3)肝脏超声检查符合弥漫性脂肪肝的诊断标准；

(4)血清丙氨酸氨基转移酶(alt)或天门冬氨酸氨基转移酶(ast)、γ-谷氨酰基转移酶(ggt)持续增高半年以上。

t2dm组：受试者为2016年12月至2017年2月间在该院内分泌科门诊确诊为t2dm的患者109例，其中伴有nafld43例，平均年龄57.2岁。

t2dm诊断标准：

(1)糖尿病症状(多饮、多食、多尿、体重减轻)+随机血糖≥11.1mmol/l；

(2)fpg≥7.0mmol/l；

(3)ogtt实验中，2hpg≥11.1mmol/l。

满足以上任意一项，使用任一方法复查确认后，诊断成立。

正常对照组：同期于上海市东方医院体检中心的健康体检者50例，其中男22例，女28例，平均年龄53.8岁。明确fpg、肝、肾功能正常，无糖尿病史，无感染性疾病，无恶性肿瘤，无手术外伤史。

血清样本采集后保存于-20℃冰箱中备用。

二、研究方法

1、稳态法评估胰岛素抵抗

根据基础状态下的血糖水平和胰岛素水平，利用稳态模型法(homainsulinresistance,homa-ir)评价胰岛素抵抗。

homa-ir＝空腹胰岛素(1u/ml)×空腹血糖(mmol/l)/22.5。

2、仪器与材料

同实施例1

3、样本oa的检测

上述所有血清样本按照实施例1所示操作步骤集中进行检验，每批次检测均设10～100μg/ml标准曲线及空白样本、质控样本。

4、常规生化指标检测：采用德国罗氏诊断产品公司全自动生化分析仪及其配套试剂，按照临床检验常规检测上述样本血糖、胰岛素(in)、胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白(ldl)、高密度脂蛋白(hdl)、c-反应蛋白(crp)，应用日本tosohg8型糖化血红蛋白分析仪及配套试剂检测糖化血红蛋白(hba1c)。

三、统计分析

采用spss19.0软件对数据进行统计分析。数据以均数±标准差的形式呈现。组间比较使用独立样本t检验，相关分析采用pearson法，曲线下面积的比较使用z检验，显著性水平为p小于0.05。

四、结果分析

4.1受试者相关参数

4.1.1临床特征

受试者临床特征见表6，t2dm组和nafld组除平均体重较正常对照组稍大，差异有统计学意义(p<0.05)外，三组在身高、年龄及bmi上均无明显差异。nafld组alt和crea均高于正常对照组，差异有统计学意义(p<0.05)，ggt含量虽然没有统计学意义，但由于脂肪肝组ggt数据较为分散，从平均值来看，远高于正常对照组(51.08±78.56和27.13±24.77)，fpg和ins均高于健康对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。t2dm组alt、ggt、fpg和ins均高于正常对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。nafld组与t2dm组相比，后者fpg和ins明显高于前者，差异有统计学意义(p<0.05)。其中t2dm合并nafld组与不合并nafld相比，各项指标无显著差异，但前者alt、ggt、fpg及ins的均值要高于后者，提示t2dm合并nafld者糖脂代谢、肝酶水平更易恶化。

表-6受试者临床特征及生化指标检测指标

注：t2dm分不合并nafld和合并nafld两亚组，但当进行统计分析时以t2dm整体进行比较。p^*，p^#，p^$分别代表nafld与正常对照、t2dm与正常对照和nafld与t2dm之间的t检验。各指标单位分别为：身高/m，体重/kg，bmi(kg/m2)，ast(u/l)，alt(u/l)，ggt(u/l)，alp(u/l)，ldh(u/l)，crea(μmol/l)，bun(mmol/l)，ua(μmol/l)，tc(mmol/l)，tg(mmol/l)，hdl(mmol/l)，ldl(mmol/l)，fpg(mmol/l)，ins(u/ml)。

4.1.2血清oa水平及胰岛素抵抗评估

见表-7，与正常对照相比，t2dm组和nafld组oa含量明显增高，且t2dm组比nafld组oa含量高，差异有统计学意义(p<0.05)，其中t2dm组合并nafld(453.8±241.6μmol/l)比不合并nafld者(407.2±202.9μmol/l)oa含量高，但差异无统计学意义(p>0.05)。采用稳态法计算胰岛素抵抗指数ir，t2dm组homa-ir显著高于对照组(p<0.001)，但t2dm组内合并nafld和不合并nafld者homa-ir无显著差异(p<0.05)，同时nafld组homa-ir与对照组无显著性差异，从中可以发现血清oa水平较homa-ir能够反映nafld。

表-7稳态法评估胰岛素抵抗

注：a：t2dm组含有合并nafld组(n＝43)和不合并nafld组(n＝66)，相应的homa-ir为7.45±5.45和6.77±6.2，两组无统计学差异(p<0.05)。p^*，p^#，p^$分别代表nafld与正常对照、t2dm与正常对照和nafld与t2dm之间的t检验。

4.1.3.血清oa水平与胰岛素抵抗的相关性分析

以oa为因变量，以年龄、bmi、体重、fpg、ins、homa-ir为自变量进行pearson相关分析，结果见表-8所示。结果显示血清oa水平，在健康对照组中与体重和homa-ir显著性正相关，在t2dm组中与homa-ir和fpg显著性正相关，nafld组中与homa-ir、fpg和ins显著正相关。进一步分析oa与胰岛素抵抗的关系，表-9、10血清oa和homa-ir评价胰岛素抵抗的一致性达65.3％，

表-8血清oa水平与ir相关指标的相关性

表-9血清oa水平与胰岛素抵抗的相关性

表10.分别以homa-ir、oa判断ir的一致性分析

诊断一致性65.3％

4.1.4血清oa水平用于评价胰岛素抵抗和nafld的价值分析

绘制roc(receiveroperatingcharacteristic)曲线(图-4)，当对ir进行分析时，oa的auc(area-under-theconcentrationcurve)为0.689，按约登指数的大小确定oa辅助判断ir的cut-off值为235.8μmol/ml，灵敏度为70.4％，特异性为63％。当联合fpg对ir进行诊断时，auc增至0.806，且差异有统计学意义(p<0.05)。

当对nafld进行分析时，如图-5所示，oa的auc为0.738，cut-off值为250.6，灵敏度为63％，特异性为81.7％。当oa联合alt对nafld进行诊断时，aug增至0.774,且差异有统计学意义(p<0.05)。

结论：采用本发明建立的血清(血浆)oa检测试剂盒和检测方法，确定了其检测的灵敏度、准确度、重复性和线性范围。在临床初步应用中分析了259例(109例t2dm患者、100例nafld和50例正常对照)空腹血液中oa含量，发现t2dm、nafld患者血清oa水平均高于健康对照，且t2dm组高于nafld组。稳态评估法获得的homa-ir能够反映t2dm与健康对照组差别，但与nafld组无统计学差异。t2dm组血清oa水平与fpg和homa-ir呈正相关，nafld组中血清oa水平与fpg、ins和homa-ir均呈正相关。血清oa水平与homa-ir辅助诊断胰岛素抵抗的一致率达65.3％，说明血清(血浆)oa水平是一个早期可以直接判断ir的血浆标志物。此外，对于nafld辅助诊断，oa的auc为0.738，设置cut-off值为250.6μmol/l时，诊断nafld的灵敏度为63％，特异性为81.7％，当oa联合alt对nafld进行诊断时，aug增至0.774。表明动态监测血清oa、alt和homa-ir水平变化在辅助nafld的病情进展判断中具有重要的临床应用价值。

本发明的重要意义在于所公开的血清(血浆)oa超高效液相色谱串联质谱(uhplc-ms/ms)检测方法，能动态定量监测血液中oa含量变化，对于胰岛素抵抗、nafld的早期预防研究奠定了实验基础。本发明是一种快速、稳定、可靠的诊断、治疗及疗效检测油酸(oa)相关性疾病的有效工具，适用于临床常规和大样本流行病学调查。